CC BY
217
УДК 633.16:581.1:584.19
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ ПО МИКРОФЕНОЛОГИЧЕСКИМ ФАЗАМ ПРОРАСТАНИЯ
д.б.н., профессор А.С. Казакова, к.б.н. С.Ю. Козяева
Азово-Черноморская государственная Azov-Blacksea State Agroengineering
агроинженерная академия, г. Зерноград Academy, Zernograd
Изучена активность амилазы семян шести сортов ярового ячменя при прохождении ими каждой микрофенологической фазы прорастания. Выявлена общебиологическая закономерность (S-образная кривая) изменения активности амилазы по микрофенологическим фазам прорастания (МФФ ПС) семян. Сравнительная оценка сортов по изменению активности фермента в прорастающих семенах показала наличие генотипических отличий по уровню активности амилазы при достижении определенной МФФ ПС.
It is studied amylase activity of six spring barley seed sorts when passing microphenologic sprouting faze. It is shown common biologic appropriateness (S curve) of amylase activity change on microphenologic seed sprouting faze. Comparative evaluation of sorts according to ferment activity in seed sprouting showed a presence of genotypic variations in amylase activity level when achieving a definite microphenologic seed sprouting faze.
Сухие семена быстро поглощают воду, набухают и начинают прорастать. Характер и интенсивность физиологических процессов, протекающих в прорастающих семенах, зависят от активности ферментативного комплекса зерна и от условий окружающей среды. Главная особенность прорастания и его общая биохимическая направленность - распад в эндосперме и семядолях высокомолекулярных веществ до растворимых низкомолекулярных при участии влаги и под действием ферментов, прежде всего, амилолитического комплекса с высокой активностью а-амилазы [1]. Частично ферменты находятся в эндосперме или зародыше в связанном, неактивном состоянии и под влиянием набухания переходят в активное состояние [2]. Под влиянием амилазы (состоящей из а- и Р-амилазы) крахмал в эндосперме зерновки переводится в декстрины и мальтозу. Мальтоза под влиянием мальтазы расщепляется при прорастании семян до глюкозы. Одновременно с накоплением глюкозы идет образование сахарозы, которая используется растущим проростком [3].
Гидролиз крахмала в зерновках ячменя важен для пивоварения. Качество солода зависит от жизнеспособности зароды-
шей (и от синтеза гибберелловой кислоты): чем ниже всхожесть, тем хуже солод [4]. В связи с этим изучение активности амилазы на всех этапах прорастания семян ячменя является весьма актуальным.
На кафедре физиологии и химии АЧГАА были проведены исследования начальных этапов прорастания семян большого набора сортов ярового и озимого ячменя. В результате исследования морфогенеза прорастающего семени нами была предложена шкала, состоящая из восьми четких микрофенологических фаз прорастания семян (МФФ ПС), характерных для здоровых нормальных семян ячменя, которые легко визуально отличимы: 1) сухая зерновка - СЗ; 2) начало набухания - НН; 3) точка - Т; 4) корешки 1 (вилка) - К1; 5) корешки 2 (начальный рост корешков) -К2; 6) фаза корешки 3 (зрелые корешки) -К3; 7) росток - Р; 8) проросток - П [5]. Было показано, что установленные и предложенные нами МФФ ПС соответствуют определенным точкам изменения влажности зародыша.
Изучение активности амилазы проводят, как правило, на определенный день прорастания семян, а не по фазам прорастания. Так, было показано, что максимум
активности суммарных амилаз зерновой массы в процессе прорастания семян пшеницы обычно приходится на 3-6-й день [6, 7], но при этом не учитывается, что все семена находятся на разных фазах прорастания, а часть из них вообще невсхожие. Для получения общего представления и для производственных целей такой подход, возможно, и оправдан, но для проведения фундаментальных исследований физиологии и биохимии прорастания семян, а также для сравнения сортов в селекции и партий семян в семеноводстве необходимо проводить изучение не по дням, а по фазам прорастания семян. Это даст возможность зафиксировать распределение активности амилазы по МФФ ПС и установить, на какую из них приходится ее максимальное значение.
В связи с этим целью работы явилось изучение активности амилазы семян различных сортов ярового ячменя при прохождении ими каждой МФФ ПС.
Объектом исследования явились семена трех сортов ярового ячменя селекции Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко (Мамлюк, Рубикон, Стимул - 2007 года репродукции) и двух сортов ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко (г. Зерноград, Ростовская область) (Зерно-градец 770, урожай 2007 г. и Зерноградский 584, урожай 2005 г.) [8, 9]. Все эти сорта внесены в реестр селекционных достижений и допущены к использованию в Северо-Кавказском регионе.
Семена проращивали в растильнях на фильтровальной бумаге на дистиллированной воде при +20 °С согласно ГОСТ-12038-84 [10]. По мере прорастания семян отбирали для анализа семена, достигшие определенной МФФ ПС, для определения активности амилазы. Общую активность амилазы (далее - активность амилазы) определяли путем выделения амилаз раствором NaCl, инкубацию их со стандартным раствором крахмала в течение заданного
промежутка времени и колориметрическим определением негидролизованного амилазами остаточного крахмала [11]. Активность фермента выражали в мг гидролизованного крахмала на 1мл ферментной вытяжки. Полученные результаты подвергали статистической обработке с использованием программы Excel ПК.
В результате проведенной работы были выявлены общие и сортовые особенности активности амилазы при достижении семенами ярового ячменя определенной МФФ ПС при проращивании их в условиях оптимального увлажнения. На рисунке 1 и в таблице 1 представлено изменение активности амилазы семенами ярового ячменя в среднем по всем изученным сортам при прохождении ими МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения. По форме кривой и положению максимума можно судить о ходе изменения активности амилазы при прорастании семян. Полученная экспериментальная кривая имеет классическую S-образную форму, что отражает неравномерность данного процесса в ходе прорастания семян при постоянных внешних условиях и носит общебиологический характер. Каждая из МФФ ПС соответствует определенному участку этой кривой. Так, интервал от сухой зерновки до фазы точка - это лаг-фаза, от фазы точка до фазы корешки 1 наблюдается ускорение изученного процесса, от фазы корешки 1 до фазы корешки 2 - логарифмический рост активности фермента, от фазы корешки 2 до корешки 3 - торможение, после чего идет процесс старения, соответствующий фазам росток и проросток. Анализируя данное соответствие активности амилазы по МФФ ПС участкам S-образной кривой, можно сделать вывод, что МФФ ПС К2 и К3 являются ключевыми, когда активность амилазы в прорастающем семени достигает максимального значения, после чего уровень активности фермента снижается.
Рис. 1. Изменение активности амилазы по МФФ ПС ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения (среднее по шести сортам)
В сухом семени определяется некоторая активность амилазы, и она составляет ~0,025 мг/мл. Затем следует некоторое плато в активности фермента (от МФФ-Т до МФФ-К1), далее от МФФ-К1 до МФФ-К3 наблюдается возрастание активности амилазы. Максимального значения активность амилазы достигает в МФФ-К3, когда процессы роста клеток происходят наиболее активно, и составляет в среднем ~0,23 мг/мл, что в 9 раз выше, чем уровень активности данного фермента в сухом семени. Возрастание активности амилазы за период роста корешков от МФФ-К1 до МФФ-К3 имеет линейный характер, следовательно, на этот этап прорастания семени приходится основной синтез фермента и возрастание его активности.
Если значение активности амилазы в МФФ ПС К3, на которую приходится максимум, принять за 100% и оценить актив-
ность фермента в другие МФФ ПС в процентах от его максимального значения, то выявляется дополнительная информация о ходе данного процесса (табл. 1). За период формирования и роста корешков от МФФ-К1 до МФФ-К3 активность фермента возрастает в 5,6 раза, а в МФФ-К2 она составляет 61,5% от максимума. Когда появляется росток, активность фермента падает на 13,5%, а при становлении проростка она снижается на 33,2%. Если оценивать активность амилазы по «корешкам в целом», как это принято в настоящее время, то в анализ попадут в неконтролируемом соотношении семена, находящиеся на разных МФФ ПС, и результаты анализа будут несравнимыми и недостоверными. Следовательно, проводить сравнительный анализ активности фермента надо в МФФ-К2, когда его активность составляет примерно половину от максимума.
Таблица 1
Изменение активности амилазы по МФФ ПС в среднем по шести сортам (активность фермента в МФФПС-К3 принята за 100%)
МФФ ПС Сухая зерновка Точка Корешки 1 Корешки 2 Корешки 3 Росток Пророс- ток
Активность амилазы, % от К3 10,1 11,3 18 61,5 100 86,5 66,8
Сравнительная оценка сортов по из- личие генотипических отличий по уровню менению активности амилазы в прорас- активности фермента при достижении оп-тающих семенах позволила установить на- ределенной МФФ ПС (рис. 2).
Л*
£
— Мамлюк
— Рубикон
— Зерноградец 770
^ £ МФФ ПС
<8
р9
Л
р°
Стимул
Зерноградский 584
Рис. 2. Активность амилазы в прорастающих семенах различных сортов ярового ячменя по МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения
В сухой зерновке сорта ярового ячменя Рубикон, Стимул, Зерноградец 770 и Зерноградский 584 имеют близкие значения активности амилазы; исключение составляет сорт Мамлюк, который характеризуется более высоким уровнем данного показателя. Начиная с МФФ-Т, наиболее устойчивый к засухе сорт Зерноградец 770 имеет наибольшую активность амилазы в сравнении с другими сортами, что более наглядно прослеживается в МФФ-К2 и МФФ-К3, которые являются основой для дальнейшего развития полноценного проростка.
Коэффициент вариации активности амилазы в сухом семени в среднем по изученным сортам составляет 36,3% (табл. 2). Далее наблюдается уменьшение различий в активности амилазы между сортами, коэф-
фициент вариации в МФФ-Т и МФФ-К1 составляет 25,5% и 18,9%, соответственно. В МФФ-К2 между изучаемыми сортами наблюдается более высокий разброс значений по уровню амилазы, коэффициент вариации при этом составляет 42,4%. Вариабельность значений активности фермента в МФФ-К3, когда активность фермента достигает наивысших значений, минимальна, что свидетельствует о единообразии процесса гидролиза крахмала в семенах ярового ячменя в точке максимальной активности фермента. Сорта различаются между собой по скорости нарастания активности фермента. Данный результат ещё раз свидетельствует о целесообразности проведения сравнительных исследований активности амилазы в МФФ-К2.
Таблица 2
Коэффициент вариации активности амилазы по МФФ ПС ярового ячменя
МФФ ПС Сухая зерновка Точка Корешки 1 Корешки 2 Корешки 3 Росток Пророс- ток
V, % 36,3 25,5 18,9 42,4 6,3 8,0 22,3
Таким образом, изучение активности фермента по предложенным нами МФФ ПС ярового ячменя позволило выявить общебиологическую закономерность в изме-
нении активности фермента при прорастании семян: общая активность амилазы возрастает при прорастании семян и достигает максимальных значений в МФФ-К3, а
затем снижается с появлением ростка и становлением проростка. В сухих семенах присутствует амилаза в активной форме, что дает возможность снабжать зародыш семени субстратом для получения энергии до запуска синтеза амилазы de novo; оценивая активность амилазы в сухих семенах, можно характеризовать процессы форми-
рования зародыша на материнском растении. Сравнительную оценку сортов и партий семян ярового ячменя целесообразно проводить, оценивая активность амилазы в МФФ-К2, когда активность фермента составляет примерно половину от максимальных значений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Костин В.И. Физиологический механизм воздействия пектина и микроэлементов при прорастании семян зерновых культур / В.И. Костин, В.А. Исайчев, О.Г. Музурова // Вестник РАСХН. - 2006. - № 4 (июль-август). - С. 38-39.
2. Якушкина Н.И. Физиология растений: учеб. для студентов вузов, обучающихся по специальности 032400 «Биология» / Н.И. Якушкина, Е.Ю. Бахтенко. - М.: Гуманитар. изд. центр ВЛАДОС, 2005. - С. 321.
3. Кретович В.Л. Основы биохимии растений / В.Л. Кретович- М.: Высшая школа, 1971. - С. 81, 87.
4. Алехина Н.Д. Физиология растений / Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко и др.; под ред. И.П. Ермакова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - С. 450.
5. Казакова А.С. Шкала микрофенологических фаз прорастания семян ярового ячменя / А.С. Казакова, С.Ю. Козяева, М.В. Гайдаш // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - № 5.
6. Гельманов М.А., Фурсов О.В., Францев А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений / М.А. Гельманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев. - Алма-Ата, 1981. - 92 с.
7. Livesley M.A. a-Amylase izoenzymes in aged wheat aleurone layers // Biochem. Soc. Trans. 1991. V 19. № 4. P. 360-364.
8. Шевцов В.М. Сорта ярового ячменя селекции ГНУ «Краснодарский НИИСХ» и ФГОУ ВПО «Азово-Черноморская государственная агроинженерная академия» / В.М. Шевцов, П.П. Васюков, А.С. Ерешко, Ю.А. Грунцев, Н.В. Серкин. - Зерноград: ФГОУ ВПО АЧГАА, 2003. - 8 с.
9. Сорта и гибриды зерновых и кормовых культур Всероссийского НИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко. - Ростов н/Д, 2008. - С. 47-50.
10. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести: ГОСТ 12038-84; Введен 01.07.86. М.: ИПК Изд-во стандартов. 2004. - С. 34-38.
11 . Третьяков Н.Н. Практикум по физиологии растений / Н.Н. Третьяков, Л.А. Па-ничкин, М.Н. Кондратьев и др. - М.: КолосС, 2003. - С. 172-174.
