CC BY
149
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 119-122.
УДК 547.595.3
ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ШИКИМОВОЙ КИСЛОТЫ В НЕКОТОРЫХ РАСТЕНИЯХ АЛТАЙСКОГО КРАЯ
© Д-В. Бочков*, С.В. Сысолятин, А.И. Калашников, И.А. Сурмачёва
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН, ул. Социалистическая, 1, Бийск, 659322 (Россия) e-mail: bochkovdv@bk.ru
Проведены эксперименты по исследованию содержания шикимовой кислоты в зимний период в ряде растений, произрастающих в Алтайском крае, В ходе экспериментов в хвое сосны обыкновенной установлено достаточно высокое содержание шикимовой кислоты (около 2%), при этом показано, что во время сушки вегетативных частей растений при комнатной температуре ее количество закономерно снижается,
Ключевые слова: шикимовая кислота, шикиматный путь, осельтамивир, хвоя, экстракция, органическая кислота, сосна обыкновенная, ель обыкновенная, пихта сибирская, зверобой лекарственный, окопник лекарственный, девясил, пижма девичья, пшеница мягкая,
Введение
Шикимовая кислота (3,4,5-тригидрокси-1-циклогексен-1-карбоновая кислота) - природное органическое соединение - важное промежуточное звено в биосинтезе лигнина, ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин и триптофан) и большинства алкалоидов растений и микроорганизмов [1-3]. Она применяется в качестве исходного вещества в синтезе противовирусного препарата осельтамивир (лекарственное средство против вируса гриппа H5N1, для лечения и профилактики всех известных штаммов вируса гриппа) [1].
В настоящее время шикимовую кислоту выделяют из китайского звездообразного аниса (Illicium anisatum). Выход составляет 3-7% от веса сухих семян самый высокий из исследованных растений [4]. Известно, что большинство автотрофных организмов производит шикимовую кислоту, но ее содержание в подавляющем большинстве автотрофов низкое [5].
Недавно выделена чистая шикимовая кислота (выходы 2,4-3,7%) из семян Liquidambar styraciflua, произрастающей в изобилии в восточной части Северной Америки и Мексике [2]. Ее высокое содержание обнаружено и в листьях дерева гингко (Gingko biloba) [б].
Нами был проведен поиск растений произрастающих в Алтайском крае, содержание шикимовой кислоты в которых позволяло бы рассматривать их пригодными для ее выделения.
Экспериментальная часть
Объекты исследования. В качестве объектов исследования были взяты широко распространенные в Ал -тайском крае растения: зверобой лекарственный (Hypericum spp.) - экстрагировалась сухая надземная часть растения (в основном цветы и листья); окопник лекарственный (Symphytum officinalis) - сухие корневища и зеленые ростки с почками; девясил (Inula helenium) - сухие корни; пижма девичья (Tanacetum parthenium) -сухие цветы; ель обыкновенная (Picea abies) - свежая и высушенная хвоя; сосна обыкновенная (Pinus sylves-tris) - свежая и высушенная хвоя; пихта сибирская (Abies Sibirica) - свежая и высушенная хвоя; пшеница мягкая (Triticum aestivum) - экстрагировались зерна с ростками и корешки (размер ростков 4-5 см) и отдельно ростки.
Образцы хвои были собраны в лесопарковой зоне Бийска (квартал АБ). Остальные растения были приобретены в сети аптек города.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Подготовка материала для анализа. Гомогенизированные на гомогенизаторе шнеково-ножевого типа части растений экстрагировали шестикратным количеством (по весу) 70% водным раствором этанола в трехгорлой колбе с обратным холодильником при перемешивании и температуре 80-85 °С в течение шести часов. Полученный экстракт подвергали фильтрации. Этанол удаляли из фильтрата, используя роторный испаритель RV-10. Полученную вязкую массу промывали ацетоном при нагревании до 50 °С, нерастворив-шийся в ацетоне остаток растворяли в дистиллированной воде и кипятили в течение 10 мин, затем остывший раствор фильтровали. Полученный фильтрат анализировали на наличие шикимовой кислоты. Шикимовую кислоту в чистом виде и в образцах идентифицировали по времени удерживания и точной массе.
Анализ полученных образцов методом ВЭЖХ. Анализ проводили с использованием метода ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200, снабженном дегазатором, градиентным насосом и УФ-детектором. Разделение веществ, содержащихся в экстрактах, проводили на колонке Zorbax Bonus RP (C18) 2,1*150 мм с размером частиц 5 мкм при 25 °С
В качестве подвижной фазы применяли градиент - 0,2%-ный раствор фосфорной кислоты (растворитель А) : ацетонитрил (растворитель Б). 4 мин удерживали 100% А, затем в течение 6 мин линейно до 100% Б. Скорость потока подвижной фазы - 0,25 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны Х=213 нм. Пик, соответствующий шикимовой кислоте, регистрируется на третьей минуте (рис. 1). Содержание шикимовой кислоты в образце пересчитывали на массу сухого сырья.
Хромато-масс-спектральный анализ шикимовой кислоты. Для проведения хромато-масс-спектрального анализа применяли систему жидкостной хроматографии Agilent 1200, оснащенную 1-квадрупольным масс-селективным детектором (G 1956 B) с многорежимным источником ионов. Для ионизации образца использовали метод ионизации - электроспрей в режиме отрицательных ионов. Ионизацию проводили с применением следующих параметров: поток газа-осушителя (азота) - 5 л/мин, температура газа-осушителя 250 °С, испарительной камеры - 150 °С, напряжение на капилляре - 2000 В, напряжение на фрагменторе -100 В. Разделение сделано на колонке Zorbax SB-C18 размером 2,1*150 мм с частицами размером 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали метанол - 0,2%-ный водный раствор уксусной кислоты в градиентном режиме (3 мин удерживали 3% метанола, в течение 7 мин линейно повышали содержание метанола до 100% при скорости потока 0,25 мл/мин). Шикимовая кислота была подтверждена в режиме регистрации индивидуальных ионов ([М-Н] =173,1).
Анализ шикимовой кислоты ЯМР-спектроскопией. Шикимовая кислота легко идентифицируется методом ЯМР-спектроскопии в таких растворителях как D2O, тетрадейтериометанол, ацетон^б. Полученная нами шикимовая кислота из хвои сосны имеет следующие характеристики: ЯМР (300МГц, D2O, 5): 6,70 (м,
1Н), 4,30 (м, 1Н), 3,93 (м, 1Н), 3,67 (дд, J=8,4, 4,5Гц, 1Н), 2,64 (дд, J=18,0, 4,8Гц, 1Н), 2,12 (дд, J=18,0, 6,3Гц, 1Н). 13С ЯМР (75 МГц, D2O, 5): 170,1, 137,1, 129,8, 75,1, 66,5, 65,8, 30,4. Характеристики полностью соответствуют литературным данным [2].
Хроматографическая очистка шикимовой кислоты из хвои. Предварительную очистку шикимовой кислоты проводили как описано выше для подготовки образца на анализ. Далее очищали ее по методу Руохонга Суи [7] с некоторыми изменениями, а именно: после кипячения и фильтрации водный раствор, содержащий шикимовую кислоту, наносили на анионит АВ-17-8 (ГОСТ 20301-74) в уксуснокислой форме. Элюцию проводили 25% водным раствором уксусной кислоты, затем удаляли ее из элюата используя роторный испаритель RV-10. Полученный твердый остаток растворяли в воде и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.
Обсуждениерезультатов
На рисунках 1-4 отражены некоторые хроматограммы, полученные в ходе анализов экстрактов исследуемых растений. На рисунке 1 представлена в качестве эталона аналитически чистая шикимовая кислота.
Проведенные исследования показали, что шикимовая кислота четко фиксируется только в экстракте зверобоя лекарственного (рис. 2) и хвое деревьев хвойных пород (рис. 3).
В таблице 1 приведено содержание шикимовой кислоты в исследованных образцах растений.
Рис. 1. Хроматограмма шикимовой кислоты Рис. 2. Хроматограмма экстракта зверобоя
Латинское название растения Содержание шикимовой кислоты (% на a.c.c.)
Hypericum spp. 0,075
Symphytum officinalis 0
Inula helenium 0
Tanacetum parthenium 0
Picea abies 0,85
Pinus sylvestris 1,54
Abies Sibirica 0,53
Triticum aestivum 0
Рис. 3. Хроматограмма экстракта хвои сосны Рис. 4. Хроматограмма шикимовой кислоты после
очистки на АВ-17-8
Как видно из таблицы 1, наибольшее содержа- Таблица 1. Содержание шикимовойкислоты ние шикимовой кислоты фиксируется в хвое сосны в исследованных образцах растений
обыкновенной.
В ходе очистки, из хвои сосны была получена шикимовая кислота с чистотой, не превышающей 60% (рис. 4). Для дальнейшей очистки необходимо оптимизировать условия элюции с сорбента и добавить метод перекристаллизации из органических растворителей, например из метанола и толуола или этилацетата. Таким образом, возможно создать лишь лабораторную методику получения шикимовой кислоты из хвои сосны, поскольку предполагаемый выход продукта составит не более 10 г с 1 кг хвои, что недостаточно для промышленного производства.
Литературные данные [8] свидетельствуют о том, что зверобой лекарственный характеризуется содержанием шикимовой кислоты на уровне 8,12%, окопник лекарственный - 12,53%, девясил - 8,35%, пижма девичья - 3,74%, пшеница мягкая - 3,57%. Однако в наших исследованиях эти значения оказались значительно ниже. Это, вероятно, связано с тем, что экстракции подвергалось высушенное сырье, а в процессе сушки шикимовая кислота может испытывать ферментативное превращение.
В экстрактах пророщенных зерен мягкой пшеницы и ее ростках шикимовой кислоты не обнаружено, что, вероятно, связано с интенсивным ростом растения и, соответственно, с интенсивной работой ферментов цепи преобразования шикимовой кислоты, что подтверждается проведенным ниже экспериментом.
Для этого к 50 г измельченным на гомогенизаторе шнеково-ножевого типа пророщенных зерен мягкой пшеницы добавляли 200 мл водного раствора шикимовой кислоты (С=2,5 мг/мл) и инкубировали при температуре 25 °С на магнитной мешалке в течение четырех суток в стерильных условиях (добавляя в систему каждые 3-6 ч три капли хлороформа). Спустя четверо суток анализ ВЭЖХ показал полное отсутствие в системе шикимовой кислоты. Таким образом, ферменты шикиматного пути в клетках пророщенного зерна мяг-кой пшеницы проявляют высокую активность не только in vivo, но и in vitro. В дальнейшем было бы интересно исследовать различные растения на содержание в них шикимовой кислоты и активность ферментов шикиматного пути в разные периоды вегетации.
Отсутствие или следовое количество шикимовой кислоты в других исследованных растениях можно объяснить использованием для экстракции сухого сырья.
В качестве доказательства нашего предположения были изучены экстракты, полученные из свежей и сухой хвои.
Результаты анализа экстрактов хвои при разном содержании в ней воды представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что при медленной сушке при комнатной температуре содержание шикимовой кислоты в хвое интенсивно снижается и спустя 4 недели достигает минимума. Тот же процесс снижения уровня шикимовой кислоты во время сушки при 30 °С можно было бы наблюдать и в образцах других растений. Также в ходе проведенных экспериментов установлено, что при длительном хранении (более месяца) хвои при температуре не выше 0 °С изменений в содержании шикимовой кислоты не наблюдается.
Поскольку Алтайский край обладает большими запасами сосны обыкновенной и ежегодно проводится интенсивная заготовка ее древесины, получение шикимовой кислоты из хвои может быть весьма перспективным направлением развития местной промышленности. К тому же хвоя, обладая большим набором химических веществ, ценных для разных областей науки, химической промышленности и медицины, практически не используется, а теряется во время заготовки древесины.
Таблица 2. Содержание шикимовой кислоты в образцах хвои
Название растения Содержание шикимовой кислоты (% на а.с.с.)
во время сушки (10 суток) при 30 °С в сухом сырье (28 сут.) при 30 °С
Ель обыкновенная (Picea abies) 0,35 0,045
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) 0,47 0,086
Пихта сибирская (Abies Sibirica) 0,15 0,027
Выводы
Таким образом, в ходе проведенных экспериментов проанализированы несколько видов растений, широко распространенных в Алтайском крае, на содержание в них шикимовой кислоты в зимний период. Наибольшее количество шикимовой кислоты обнаружено в экстракте хвои сосны обыкновенной. Было показано, что сбор и переработку хвои сосны для выделения шикимовой кислоты целесообразней проводить в осенне-зимний период при температуре не выше 0 °С. Проведенные эксперименты показывают возможность получать шикимовую кислоту на основе доступного сырья.
Список литературы
1. Bradley D. Star role for bacteria in controlling Hu pandemic? // Nature Reviews Drug Discovery. 2005. N4. Pp. 945-946.
2. Enrich L.B., Scheuermann M.L., Mohadjer A, Matthias K.R., Eller C.F., Newman M.S., Fujinaka M., Poon T. Liquid-ambar styraciflua: a renewable source of shikimic acid // Tetrahedron Lett. 2008. N49. Pp. 2503-2505.
3. Lingens F. The Biosynthesis of Aromatic Amino Acids and its Regulation // Angewandte Chemie. 2003. V. 7, N5. Pp. 350-360.
4. Awang D.V.C., Blumenthal M. Tamiflu and Star Anise: Securing Adequate Supplies of the Oral Antiviral for Avian Flu Treatment // HerbalGram. 2006. N70. Pp. 58-60.
5. Washam C. An outbreak of new sources of avian flu drug. // Environ Health Perspect. 2006. V. 114, N8. Pp. 464.
6. Wang X.Q., Guo Y.D., Yang C.B. Determination of shikimic acid in fruit of Illiciaceae plants by HPLC with diode-array detection // Zhongguo Zhongyao Zazh. 2001. V. 26, N7. Pp. 447-449.
7. Ruohong Sui. Separation of Shikimic Acid from Pine Needles // Chem. Eng. Technol. 2008. V. 31. N3. Pp. 469-473.
8. Bharathi A, Yan-Hong Wang, Smillie T.J.,Khan I.A. Determination of Shikimic Acid in Fruits of Illicium Species and Various Other Plant Samples by LC-UV and LC-ESI-MS // Chromatographia. 2009. V. 69. Pp. 307-314.
Поступило в редакцию 2 марта 2010 г.
После переработки 18 октября 2010 г.
