CC BY
116
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 81-87.
УДК 547.595.3
ПОИСКСЫРЬЯ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ шикимовой кислоты
© Д.В. Бочков1', С.В. Сысолятин1, А.И. Калашников1, И.А. Сурмачёва1, А.А. Ламберова2,
А.С. БуяновО2, М.Э. Ламберова2
1 Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения РАН (ИПХЭТ СО РАН), ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322 (Россия), e-mai: bochkovipcet@bk.ru
2Бийский технологический институт (филиал) Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова, ул. Трофимова, 27, Бийск 659305 (Россия)
Исследовано содержание шикимовой кислоты в вегетативных частях в ряде растений, произрастающих в Алтайском крае. Наибольшее содержание шикимовой кислоты (около 1,5%) найдено в хвое сосны обыкновенной. При культивировании клеток гречихи in vitro на среде, содержащей глифосат, происходит накопление шикимовой кислоты. Лучшие результаты были получены при культивировании эксплантов гречихи in vitro на питательной среде МС (среда Мурасиге - Скуга), в присутствии 0,5*10-3 мг/л глифосата,
Ключевые слова: шикимовая кислота, шикиматный путь, хвоя, глифосат, сосна обыкновенная, гречиха обыкновенная,
Введение
В предыдущей статье были проанализированы сухие органы растений на содержание шикимовой кислоты [1]. В настоящей публикации мы приводим результаты, полученные в ходе анализа растительного материала на наличие шикимовой кислоты в различные периоды вегетации.
Природное органическое соединение шикимовая кислота (3,4,5-тригидрокси-1-циклогексен-1-карбоновой кислоты) - важное промежуточное звено в биосинтезе лигнина [2], ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) и большинства алкалоидов растений и микроорганизмов [3-5]. ---------------------------------------------- Можно отметить, что шикимовая кислота
БочкоеДенисВладимироеич - научный сотрудник, широко применяется в качестве реагента в органи-
кандидат биологических наук, тел,: (3854) 30-10-58,
ческом синтезе как в органической химии, так и в
e-mail: bochkovdv@bk.ru
„ „ фармакологии. Описан способ получения фенола из
Сысолятин СергеиВикторович - директор, доктор
химических наук, тел.: (3854) 3Ы3-09, шикимовой кислоты [13]. Так, китайскими учеными
e-mail: admin@ipcet.ru синтезировано соединение (-)-зейленон, которое
Калашников Александр Иванович - старший научный активно используют в качестве препарата при хи-
сотрудни^ кандидатхимических нау^ миотерапии раковых заболеваний [7], а также из-
тел.: (3854) 30-40-58, e-mail: kchem60@mail.ru Сурмачева Ирина Анатольевна - младший научный
сотрудник, тел: (3854) 30-10-58,
e-mail: surmacheva_irina@mail.ru
Ламберова Анна Александровна - аспирант кафедры
вестно о синтезе монопальмитилоксишикимовои кислоты, обладающей антикоагулянтной активностью и способной снижать свертываемость крови при внутримышечном введении [8]. Группой китай-
биотехнологии, e-mail: ane4ka@rambler.ru ских ученых синтезировано производное шикимо-
Буянова Алена Сергеевна - аспирант кафедры вой кислоты - триацетилшикимовая кислота, обла-
биотехнологии, e-mail: alenabuyanova@mail.ru дающее антикоагулянтной и антитромботической
ЛамбероваМаринаЭдуардовна - доцент кафедры активностью [9]. Шикимовая кислота в основном
биотехнологии, кандидат химических наук,
л-, с m -1 1 и гл -1 применяется в качестве исходного вещества в протел.: (3854) 43-53-01, e-mail: mlamberova@mail.ru r г
* Автор, с которым следует вести переписку,
мышленном синтезе противовирусного препарата осельтамивира фосфата (тамифлю) [3, 6]. Это лекарственное средство, по данным Всемирной организации здравоохранения, наряду с замавиром, является основным средством для лечения от вируса гриппа H5N1 («Птичий грипп»).
Производные шикимовой кислоты представляют большой интерес для сельского хозяйства, поскольку их используют в качестве гербицидов и антибактериальных средств, так как они могут блокировать шикиматный путь без негативного эффекта для млекопитающих [10, 11].
Существует множество способов получения шикимовой кислоты, в частности, быстро развиваются микробиологические методы выделения шикимовой кислоты из ряда бактерий и простейших грибов [12]. Но, тем ни менее, на сегодняшний день основную часть шикимовой кислоты извлекают из растительного сырья, в основном из плодов бадьяна анисового (Illicium anisatum), произрастающего в четырех провинциях Китая [14]. Частично потребность в шикимовой кислоте покрывается биохимическим синтезом с использованием штаммов-сверхпродуцентов E. coli [15].
Таким образом, шикимовая кислота используется в качестве реагента в органическом синтезе, как в областях фундаментальной науки, так и в прикладных областях органической химии и медицины, в частности для получения различных препаратов для медицины, сельского хозяйства и других отраслей.
Цель данной работы - поиск сырья для выделения шикимовой кислоты.
Экспериментальная часть
Объекты исследования. В качестве объектов исследования взяты растения, широко распространённые на всей территории Российской Федерации. Сбор растительного материала осуществлялся в городе Бийске Алтайского края. Список исследованных растений приведен в таблице 1.
Метод экстракции растительного сырья. Части растений (табл. 1) или культуры клеток (табл. 2) в течение 30-60 мин после сбора подвергались измельчению на гомогенизаторе шнеково-ножевого типа и экстрагировались шестикратным количеством (по весу) 70%-ного водного раствора этанола. Экстракцию проводили в круглодонной колбе с мешалкой в течение 4-6 ч при температуре 80-85 °С. Экстракт центрифугировали (15 мин при 3000 g) или фильтровали через обеззоленный бумажный фильтр. Фильтрат концентрировали на роторном испарителе RV-10 под вакуумом от -0,7 до -1 Bar и температуре 40-70 °С. Полученную вязкую массу промывали в пятикратном количестве (по весу) ацетона на магнитной мешалке при 50 °С в течение 30 мин при 5000 об./мин. Суспензию фильтровали через обеззоленный бумажный фильтр, не растворившийся в ацетоне остаток растворяли до полного растворения (около 40 мин) при кипении в трехкратном количестве (по весу) дистиллированной воды и постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Охлажденный до комнатной температуры фильтрат анализировали на наличие шикимовой кислоты. Шикимовую кислоту идентифицировали методом ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии.
Исследование культур клеток и тканей гречихи. Стерилизованные 70%-ным этанолом экспланты гречихи помещали на питательную среду Мурасиге - Скуга (МС), содержащую 0,5 мг/л кинетина и 2,0 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Культивирование проводили в термостате при температуре (25±2) °С в темноте от 4 до 7 суток. После инициации каллусообразования разбухшие экспланты пересаживали на питательную среду МС с глифосатом для накопления шикимовой кислоты. Среда содержала в своем составе: кинетина - 0,5 мг/л; 2,4-Д - 2,0 мг/л; глифосата от 0,25 до 0,75 мг/л. Культивирование проводили в термостате при температуре (25±2) °С в темноте в течение 4-16 суток [16-19].
Анализ полученных образцов методом ВЭЖХ. Анализ проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200, на колонке Zorbax Bonus RP (C18) 2,1*150 мм с размером частиц 5 мкм при 25 °С в режиме градиентного элюирования. Режим элюирования: 0,2%-ный раствор фосфорной кислоты (растворитель А); ацетонитрил (растворитель Б) 4 мин удерживали 100% А, а затем в течение 6 мин линейно до 100% Б. Скорость потока подвижной фазы - 0,25 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны X = 213 нм. Пик, соответствующий шикимовой кислоте, регистрируется на третьей минуте.
Содержание шикимовой кислоты в образцах определяли методом абсолютного градиента по методу внешнего стандарта с использованием точных навесок стандарта шикимовой кислоты (содержание основного вещества - не менее 99,0%). Стандартный образец шикимовой кислоты был получен перекристаллизацией из технической шикимовой кислоты (производство Китай) со спектральными характеристиками (ИК, ЯМР, ВЭЖХ), углом вращения и точкой плавления, соответствующими литературным данным [3].
Калибровку метода проводили в диапазоне концентраций 0,01-1,00 мг/мл. Содержание шикимовой кислоты в пробе, взятой на анализ, пересчитывали на массу сухого сырья.
Хромато-масс-спектральный анализ шикимовой кислоты. Для проведения хромато-масс-спектрального анализа использовали систему жидкостной хроматографии Agilent 1200, оснащенную 1-квадрупольным масс-селективным детектором (G 1956 B) с многорежимным источником ионов. Для ионизации образца использовали метод ионизации - электроспрей в режиме отрицательных ионов. Ионизацию проводили с применением следующих параметров: поток газа-осушителя (азота) - 5 л/мин, температура газа-осушителя - 250 “С, испарительной камеры - 150 “С, напряжение на капилляре - 2000 В, напряжение на фрагменторе - 100 В. Разделение проводили на колонке Zorbax SB-C1S размером 2,1*150 мм с частицами размером 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали метанол - 0,2%-ный водный раствор уксусной кислоты в градиентном режиме (3 мин удерживали 3% метанола, в течение 7 мин линейно повышая содержание метанола до 100% при скорости потока 0,25 мл/мин). Шикимовая кислота была подтверждена в режиме регистрации индивидуальных ионов ([М-Н] = 173,1).
Содержание шикимовой кислоты анализировали в пробах по методу внешнего стандарта с использованием точных навесок стандарта шикимовой кислоты. Калибровку метода проводили в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мг/мл.
Обсуждениерезультатов
Для экспериментов по выделению шикимовой кислоты были взяты свежесобранные части растений. Их список и полученные результаты приведены в таблице 1.
Литературные данные свидетельствуют о том, что содержание шикимовой кислоты в ряде растений Северной Америки является достаточным для ее промышленного выделения [20]. В связи с этим было бы интересно исследовать эти растения, произрастающие в Сибирском регионе.
Методом ВЭЖХ наибольшее содержание шикимовой кислоты выявлено в хвое сосны обыкновенной (Pinus sylvestris), что подтверждает результаты, полученные в ходе анализа экстрактов зимней хвои сосны [1]. При этом содержание шикимовой кислоты в летней и зимней хвое сосны, впрочем, как и пихты и ели обыкновенной, различаются незначительно. Высокое содержание шикимовой кислоты в хвое возможно связано с интенсивным синтезом полициклических соединений - компонентов смолы. Значительное количество шикимовой кислоты четко фиксируется также в надземной части до распускания папоротника орляка (Pteridium oquilinum), что, как мы предполагаем, связано с высоким содержанием алкалоидов и полициклических соединений вообще в папоротнике, синтез которых осуществляется непосредственно через шикимовую кислоту [21]. Шикимовая кислота найдена также в семенах клена американского (Acer negundo) и цветах и молодых побегах смородины золотистой (Ribes aureum). В предыдущей статье исследованные нами растения (зверобой лекарственный, пижма обыкновенная) совсем не содержали шикимовой кислоты в корнях, но имели ее невысокое содержание в сухих вегетативных частях, при этом ее следов не было найдено в вегетативных частях во время роста растения. Это связано, скорее всего, с нарушениями технологии сушки сырья, что привело к его частичной ферментации и, как следствие, к незначительному выделению во внешнюю среду шикимовой кислоты микробами [1].
Несмотря на то, что нами получены удовлетворительные результаты по выделению шикимовой кислоты из растительного сырья, в частности из хвои деревьев хвойных пород, наши результаты гораздо ниже результатов, полученных Бхаратхи и Йан-Хонгом [1, 20]. Поэтому нами была исследована возможность накопления шикимовой кислоты в растениях при выращивании их на средах с добавлением ингибитора фермента 5 -енолпирувилшикимат-3 -фосфат-синтазы.
Возможность получения шикимовой кислоты была показана при селекция in vitro глифосатной устойчивости у высших растений. Накопление шикимовой кислоты происходит за счет способности глифо-сата ингибировать фермент шикиматного пути 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазу (EPSPS), что приводит к значительному уменьшению ароматических аминокислот, которое сопровождалось измене-нииями белкового обмена и метаболизма вторичных ароматических соединений [22].
Растительный материал - эмбриогенные клеточные суспензии культуры люцерны посевной (Medicago Sativa) - был инициирован и поддерживался на среде BL, содержащие 5,0 мМ 2,4-Д и 1,0 мМ кинетина. Рост ингибирующих концентраций глифосата был оценен в предварительных экспериментах и составил 1,5-2,0 мМ. Культивирование проводили в темноте при 26 “С [22].
Таблица 1. Содержание шикимовой кислоты в исследованных образцах растений
Растения Исследуемая часть Содержание шикимовой кислоты (% на а.с.с.)
Чистотел большой (Chelidonium majus) вся надземная часть с цветами 0,06S
Смородина золотистая (Ribes aureum) цветы и молодые побеги 1,27
Папоротник орляк (Pteridium oquilinum) надземная часть до распускания 1,16
надземная часть в стадии спороношения 0,034
Тополь черный (Populus nigra) листья 0,22
Клен американский (Acer negundo) семена 1,44
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) летняя хвоя 1,43
зимняя хвоя 1,54
Ель обыкновенная (Picea abies) летняя хвоя 0,94
зимняя хвоя 0,S5
Пихта сибирская (Abies Sibirica) летняя хвоя 0,5S
зимняя хвоя 0,53
Картофель (Solanum tuberosum) незрелые ягоды 0,0S3
Полынь горькая (Artemisia absinthium) вся надземная часть с цветами < 0,001
Бузина обыкновенная (Sambucus racemosa) зеленые плоды < 0,001
Горох посевной (Pisum sativum) листья > 0,015*
стебли < 0,001*
Пшеница твердая (Triticum durum) листья < 0,001*
стебли < 0,001*
Гречиха обыкновенная (Fagopyrum esculentum) листья < 0,001*
стебли < 0,001*
Синяк обыкновенный (Echium vulgare) листья с цветами < 0,001
Донник желтый (Melilotus officinalis) вся надземная часть с цветами < 0,001
Орех маньчжурский (Juglans mandshurica) листья < 0,001
кожура плодов < 0,001
Пижма обыкновенная (Tanacetum vulgare) цветы < 0,001
Зверобой лекарственный (Hypericumperforatum.) вся надземная часть с цветами < 0,001
Примечание, * на массу влажного сырья,
Воздействие глифосата привело к снижению EPSPS деятельности в клеточных линиях более чем на 50%. В контрольном каллусе, без обработки глифосатом, накопление шикимовой кислоты не наблюдалось. Также контроль клеточных линий показал, что после воздействия глифосатом происходит снижение содержания свободных фенилаланина и тирозина в четыре раза [22].
Нами не установлено наличие шикимовой кислоты в органах гречихи обыкновенной, но, поскольку культура клеток гречихи легко поддается культивированию на различных средах in vitro, она является хорошим объектом для проведения исследований.
Результаты ВЭЖХ экстрактов культур клеток и тканей приведены в таблице 2.
В ходе проведения экспериментов шикимовая кислота была обнаружена в экстракте культуры клеток гречихи, выращенной in vitro на питательной среде МС в течение 4-7 суток (рис.).
Таблица 2. Зависимость содержания шикимовой кислоты от длительности культивирования культуры клеток гречихи in vitro
Длительность культивирования, сут Содержание шикимовой кислоты (% на а.с.с,)
На питательной среде МС 4 0,0495
5 -
10 -
16 -
На питательной среде МС 4 -
с глифосатом 5 -
10 0,1473
16 0,2934
Примечание, «-» - не обнаружено,
mAU л_
80
70 60 5040 -
зон 20 -4 ю -
О -Г
±____
т ' I ' I ' ' ' Г ’ 1 1 I 1 ' ' I '---1--1--1--!--1--1--?--'--'--!--1--'-
_____о 2 4 6 8 10 12 14 min
Хроматограмма спиртового экстракта из культуры клеток in vitro гречихи, культивированной на среде МС в течение 4 суток
В остальных экстрактах из культур клеток гречихи in vitro шикимовая кислота не была обнаружена. В итоге было установлено, что при культивировании эксплантов гречихи на питательной среде МС in vitro накопление шикимовой кислоты происходит в течение первых четырех суток, после чего она метаболизи-руется в клетке.
Культивирование на среде МС с глифосатом показало, что с возрастанием его длительности повышается содержание шикимовой кислоты в экстрактах из культуры клеток гречихи in vitro. Лучшим вариантом для накопления шикимовой кислоты является культивирование в течение 16 суток эксплантов гречихи на питательной среде МС, содержащей 0,5* 10-3 мг/л глифосата.
Выводы
Таким образом, в ходе проведенных экспериментов проанализирован ряд растений, широко распространенных в Российской Федерации, на содержание в них шикимовой кислоты в период вегетации.
Наибольшее количество шикимовой кислоты обнаружено в экстрактах зимней и летней хвои сосны обыкнов енной
Показана возможность накопления шикимовой кислоты в культуре клеток гречихи in vitro, размножаемой круглый год в необходимом количестве.
Список литературы
1. Бочков Д.В., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Сурмачёва И.А. Исследование содержания шикимовой кислоты в некоторых растениях Алтайского края // Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 119-123.
2. Brown S.A. Biochemistry of Phenolic Compounds. N.-Y., Academic Press Inc., 1964. 361 p.
3. Bradley D. Star role for bacteria in controlling flu pandemic? // Nature Reviews Drug Discovery. 2005. N4. Pp. 945-946.
4. Enrich L.B., Scheuermann M.L., Mohadjer A, Matthias K.R., Eller C.F., Newman M.S., Fujinaka M., Poon T. Liquid-ambar styraciflua: a renewable source of shikimic acid // Tetrahedron Lett. 2008. Vol. 49. Pp. 2503-2505.
5. Lingens F. The Biosynthesis of Aromatic Amino Acids and its Regulation // Angewandte Chemie International Edition. 2003. Vol. 7. N5. Pp. 350-360.
6. Patent 006130354A (US). Process for the preparation of shikimic acid its derivatives / H.-J. Mair / 2000.
7. Zhang Y., Liu A., Z. Guang Y.E., Lin J., L. Zhen XU, and Shi Lin Yang. New Approach to the Total Synthesis of (-)-Zeylenone from Shikimic Acid // Chem. Pharm. Bull. 2006. Vol. 54, N10. Pp. 1459-1461.
8. Luhong T., Hong X., Yang S., Liying Q., Dongqun C., Chao D., Wei C. Monopalmityloxy Shikimic Acid: Enzymatic Synthesis and Anticoagulation Activity Evaluation // Appl. Biochem. Biotechnology. 2009. Vol. 158. Pp. 408-415.
9. Huang F., Xiu Q., Sun J., Hong E. Anti-Platelet and Anti-Thrombotic Effects of Triacetylshikimic Acid in Rats // Journal of Cardiovascular Pharmacology. 2002. Vol. 39. Pp. 262-270.
10. Jiang S., Singh G., Boam D.J., Coggins J.R. Synthesis of 3-deoxy-3.3-diflouroshikimic acid and its 4-epimer from quinic acid // Tetrahedron: Assymetry. 1999. Vol. 10. Pp. 4087-4090.
11. Song C., Jiang S., Singh G. Syntheses of (6S)-6-fluoro- and (6R)-6-hydoxyshikimic acids // Tetrahedron: Assymetry. 2001. Vol. 42. Pp. 9069-9071.
12. Bochkov D.V., Sysolyatin S.V., Kalashnikov A.I., Surmacheva I.A. Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources // Journal of Chemical Biology. 2012. Vol. 5, N1. Pp. 5-17.
13. Gibson J.M., Thomas P.S., Thomas J.D., Barker J.L., Chandran S.S., Harrup M.K., Draths K.M., Frost J.W. Benzene-free synthesis of phenol // Angew Chem Int Ed. 2001. Vol. 40. N10. Pp. 1945-1948.
14. Awang D.V.C., Blumenthal M. Tamiflu and Star Anise: Securing Adequate Supplies of the Oral Antiviral for Avian Flu Treatment // HerbalGram. 2006. N70. Pp. 58-60.
15. Patent 2007/087424 (A1) (US). Methods and materials for the production of chikimic acid / J.W. Frost / 2007.
16. Косолапова A.C., Ламберова М.Э. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. I. Стерилизация эксплантов // Химия растительного сырья. 2010. №2. С. 179-180.
17. Косолапова А.С., Ламберова М.Э. Разработка технологии иммобилизации культуры растительных клеток и тканей на целлюлозосодержащих наносгруктурированныхносигелях in vitro // Ползуновский вестник. 2009. №3. С. 315-318.
18. Патент №2324338 (РФ). Способ получения биомассы in vitro / М.Э. Ламберова, В.Н. Хмелев, А.А. Ламберова, А.Н. Хмелева, А.С. Косолапова / 2008.
19. Ламберова М.Э., Маркина Е.П., Ламберова А.А., Косолапова А.С. Исследование влияния ультразвука на эффективность стерилизации эксплантов сои, скорость роста и содержание общего белка и лигнина в культуре клеток и тканей in vitro // Ползуновский вестник. 2006. №2-2. С. 71-73.
20. Bharathi A., Yan-Hong Wang, Smillie T.J., Khan I.A. Determination of Shikimic Acid in Fruits of Illicium Species and Various Other Plant Samples by LC-UV and LC-ESI-MS // Chromatographia. 2009. N69. Pp. 307-314.
21. Gliessman S.P., Muller C.H. The phytotoxic potential of bracken, Pteridium aquilinum (L.) // Kuhn. Madrono. 1972. Vol. 21. Pp. 299-304.
22. Binarova P., Cvikrova M., Havlicky T., Eder J., Plevkova J. Changes of shikimate pathway in glyphosate tolerant alfalfa cell lines with reduced embryogenic ability // Biologia plantarum. 1994. Vol. 36. Pp. 65-73.
Поступило в редакцию 10 июля 2011 г.
После переработки 19 декабря 2011 г.
Bochkov D.V.1 , Sysolyatin S.V.1, Kalashnikov A.I.1, Surmacheva I.A.1, Lamberova A.A.2, Buyanova A.S.2, LamberovaM.E.2 SEARCH FOR RAW MATERIALS TO ISOLATE SHIKIMIC ACID (3,4,5-TRIHYDROXY-1-CYCLOHEXENE-1 -CARBOXYLIC ACID)
institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, st. Socialisticheskaya, 1, Biysk, 659322 (Russia), e-mail: bochkovipcet@mail.ru
2Biysk Institute of Technology (branch) ofI.I. Pozunov Altay State Technical University, st. Trofimova, 27, Biysk, 659305 (Russia)
Experiments were conducted to study the shikimic acid content in vegetative parts of plants growing in Altai krai. The highest level of shikimic acid was detected in an extract of Scotch pine needles. Also, experiments were performed to in vitro cultivate buckwheat cells in a glyphosate-containing medium, with the accumulation of shikimic acid being found to occur. The best results were obtained upon in vitro cultivation of buckwheat explants in a MS (Murasige-Skuga) nutrient medium over
0.5*10-3 mg/l glyphosate.
Keywords: shikimic acid, shikimate pathway, needles, glyphosate, Scotch pine, buckwheat.
* Corresponding autor.
References
1. Bochkov D.V., Sysoliatin S.V., Kalashnikov A.I., Surmacheva I.A. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2011, no. 1, pp. 119-123. (in Russ.)
2. Brown S.A. Biochemistry of Phenolic Compounds. N.-Y., Academic Press Inc., 1964, 361 p.
3. Bradley D. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, no. 4, pp. 945-946.
4. Enrich L.B., Scheuermann M.L., Mohadjer A, Matthias K.R., Eller C.F., Newman M.S., Fujinaka M., Poon T. Tetrahedron Lett, 2008, vol. 49, pp. 2503-2505.
5. Lingens F. Angewandte Chemie International Edition, 2003, vol. 7, no. 5, pp. 350-360.
6. Patent 006130354A (US). 2000.
7. Zhang Y., Liu A., Z. Guang Y.E., Lin J., L. Zhen XU, Shi Lin Yang. Chem. Pharm. Bull, 2006, vol. 54, no, 10, pp. 1459-1461.
8. Luhong T., Hong X., Yang S., Liying Q., Dongqun C., Chao D., Wei C. Appl. Biochem. Biotechnology, 2009, vol. 158, pp. 408-415.
9. Huang F., Xiu Q., Sun J., Hong E. Journal of Cardiovascular Pharmacology, 2002, vol. 39, pp. 262-270.
10. Jiang S., Singh G., Boam D.J., Coggins J.R. Tetrahedron: Assymetry, 1999, vol. 10, pp. 4087-4090.
11. Song C., Jiang S., Singh G. Tetrahedron: Assymetry, 2001, vol. 42, pp. 9069-9071.
12. Bochkov D.V., Sysolyatin S.V., Kalashnikov A.I., Surmacheva I.A. Journal of Chemical Biology, 2012, vol. 5, no. 1, pp. 5-17.
13. Gibson J.M., Thomas P.S., Thomas J.D., Barker J.L., Chandran S.S., Harrup M.K., Draths K.M., Frost J.W. Angew Chem Int Ed, 2001, vol. 40, no. 10, pp. 1945-1948.
14. Awang D.V.C., Blumenthal M. HerbalGram, 2006, no. 70, pp. 58-60.
15. Patent 2007/087424 (A1) (US). 2007.
16. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2010, no. 2, pp. 179-180. (in Russ.).
17. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Polzunovskii vestnik, 2009, no. 3, pp. 315-318. (in Russ.).
18. Patent №2324338 (RU). 2008. (in Russ.).
19. Lamberova M.E., Markina E.P., Lamberova A.A., Kosolapova A.S. Polzunovskii vestnik, 2006, no. 2-2, pp. 71-73. (in Russ.).
20. Bharathi A, Yan-Hong Wang, Smillie T.J., Khan I.A. Chromatographia, 2009, no, 69, pp. 307-314.
21. Gliessman S.P., Muller C.H. Kuhn. Madrono, 1972, vol. 21, pp. 299-304.
22. Binarova P., Cvikrova M., Havlicky T., Eder J., Plevkova J. Biologiaplantarum, 1994, vol. 36, pp. 65-73.
Received July 10, 2011
Revised December19, 2011
