Индикация микроорганизмов при гнойно-некротическом поражении основы кожи в области копытец у коров методом ПЦР Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:617.57/58+636.22

DOI 10.18286/1816-4501-2016-4-135-139

ИНДИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ОСНОВЫ КОЖИ В ОБЛАСТИ КОПЫТЕЦ У КОРОВ МЕТОДОМ ПЦР

Марьин Евгений Михайлович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Хирургия, акушерство, фармакология и терапия»

Ермолаев Валерий Аркадьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой «Хирургия, акушерство, фармакология и терапия»

ФБГОУ ВО Ульяновская ГСХА, 432017, г. Ульяновск, бульвар Венец, 1; тел.: (8422) 55-95-98; e-mail: evgenimari@yandex.ru, e-mail: ermwa@mail.ru

Ключевые слова: коровы, микроорганизмы, ПЦР-диагностика, некробактериоз. В данной статье приведены результаты выделения микроорганизмов, у больных гнойным пододерматитом коров при использовании метода ПЦР. Для проведения ПЦР использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ. В пробах раневого экссудата методом Rial-Time PCR выделены следующие микроорганизмы: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. Возбудителя некробактери-оза в течение всего экспериментального периода не обнаружено.

Введение

Для увеличения количества продукции животноводства в настоящее время особое внимание уделяется вопросам интенсификации производства и выведению высокопродуктивных пород крупного рогатого скота. Как известно, высокопродуктивные коровы болеют намного чаще, это обусловлено выведением из организма с молоком большого количества питательных веществ и микроэлементов, что и влияет на снижение резистентности и реактивности организма [1].

Проведенный мониторинг и ортопедическая диспансеризация поголовья крупного рогатого скота показали, что за период проводимой работы на хирургические заболевания приходилось 45...57% от поголовья, а в некоторых хозяйствах - 57.75%, при этом на болезни дистального отдела конечностей приходилось 65.70% среди хирургических патологий [2, 3, 4, 5, 6].

При болезнях конечностей пораженный орган постоянно контактируется с почвой и другими объектами окружающей среды, и наличие небольших повреждений целостности кожного покрова приводит к обсеменению раны различной бактериальной флорой и возникновению воспалительного процесса [7].

Целью данной работы явился сравнительный анализ состава микроорганизмов, выделяемых у больных гнойным пододерматитом коров методом Rial -Time PCR. Объекты и методы исследований Экспериментально-клинические исследования проводили в племенном хозяйстве ООО ПСК «Красная Звезда» с. Большие Ключищи Ульяновского района Ульяновской области, а молекулярно-биологические исследования осуществляли на базе малого инновационного предприятия ООО «Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии» ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА.

Животных, подобранных для эксперимента, по принципу парных аналогов раздели на 3 группы - по 10 животных в каждой, возраст 4.6 лет, масса 450.500 кг, с диагнозом «гнойный пододерматит».

Животным первой группы (далее в работе - контрольная) - после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с порошком Островского, после чего проводилось наложение бинтовой повязки, с последующей ее заменой через каждые 3 дня, до исчезновения гнойных выделений и образования крупнозернистой грануляции. Во второй фазе на стерильную салфетку наносили 3% тетрациклиновую мазь, вплоть

Рис. 1 - Гнойный пододерматит

до выздоровления животного. Лечение проводилось до полного клинического выздоровления животного.

Во второй группе (далее в работе первая опытная) - также после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с опытным порошком, состоящим из природного сорбента - диатомита, сульфата цинка, стрептоцида и борной кислоты, далее накладывалась бинтовая повязка. Осмотр проводился через каждые 3 дня, после осмотра происходила смена повязок, после окончания фазы гидратации применялась мазь Левомеколь. Перевязки проводились до полного клинического выздоровления животного.

В третьей группе (далее в работе вторая опытная) - после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с опытным порошком, состоящим из природного сорбента - диатомита, сульфата меди, перманганата калия и фурациллина, далее накладывалась бинтовая повязка. Осмотр проводился через каждые 3 дня, после осмотра происходила смена повязок, после окончания фазы гидратации применялась мазь Левомеколь. Перевязки проводились до полного клинического выздоровления животного.

Молекулярно-биологические исследования проводили до начала лечения и

в конце лечения. Отбор проб проводили при помощи специального стержня с наконечником из гигроскопичного материала, которым делали мазок с поверхности патологического очага и затем помещали в стерильные пробирки с физиологическим раствором.

Для диагностики некробактериоза биологическим материалом для исследований являлись гнойно-некротические наложения, которые соскабливали ложкой Фолькмана с пораженных тканей до здоровых слоев ткани. Отбор проб осуществляли согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза» [8].

Для выделения ДНК с отобранного с копытец биоматериала использовали «Комплект реагентов для выделения ДНК из биопроб» (Литех, г. Москва), в основе метода лежит лизис бактериальных клеток, сорбция ДНК на силикагеле и отмывка ДНК спиртово-солевым буфером. Для исследований использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН (Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.) и комплект для ПЦР-диагностики НУКЛЕАПОЛ - РВ (Fusobacterium).

Для проведения ПЦР использовали

13Т

Таблица 1

Исследование видового состава микроорганизмов у ортопедически больных коров

До лечения В конце лечения

Идентификатор пробирки 1 - опытная группа 2 - опытная группа Контрольная группа 1 - опытная группа 2 - опытная группа Контр гр ольная уппа

Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат

1 Strep - - - - - -

1 Staph - 36,2 + 35,4 + - - -

1 Enteroc 18,3 + 35,0 + 34,2 + - - -

1 Pseu aer - - 35,4 + 19,3 + - -

1 Serr - - - - - -

1 Prot - - - - - -

1 Ent, Kleb 14,5 + 36,1 + 36,4 + - - -

1 E.coli 36,2 + 35,7 + - - - -

2 Strep - - 29,3 + - - -

2 Staph - - 34,0 + - - 22,3 +

2 Enteroc - 26,5 + 22,1 + - - -

2 Pseu aer - - 29,8 + - - -

2 Serr - - - - - -

2 Prot 23,1 + - 34,0 + - - 20,1 +

2 Ent. Kleb - - - - - -

2 E.coli - 32,3 + 36,1 + - - -

3 Strep 26,1 + - 28,8 + - - -

3 Staph 23,1 + 28,5 + 34,5 + - - -

3 Enteroc 30,3 + 34,6 + 28,4 + 21,3 + - -

3 Pseu aer - 27,7 + 30,5 + - - -

3 Serr - - - - - -

3 Prot 31,1 + 34,5 + - - - -

3 Ent. Kleb - - 36,3 + - - -

3 E.coli 35,5 + 34,8 + 35,3 + - - -

4 Strep - - - - - -

4 Staph 28,4 + 26,9 + - - - 26,8 +

4 Enteroc - 28,3 + 17,8 + - - -

4 Pseu aer - - 25,8 + - - -

4 Serr - - - - - -

4 Prot - 27,8 + - - - -

4 Ent. Kleb - - - - - -

4 E.coli - - 31,2 + - - -

5 Strep 27,3 + - - - - -

5 Staph 34,1 + 34,8 + - 20,6 + - 17,7 +

5 Enteroc 22,5 + 19,0 + - - - 18,3 +

5 Pseu aer 34,6 + 32,2 + 19,7 + - - -

5 Serr - - - - - -

5 Prot 31,3 + 32,9 + 25,1 + - - -

5 Ent. Kleb - - - - - -

5 E.coli 32,7 + - - - 36,8 + 22,3 +

6 Strep - - - - - -

6 .Staph - - - - - -

6 Enteroc - 14,3 + 21,7 + - - -

6 Pseu aer - 13,3 + - - - -

6 Serr - - - - - -

6 Ent. Kleb 30,0 + - - - -

6 E.coli 24,1 + 15,8 + 24,9 + - - 24,6 +

6 Prot - - - - - -

7 Strep - - - - - -

7 Staph 33,8 + 29,3 + - - -

7 Enteroc - 21,2 + 22,3 + - - -

7 Pseu aer 26,7 + 32,7 + - - - -

7 Serr - - - - - -

7 Prot - - - - - -

7 Ent. Kleb - - - - - -

7 E.coli - - 23,7 + - 37,2 + 16,8 +

8 Strep 35,5 + 25,7 + - - - -

8 Staph - 24,5 + - - - -

8 Enteroc - 20,6 + - - - -

8 Pseu aer 33,7 + 28,4 + - - - -

8 Serr - - 18,4 + - - -

8 Prot - 33,7 + 25,3 + 20,8 + - -

8 Ent. Kleb - - 16,8 + - - -

8 E.coli - 36,6 + 21,4 + - - -

9 Strep 35,3 + 27,3 + - - - -

9 Staph - 28,0 + - - 36,8 + -

9 Enteroc - 25,7 + 17,5 + - - 19,3 +

9 Pseu aer - 24,5 + - - - -

9 Serr 34,6 + - - - - -

9 Prot - - 29,1 + - - 19,7 +

9 Ent. Kleb 34,8 + 36,6 + 17,3 + - - -

9 E.coli - 34,7 + - - - -

10 Strep 36,1 + - - - - -

10 Staph - 35,0 + 27,5 + - - -

10 Enteroc - 34,4 + - - - -

10 Pseu aer 19,1 + 33,7 + - - - -

10 Serr 29,6 + - - - - -

10 Prot - - 26,0 + - - 15,8 +

10 Ent. Kleb - - - - - -

10 E.coli 33,6 + 33,0 + 23,8 + - - -

К+ Strep 31,4 + 24,2 + 23,6 + 14,6 + 33,8 + 20,8 +

К+ Staph 23,5 + 23,8 + 21,2 + 20,9 + 34,8 + 26,5 +

К+ Enteroc 23,3 + 21,6 + 20,8 + 21,0 + 34,6 + 24,8 +

К+ Pseu aer 31,6 + 21,3 + 23,5 + 25,4 + 34,5 + 30,0 +

К+ Serr 22,9 + 23,8 + 23,7 + 24,0 + 36,7 + 29,8 +

К+ Prot 24,6 + 23,6 + 23,5 + 30,2 + 34,7 + 21,0 +

К+ Ent. Kleb 23,9 + 23,5 + 14,2 + 27,2 + 34,6 + 19,9 +

К+ E.coli 15,2 + 15,1 + 22,4 + 17,6 + 35,9 + 22,6 +

K- - - - - - -

детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва). Постановку полиме-разной цепной реакции проводили в микропробирках емкостью 0,2 мл, использовали готовые реакционные смеси СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ - РВ, к которым добавляли по 10 мк ДНК-матрицы. Пробирки с готовой ПЦР-смесью встряхивали на смесителе, все капли со стенок осаждали центрифугированием в течение 5-10 сек.

Переносили пробы в амплификатор и проводили реакцию. Параллельно с исследуемыми образцами ставили отрицательный контрольный образец (с деионизиро-ванной водой). Учет результатов осуществляли отдельно по каждому из каналов, в соответствии с инструкцией к прибору. Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне (0,05) пороговой линией (treshhold) значения порогового цикла «СЪ>. Образец считали отрицательным, если значение «СЪ> по каналу Fam отсутствовало.

Результаты исследований

При исследовании видового состава микроорганизмов, выделяемых с гнойно-некротических очагов в области копытец, установлено (таблица 1), что в начале лечения в контрольной группе обнаружено Streptococcus spp. - в 2 пробах (20%), Staphylococcus aureus в 5 пробах (50%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 5 пробах (50%), Pseudomonas aeruginosa в 7 пробах (70%), Serratia spp. в 1 пробе (10%), Proteus spp. в 5 пробах (50%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 4 пробах (40%), Escherichia coli в 7 пробах (70%).

Было идентифицировано 2 вида и 3 вида микроорганизмов у 3 животных соответственно. 4 вида и 6 видов микроорганизмов было обнаружено соответственно у 2 ортопедически больных коров.

п « "

В первой опытной группе до начала использования экспериментальной схемы лечения обнаружено Streptococcus spp. 6 пробах (60%), Staphylococcus aureus в 3 пробах (30%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 2 пробах (20%), Pseudomonas aeruginosa в 4 пробах (40%), Serratia spp. в 2 пробах (20%),

и

Sä es »1

Si

р Ü ш SS Hi ■ i

00 s!

Proteus spp. в 3 пробах (30%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 3 пробах (30%), Escherichia coli в 5 пробах (50%).

У 3 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов, у 3 коров - 2 вида микроорганизмов, у 2 животных - 3 вида микроорганизмов и по 5 видов и 6 видов микроорганизмов выделено у одного животного соответственно.

Во второй опытной группе до начала лечения обнаружено Streptococcus spp. 2 пробах (20%), Staphylococcus aureus в 8 пробах (80%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 10 пробах (100%), Pseudomonas aeruginosa в 7 пробах (70%), Proteus spp. в 4 пробах (40%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 2 пробах (20%), Escherichia coli в 7 пробах (70%). Serratia spp. не выявлены.

У 1 животного идентифицировано 2 вида микроорганизмов, у 3 животных - 3 вида микроорганизмов и 4 вида микроорганизмов соответственно. 5 видов микроорганизмов выделено у 1 коровы, больной гнойным пододерматитом, и 6 видов микроорганизмов у 2 животных.

В результате проведенного лечения в контрольной группе были выявлены Staphylococcus aureus в 3 пробах (30%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 2 пробах (20%), Proteus spp. в 3 пробах (30%), Escherichia coli в 3 пробах (30%). У 4 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов, у 2 животного 2 вида микроорганизмов и у 1 животного - 3 вида микроорганизмов.

п « "

В первой опытной группе после проведенной терапии гнойных пододерматитов были обнаружены: Staphylococcus aureus в 1 пробе (10%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 1 пробе (10%), Pseudomonas aeruginosa в 1 пробе (10%) и Proteus spp. в 1 пробе (10%). У 4 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов.

Во второй опытной группе в конце экспериментального лечения обнаружено Staphylococcus aureus в 1 пробе (10%) и Escherichia coli в 2 пробах (20%). У 3 животных опытных групп идентифицировано по 1 виду микроорганизмов.

Исследование проб на наличие бактерий рода Fusobacterium показало отсутствие

возбудителя некробактериоза у подопытных животных как до лечения, так и после.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что в 30 пробах, или 100%, отобранных с пораженных гнойно-некротических участков основы кожи копытец у всех подопытных больных коров до начала лечения, присутствуют следующие ассоциации микроорганизмов: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. После проведенного лечения отмечается снижение количества проб: в контрольной группе до 7, или 70%, в первой опытной группе до 4 проб, или 40% и во второй опытной группе до 3, или 30%. Возбудителя некробактериоза в течение всего экспериментального периода не обнаружено. Таким образом, использование экспериментального лечения при гнойных пододерматитах способствует снижению микробной обсеме-ненности.

Библиографический список

1. Лабкович, А.В. Клинико-гематологи-ческий статус коров с язвенными поражениями кожи в дистальном участке конечностей при применении комплексного лечения / А.В. Лабкович // Ученые записки УО ВГАВМ, т.52, вып.1, 2016. - С. 53-56.

2. Болдырев, Д.Н. Ортопедическая и акушерско-гинекологическая патология у коров в условиях привязного содержания / Д.Н. Болдырев, В.А. Толкачев, А.Н. Елисеев // В сборнике: Актуальные вопросы инно-

вационного развития агропромышленного комплекса материалы Международной научно-практической конференции, 2016. - С. 80-83.

3. Гимранов, В.В. Этиология, характер распространенности и особенности патологий в области пальцев у коров голшти-но-фризской породы / Гимранов В.В., Утеев Р.А., Гилязов А.Ф. // Аграрный вестник Урала. 2010. - № 3 (69). - С. 77-79.

4. Журба, В. А. Микробиоценоз гнойных пододерматитов у коров / В. А. Журба // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2014. - №4 - С. 110-113.

5. Марьин, Е. М. Болезни копытец у коров различных пород / Е. М. Марьин, В. А.Ермолаев. // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. -

2011. - №30/1 - том 2. - С. 104-105.

6. Стекольников А.А. Профилактика и лечение специфической язвы подошвы у крупного рогатого скота препаратами Т-HEXX / А.А. Стекольников, М.А. Ладанова // Современные проблемы ветеринарной хирургии: Международнаянаучно-практическая конференция, посвященная 90-летию кафедры общей, частной и оперативной хирургии УО ВГАВМ, Витебск, 3-4 ноября 2016 г. / УО ВГАВМ; ред. кол: А.И. Ятусевич (гл. ред.) [и др.]. - Витебск, 2016. - С. 116-119.

7. Макаев, Х.Н. Профилактическая эффективность различных средств и методов лечения некротических поражений копытец крупного рогатого скота / Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин, Р.М. Потехина, Н.А. Мухамметшин // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана,

2012. - Т. 209. - С.202-205.