CC BY
55
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 163-166.
УДК 57.088:534.838.7(045)
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УЛЬТРАЗВУКА НА ОТДЕЛЬНЫЕ СТАДИИ В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO. III. БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ СОИ
© А.С. Буянова', М.Э. Ламберова
Бийский технологический институт (филиал) Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова, ул. Трофимова, 27, Бийск, Алтайский край, 659305, (Россия), e-mail: alenabuyanova@mail.ru
В работе эффективность биотехнологического метода улучшения сортов сои была увеличена за счет ультразвуковой обработки аппаратом «Волна»-0,4/22-М, Подобраны оптимальные режимы ультразвуковой обработки бобов сои сорта «Алтом» при экстракции белковой фракции на стадии образования каллусной биомассы сои in vitro при определении активности ее ферментов и массовой концентрации аминокислот,
В процессе экстракции из бобов и каллуса сои с помощью ультразвука можно регулировать общее содержание белка и аминокислот, активность ферментов в выделенной белковой фракции, Кроме того, за счет ультразвуковой обработки исходных эксплантов сои при введении в культуру клеток и тканей in vitro и при размножении полученной каллусной биомассы можно регулировать биосинтетическую активность по накоплению белков и улучшать их качество,
Ключевые слова: белковая фракция, каллусная биомасса сои in vitro, ультразвук, ферменты.
Введение
Алтайский край не относится к традиционным регионам для возделывания сои, поэтому при улучшении сортов сои биотехнологическими методами актуальным является интенсификация накопления в культуре клеток и тканей in vitro физиологически важных компонентов белковой фракции [1].
Белок сои сбалансирован по аминокислотному составу, в отличие от других растительных белков, и применяется в различных видах пищи и кормов. В белковой фракции из бобов сои проявляют активность такие ферменты, как амилаза, каталаза, уреаза [2].
Известно, что ультразвук способствует экстрагированию из сырья биологически активных веществ [3, 4].
В зависимости от объекта и цели применения ультразвука необходимо подбирать режимы обработки, так как компоненты белковой фракции могут при этом разрушаться или снижать свою активность. Такая оценка осуществлялась при проведении экстракции из соевых бобов сорта «Алтом». Важно было также установить, как эти режимы будут влиять на синтез в каллусной биомассе сои in vitro веществ белковой фракции, в том числе активность ферментов сои. Поэтому в ходе культивирования клеточную культуру сои in vitro подвергали воздействию ультразвука в различных режимах, затем из полученной биомассы извлекали белковую фракцию. В данных экстрактах определяли те же показатели, что и в соответствующих вытяжках из соевых бобов, которые служили контролем.
БуяноваАлена Сергеевна аспирант, Экспериментальная часть
тел: (3854) 43-53-01, e-mail: alenabuyanova@mail.ru
Ламберова Марина Эдуардовна - доцент кафедры Количественное определение белка. Содержа-
биотехнологии, кандидат химических наук, ние белка в бобах и культуре клеток и тканей сои
тел: (3854) 43-53-°1, e-mail: mlamberova@mail,ru in vitro определяли по методу Лоури [5].
* Автор, с которым следует вести переписку,
При этом оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре «Shimatzy AA-6300» при 750 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см.
Содержание белка в испытуемой пробе устанавливали по калибровочной кривой.
Количественное определение каталазы. Активность каталазы в испытуемом материале определяли по количеству неразложившейся Н202, оттитровывая ее 0,1М раствором KMnO4. Реакция протекает по следующему уравнению 1 [5]:
5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 = 5O2 + 2KHSO4 + 8H2O + 2MnSO4.
Определение аминокислот. Содержание аминокислот в бобах и культуре клеток и тканей сои in vitro определяли формолтитрованием по методу Сьоренсона [5]. Метод применяется для определения карбоксильных групп аминокислот, титруемых раствором щелочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом. При этом можно одновременно определить и количество а-аминогрупп, так как количество карбоксильных групп эквивалентно количеству а-аминогрупп, связанных с формальдегидом.
Обсуждениерезультатов
Влияние ультразвука на содержание общего белка в водных экстрактах бобов и каллуса сои. Для приготовления экстрактов использовали бобы и каллус сои сорта «Алтом», полученный in vitro, с УЗ-обработкой и без нее. В качестве экстрагента применяли дистиллированную воду. Для водных растворов варьировали гидромодуль - 1 : 20; 1 : 40; 1 : 60; 1 : 80; 1 : 100. Также применяли обработку ультразвуком, варьируя мощность и длительность воздействия. Результаты приведены в сравнительной диаграмме на рисунке 1.
1000-/'
100
я
9
N
й-
О
О
10
□ Бобы
□ Обработка эксплантов химическая
□ Обработка эксплантов ультразв уковая
Вариант
Рис. 1. Зависимость содержания общего белка в экстрактах из бобов и каллуса сои от гидромодуля и способа обработки исходного экспланта.
1 - гидромодуль: соевые бобы - 1 : 20; каллус сои после химической
и УЗ-обработки эксплантов - 1 : 20;
2 - Режим ультразвука: соевые бобы -1 мин, 20 Вт; каллус сои после химической обработки эксплантов -1 мин, 60 Вт; каллус сои после ультразвуковой обработки эксплантов -
1 мин, 20 Вт
1
2
Из диаграммы видно, что максимальное содержание общего белка в экстрактах из бобов сои наблюдается при режиме УЗ-обработки 20 Вт 1 мин; из соевого каллуса после исходной обработки в следующих условиях: химическая и УЗ-обработка эксплантов - 60 Вт, 1 мин; обработка эксплантов только ультразвуком - 20 Вт, 1 мин.
Влияние ультразвука на содержание аминокислот в водном экстракте из бобов и каллуса сои. На стадии приготовления вытяжки проводили обработку ультразвуком мощностью 100, 80, 60, 40 и 20 Вт и длительностью 2, 4, 6, 8 и 10 мин. Экстрагирование проводили при постоянном перемешивании в течение 1 ч при температуре 30 °С. По окончании экстрагирования раствор отфильтровали на складчатом фильтре. Фильтрат использовали для определения содержания аминокислот. Полученные результаты представлены на рисунке 2.
Полученная сравнительная диаграмма (рис. 2) показывает отсутствие свободных аминокислот в водном экстракте из бобов и каллуса сои. Поскольку общее содержание белка также уменьшалось (рис. 1), можно предположить, что под действием ультразвука соевый белок разрушается до пептидов, т.е. на более крупные фрагменты молекулы, нежели аминокислоты, либо происходит полное разрушение аминокислот.
Влияниеультразвука на активность каталазы в экстрактах из бобов и каллуса сои. На стадии приготовления вытяжки общего белка применяли обработку ультразвуком с вариацией мощности и длительности воздействия, оценивая изменение активности каталазы в белковой вытяжке. Результаты приведены в сравнительной диаграмме на рисунке 3.
Из диаграммы видно, что при ультразвуковой обработке соевых бобов мощностью 100 Вт активность каталазы в белковой вытяжке повышается при увеличении длительности воздействия ультразвука до 7 мин. При мощности ультразвука 40 Вт активность каталазы в водном экстракте из соевого каллуса повышается с увеличением длительности воздействия ультразвуком и достигает максимального и постоянного значения после 8 мин обработки.
0,0012-/'" 0,0010,00080,00060,00040,0002 0
□ Без обработки ультразвуком
□ С применением ультразвука
§
13
и
А
S-
О
О
и
ш
к
Ё
<
0,25
0,2-
0,15
0,1
0,05
0
Бобы сои
Каллус сои
2 3
Вариант
0,23 4 0,199
✓ 0,1 S 1 У
0,126
1 1
Рис. 2. Зависимость массовой концентрации аминокислот в водных экстрактах из бобов и каллуса сои от УЗ-воздействия
Рис. 3. Зависимость активности каталазы в экстрактах из бобов и каллусной биомассы сои отУЗ-воздействия: бобы сои: 1 - 100 Вт, 1 мин;
2 - 100 Вт, 7 мин; каллусная биомасса сои:
3 - 40 Вт, 1 мин: 4 - 40 Вт, 8 мин
1
4
Выводы
1. Определены оптимальные режимы выделения белковой фракции: максимальное содержание общего белка в экстрактах из бобов и каллуса сои наблюдается при гидромодуле 1 : 20 и УЗ-обработке мощностью 20 Вт в течение 1 мин.
2. Исследовано влияние ультразвука на массовую концентрацию аминокислот в водном экстракте бобов и каллуса сои без УЗ-воздействия: бобы - 1,19*10-3 мг/мл; каллус - 0,08*10-3 мг/мл.
3. После УЗ-воздействия в водном экстракте из бобов и каллуса сои свободных аминокислот не выявлено.
4. Исследовано влияние ультразвука на активность каталазы в вытяжке общего белка из бобов (0,23 мг/г при 80 Вт, 7 мин), а также из каллуса сои (0,20 мг/г при 40 Вт, 1 мин).
Таким образом, в процессе экстракции из бобов и каллуса сои с помощью ультразвука можно регулировать общее содержание белка и аминокислот, активность ферментов в выделенной белковой фракции. Кроме того, за счет УЗ-обработки исходных эксплантов сои при введении в культуру клеток и тканей in vitro и при размножении полученной каллусной биомассы можно регулировать биосинтетическую активность по накоплению белков и улучшать их качество.
Список литературы
1, Ламберова М.Э, Маркина Е.П., Ламберова А.А., Косолапова А.С. Исследование влияния ультразвука на эффективность стерилизации эксплантов сои, скорость роста и содержание общего белка и лигнина в культуре клеток и тканей in vitro // Ползуновский вестник, 2006, №2-2, С. 71-73,
2, Доценко С.М., Тильба В.А., Иванов С.А., Абрамкина Е.А. Проблема дефицита белка и соя // Пищевая промышленность. 2002, №8, С. 38-40,
3, Косолапова А.С., Ламберова М.Э, Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. I, Стерилизация эксплантов // Химия растительного сырья, 2010, №2, С. 179-180,
4, Косолапова А.С., Ламберова М.Э, Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro, II, Образование каллуса и его размножение // Химия растительного сырья, 2010, №3, С. 189-190,
5, Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Researching of Ultrasonic Influence on Callus Formation, on Maintance of the General Protein, on Enzymes Activity and Ingibitor of Tripsin in Extracts from the Soybean of the Grade «Altom» and Plant Cells Growth of Cukture in vitro // International Workshops and Tutorials on Electron Devices and Materials, EDM’2008: Workshop Proceedings, Novosibirsk, 2008, Pp. 250-255,
6, Гамаюрова B.C., Зиновьева M.E, Ферменты: Лабораторный практикум, СПб., 2011, 270 с.
Поступило в редакцию 29 апреля 2011 г.
После переработки 12 августа 2012 г.
Buyanova AS.*, Lamberova M.E. RESEARCH OF ULTRASONIC INFLUENCE ON SEPARATE STAGES IN TECHNOLOGY OF CELL AND TISSUE CULTURE IN VITRO. III. PROTEINS BIOSYNTHESIS OF THE SOYA
Biysk institute of technology (branch) of The Altay state technical university of I.I. Polzunova, st. Trofimova, 27, Byisk,
659305, Altay (Russia), e-mail: alenabuyanova@mail.ru, mlamberova@yandex.ru
At improvement of soya grades by biotechnological methods the accumulation intensification in cell and tissue culture in vitro physiologically important components of albuminous fraction is actual.
Soya Protein is balanced on amino acid structure, unlike other vegetative proteins and is applied in various kinds of food and forages. In albuminous fraction from soybeans show activity enzymes:amilasa, a catalase, ureasa.
In the given work efficiency of a method has been increased at the expense of ultrasonic processing by device «Wave»-0,4/22-M. Optimum modes of ultrasonic processing of a soybeans of a grade «Altom» have been picked up at extraction of albuminous fraction, at a formation stage a soya callus biomass in vitro at activity definition of its enzymes and mass concentration of amino acids.
In extraction process from beans and a soya callus biomass by means of ultrasonic it is possible to regulate the general maintenance of protein and amino acids, activity of enzymes in the allocated albuminous fraction. Besides, at the expense of ultrasonic processing initial explants of a soya at introduction in culture of cages and fabrics in vitro and at reproduction received callus biomass may regulate of their biosynthetic activity on accumulation of proteins and improve of their quality.
Keywords: albuminous fraction, a soya callus biomass in vitro, ultrasound, enzymes.
References
1. Lamberova M.E, Markina E.P., Lamberova A.A., Kosolapova A.S. Polzunovskii vestnik, 2006, no. 2-2, pp. 71-73. (in. Russ.)
2. Dotsenko S.M., Til'ba V.A., Ivanov S.A., Abramkina E.A. Pishchevaia promyshlennost’, 2002, no. 8, pp. 38-40. (in. Russ.)
3. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2010, no. 2, pp. 179-180. (in. Russ.)
4. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2010, no. 3, pp. 189-190. (in. Russ.)
5. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. International Workshops and Tutorials on Electron Devices and Materials, EDM’2008: Workshop Proceedings. Novosibirsk, 2008, pp. 250-255.
6. Gamaiurova V.S., Zinov'eva M.E. Fermenty: Laboratornyi praktikum. [Enzymes: Laboratory workshop]. St. Petersburg, 2011, 270 p. (in. Russ.)
Received April 29, 2011 Revised August 12, 2012
* Corresponding autor,
