CC BY
44
ВЕТЕРИНАРНЫЕ НАУКИ
УДК 619:612.017.1:616-006.446:636.22/.28 ГРНТИ 68.41.67 В.С. Власенко, А.И. Иванов
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛУЧЕННОГО ОТ СЕРОНЕГАТИВНЫХ И СЕРОПОЗИТИВНЫХ КОРОВ-МАТЕРЕЙ
Представлены результаты анализа динамики активности кислородзависимых механизмов нейтро-филов крови в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) у молодняка крупного рогатого скота, полученного от здоровых и положительно реагирующих в реакции иммунной диффузии (РИД) с гликопроте-идным антигеном к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) коров-матерей. Для проведения исследований было отобрано 80 гол. молодняка крупного рогатого скота, родившегося от матерей-вирусоносителей, разного возрастного периода: до 3 мес., 5-6 мес., 12 мес. и 17-18 мес. В качестве контроля использованы также 80 животных этих же возрастных групп, полученных от клинически здоровых коров-матерей, нереагирующих в РИД. Установлено, что у молодняка, полученного от РИД-позитивных коров-матерей, активность кислородзависимых механизмов в спонтанном НСТ-тесте значительно превышала (в 1,3-2,76 раза) показатели крупного рогатого скота, родившегося от РИД-отрицательных животных, во все сроки наблюдения. Тем не менее, у всех телят до 4-6-месячного возраста показатели состояния функционального резерва (коэффициент стимуляции (КС) и индекс респираторного резерва (ИРР)) свидетельствовали об их готовности к завершенному фагоцитозу. Так, значения КС в среднем не опускались ниже 1,97 ± 0,25, а ИРР - 2,72 ± 0,64 %. У потомства, полученного от серопозитивных коров-матерей, с 12-месячного возраста в нейтрофилах периферической крови происходили качественные изменения, сопровождающиеся нарушением внутриклеточных метаболических процессов, на это указывало снижение КС до 0,96 ± 0,07 против 1,29 ± 0,14 в группе контрольных животных и ИРР до -0,05 ± 0,04 % против 1,02 ± 0,55 % у молодняка от здоровых коров-матерей. В организме 50 % молодняка 17-18-месячного возраста от серонегативных животных также развивались подобные негативные перестройки, но были выражены менее ярко. Так, КС у них варьировал от 0,59 до 0,91, в то же время у молодняка, родившегося от коров-вирусоносителей, в подавляющем большинстве от 0,02 до 0,12.
Ключевые слова: лейкоз, молодняк КРС, НСТ-тест, нейтрофилы, окислительно-восстановительный метаболизм.
V.S. Vlasenko, A.I. Ivanov
THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS OF PERIPHERAL BLOOD IN YOUNG
CATTLE PRODUCED FROM SERONEGATIVE AND SEROPOSITIVE COW-MOTHERS
In this article there are presented the results of analysis of the dynamics of the activity of the oxygen-dependent mechanisms of neutrophils in the blood test with nitroblue tetrazolium (NBT-test) in young cattle produced from healthy and from positively reacting in an immunodiffusion reaction (RID) with glycoprotein antigen to the virus bovine leukosis (BLV) of cows-mothers. For the research there were selected the 80 heads of young cattle of different age period: up to 3, 5-6, 12... and 17-18 months, born from mothers of virus carriers. As a control there were used also the 80 animals of the same age groups, obtained from clinically healthy cows-mothers, non-reacting in the RID. It was found that at the young cattle from the RID-positive cows-mothers, the activity of oxygen-dependent mechanisms in spontaneous NBT-test significantly exceeded (in 1.3-2.76 times) the indicators of cattle born from the RID-negative animals in all periods of observation. Nevertheless, the
© Власенко В.С., Иванов А.И., 2016
indicators of the functional reserve (coefficient of stimulation (CS) and the index of respiratory reserve (IRR)) attested of its readiness to a complete phagocytosis at all calves up to 4-6 months of age. Thus, the values of the CS in average did not fall below 1.97 ± 0.25, and the IRR - 2.72 ± 0.64 %. In the neutrophils of peripheral blood of the offspring, obtained from sero-positive cows-mothers, with 12 months of age is a qualitative change, accompanied by disturbance of intracellular metabolic processes, as indicated by a decrease of the CS up to 0.96 ± 0.07 vs. 1.29 ± 0.14 in a control group of animals and IRR to -0.05 ± 0,04 % vs. 1.02 ± 0.55 % of young animals from healthy cows-mothers. Such a negative restructuring also developed in the body of 50 % of young animals of 17-18-month age from seronegative, but it was less clearly expressed. Thus, the CS have ranged at them from 0.59 to 0.91, while in young animals born to cows of virus-carriers, the vast majority was from 0.02 to 0.12.
Keywords: leukosis, young cattle, NBT-test, neutrophils, oxidation-reduction metabolism.
Введение
Лейкоз, несмотря на определенные усилия в борьбе против этого заболевания, прочно занимает первое место среди инфекционных болезней крупного рогатого скота, его удельный вес -47,7 %. Ежегодно регистрируют несколько тысяч неблагополучных пунктов, в которых выявляют около 1 млн особей, зараженных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) [1].
Инфицированию ВЛКРС способствует не только генетическая предрасположенность и дефекты иммунитета, но и естественная неспецифическая резистентность организма. Её состояние во многом определяет развитие и исход любого инфекционного процесса [2].
Важным показателем естественной неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза и внутриклеточное переваривание инфекционных агентов [3].
Одним из ранних проявлений реактивности нейтрофилов служит активация кислородза-висимого метаболизма - «респираторный или метаболический взрыв», возникающий в связи с процессом фагоцитоза. Основным и наиболее информативным методом исследования функциональной и метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитро-синим тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности практически бесцветного красителя тетразолиевого ряда - НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в нерастворимый темно-синий формазан. Считается, что этот процесс коррелируется с внутриклеточным образованием перекиси водорода, которая вместе с йодом образует важную бактерицидную систему нейтрофилов [4].
Необходимо отметить, что изучению иммунологических аспектов при данном заболевании посвящено много работ, однако исследования качественных дефектов элементов иммунной системы в основном касаются популяции лимфоцитов и гуморального иммунитета [5, 6].
В связи с этим актуально установление роли и значения нейтрофильных гранулоцитов и компонентов их бактерицидной системы в патогенетических механизмах развития лейкозно-го процесса у животных, полученных от серонегативных и серопозитивных коров-матерей.
Цель наших исследований заключалась в изучении особенностей кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у молодняка крупного рогатого скота разного возраста, полученного от серонегативных и серопозитивных коров-матерей.
Объекты и методы
Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных».
Сравнительное изучение особенностей кислородзависимого метаболизма проведено на 160 гол. молодняка крупного рогатого скота различных периодов постнатального развития (до 3 мес., 5-6 мес., 12 мес. и 17-18 мес.), из которых 80 получены от клинически здоровых, нереагирующих в реакции иммунной диффузии (РИД) с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (I группа), и 80 - от коров-матерей, положительно реагирующих в РИД (II группа). Животные I группы каждого возраста (n = 20) служили в качестве контроля.
Для постановки РИД использовали набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Подготовку компонентов реакции к работе осуществляли в соответствии с «Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота».
Функциональная активность нейтрофилов оценена в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) фотометрическим способом в спонтанном и индуцированном варианте. Тесты
выявляли исходную степень функционального раздражения нейтрофилов и потенциальную возможность повышения обмена веществ в нейтрофиле при стимуляции in vitro его метаболической активности. Результаты выражены в условных единицах (у. е.) - единицах оптической плотности х 1000. Для характеристики функционального резерва нейтрофилов (биохимического критерия готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу) был рассчитан коэффициент стимуляции (КС) как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному, а также индекс респираторного резерва (ИРР) как разница между показателями индуцированной и спонтанной активности нейтрофилов в процентах [7].
Математическая обработка цифровых данных включала определение средней арифметической (M), ошибки средней арифметической (m). Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Mj^ и My использовали t-критерий по Стьюденту.
Результаты исследований
В ходе проведенных исследований установлено, что у молодняка, полученного от РИД-позитивных коров-матерей, активность кислородзависимых механизмов в спонтанном НСТ-тесте значительно превышала (в 1,3-2,76 раза) показатели крупного рогатого скота, родившегося от РИД-отрицательных животных, во все сроки наблюдения (таблица).
Показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, по данным индуцированного НСТ-теста, у телят II группы до 4-6-месячного возраста были также увеличены. Однако в последующем выявлена тенденция к понижению их активности относительно соответствующих показателей крови у животных, родившихся от РИД-позитивных коров-матерей, к 17-18-месячному возрасту до 20,15 ± 2,56 против 29,90 ± 1,85 у. е. (Р < 0,01).
Свидетельством высокой потенциальной способности нейтрофилов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение у телят I и II группы до 4-6-месячного возраста служили такие параметры окислительно-восстановительного метаболизма, как КС и ИРР. Так, значения КС в среднем не опускались ниже отметки 1,97 ± 0,25, а ИРР - 2,72 ± 0,64 %. В последующем у молодняка крупного рогатого скота, полученного от РИД-позитивных коров, в возрасте 12 мес. КС достоверно снижался до 0,96 ± 0,07 против 1,29 ± 0,14 (Р < 0,05) в группе контрольных животных этого же возраста. Одновременно наблюдалось снижение ИРР до -0,05 ± 0,04 % против 1,02 ± 0,55 %, указывающее на угнетение переваривающей функции нейтрофильных гранулоцитов.
Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови у молодняка крупного рогатого скота разного возраста, M ± m
Возраст Группа НСТ-тест, у. е. КС ИРР,
мес. животных Спонтанный Индуцированный НСТ %
I 20 41,15 ± 5,90 69,95 ± 5,90 2,04 ± 0,21 2,88 ± 0,32
до 3 II 20 113,7 ± 6,84 226,25 ± 12,92 2,17 ± 0,20 11,20 ± 1,32
Р < 0,001 Р < 0,001 Р > 0,05 Р < 0,001
I 20 38,25 ± 3,10 65,5 ± 6,52 1,97 ± 0,26 2,72 ± 0,64
4-6 II 20 49,60 ± 5,52 117,8 ± 9,22 2,63 ± 0,19 6,82 ± 0,66
Р > 0,05 Р < 0,001 Р < 0,05 Р < 0,001
I 20 37,55 ± 1,05 47,80 ± 5,32 1,29 ± 0,14 1,02 ± 0,55
12 II 20 48,70 ± 3,64 42,90 ± 2,20 0,96 ± 0,07 -0,05 ± 0,04
Р < 0,01 Р > 0,05 Р < 0,05 Р > 0,05
I 20 33,15 ± 2,36 29,90 ± 1,85 0,99 ± 0,08 -0,32 ± 0,34
17-18 II 20 85,25 ± 20,63 20,15 ± 2,56 1,49 ± 0,33 -5,41 ± 2,10
Р < 0,05 Р < 0,01 Р > 0,05 Р < 0,05
Подобную картину мы наблюдали относительно индекса респираторного резерва у животных обеих групп в возрасте 17-18 мес., который приобретал отрицательные значения, особенно у молодняка крупного рогатого скота II группы (соответственно: -5,41 ± 2,10 %, -0,32 ± 0,34 %; Р < 0,05). Помимо этого выявлено увеличение КС до 1,49 ± 0,33 против 0,99 ± 0,08 у индивидуумов I группы, однако разница оказалась недостоверной и была связана с колебаниями этого показателя в широких пределах: от 0,02 до 4,0.
Следует отметить, что при анализе индивидуальных показателей молодняка крупного рогатого скота 17-18-месячного возраста, как в I, так и во II группах, выявлено 50 % животных,
у которых нейтрофилы не в состоянии метаболизировать свой эффекторный потенциал и активно отвечать наработкой активных форм кислорода. Но, если уменьшение показателя индуцированного НСТ-теста ниже значений спонтанного НСТ-теста (КС < 0,99) в I группе варьировало от 0,59 до 0,91, то у особей II группы в подавляющем большинстве - от 0,02 до 0,12.
Заключение
Полученные результаты позволяют сделать заключение: у всех телят до 4-6-месячного возраста показатели состояния функционального резерва и метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов свидетельствуют об их готовности к завершенному фагоцитозу.
У потомства, полученного от серопозитивных коров-матерей, с 12-месячного возраста в нейтрофилах периферической крови происходят качественные изменения, сопровождающиеся нарушением внутриклеточных метаболических процессов (повышением спонтанной кисло-родзависимой активности, уменьшением стимулированной и как следствие подавлением функционального резерва нейтрофилов). В организме молодняка 17-18-месячного возраста от се-ронегативных животных также развиваются подобные негативные перестройки, но выражены они менее ярко.
Список литературы
1. Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Козырева Н.Г., Степанова Т.В. Анализ эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации за 2014 год // Реализация достижений ветеринарной науки для обеспечения ветеринарно-санитарного и эпизоотического благополучия животноводства Брянской области в современных условиях: материалы науч.-произв. конф. Брянск, 2015. С. 78-89.
2. СемененкоМ.П., Басова Н.Ю., Кузьминова Е.В. Оценка биохимических, гематологических и иммунологических показателей у инфицированных вирусом лейкоза КРС, больных лейкозом и интактных коров // Ветеринария Кубани. 2011. № 2. С. 22-23.
3. Нагоев Б.С., Бецукова А.М. Изменение активности показателя функционально-метаболической активности лейкоцитов при гриппе и постгриппозной пневмонии // Вестн. новых медицинских технологий. 2011. Т. XVIII. № 4. С. 85-86.
4. Нагоев Б.С., Шубич М.Г. Значение теста восстановления нитросинего тетразолия для изучения функциональной активности лейкоцитов // Лабораторное дело. 1981. № 4. С. 195-198.
5. Мотавина Л.И., Иванов А.И. Динамика изменения иммуноглобулинов в сыворотке крови телят, полученных от серонегативных (РИД-) и серопозитивных (РИД+) коров-матерей // Вестн. мясного скотоводства. 2013. № 3 (81). С. 34-39.
6. Сахаутдинов И.С., Мотавина Л.И. Показатели Т- и В-систем иммунитета телят, полученных от РИД- и РИД+ коров-матерей // Вестн. мясного скотоводства. 2014. № 2 (85). С. 38-44.
7. Власенко В.С., Донченко Н.А., Пацула Ю.И., Бажин М.А., Иванов А.И., Морозова О.В., Дудоладо-ва Т.С. Методы оценки функциональной активности лейкоцитов при туберкулезе и лейкозе животных : метод. пособие. ФГБНУ ВНИИБТЖ. Омск, 2015. 16 с.
Власенко Василий Сергеевич, доктор биолог. наук, Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, vvs-76@list.ru; Иванов Александр Иванович, аспирант, Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных.
References
1. Gulyukin M.I, Ivanova L.A., Kozyireva N.G., Stepanova T.V. Analiz epizooticheskoy situatsii po leykozu krupnogo rogatogo skota v Rossiyskoy Federatsii za 2014 god // Realizatsiya dostizheniy veterinarnoy nauki dlya obespecheniya veterinarno-sanitarnogo i epizooticheskogo blagopoluchiya zhivotnovodstva Bryanskoy oblasti v sov-remennyih usloviyah : materialyi nauchno-proizvodstven-noy konferentsii. Bryansk, 2015. S. 78-89.
2. Semenenko M.P., Basova N.Yu., Kuzminova E.V. Otsenka biohimicheskih, gematologicheskih i immu-nologicheskih pokazateley u infitsirovannyih virusom ley-koza KRS, bolnyih leykozom i intaktnyih korov // Veteri-nariya Kubani. 2011. № 2. S. 22-23.
3. Nagoev B.S., Betsukova A.M. Izmenenie ak-tivnosti pokazatelya funktsionalno-metabolicheskoy akti-vnosti leykotsitov pri grippe i postgrippoznoy pnevmonii // Vestn. novyih meditsinskih tehnologiy. 2011. T. XVIII. № 4. S. 85-86.
4. Nagoev B.S., Shubich M.G. Znachenie testa vosstanovleniya nitrosinego tetrazoliya dlya izucheniya funkcional'noj aktivnosti lejkocitov // Laboratornoe delo. 1981. № 4. S. 195-198.
5. Motavina L.I., Ivanov A.I. Dinamika izmeneniya immunoglobulinov v syivorotke krovi telyat, poluchennyih ot seronegativnyih (RID-) i seropozitivnyih (RID+) korov-materey // Vestn. myasnogo skotovodstva. 2013. № 3 (81). S. 34-39.
6. Sahautdinov I.S., Motavina L.I. Pokazateli T- i B-sistem immuniteta telyat, poluchennyih ot RID-i RID+ korov-materey // Vestn. myasnogo skotovodstva. 2014. № 2 (85). S. 38-44.
7. Vlasenko V.S., Donchenko N.A., Pacula Yu.I., Bazhin M.A., Ivanov A.I., Morozova O.V., Dudolado-va T.S. Metody ocenki funkcional'noj aktivnosti lejkocitov pri tuberkuleze i lejkoze zhivotnyh : metod. posobie. FGBNU VNIIBTZH. Omsk, 2015. 16 s.
Vlasenko Vasily Sergeevich, head of laboratory of epizootology and control measures of tuberculosis FGBNU "All-Russia Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals", Doctor of Biology Science, Associate Professor, vvs-76@list.ru; Ivanov Alexander Ivanovich, Postgraduate Student, FGBNU "All-Russia Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals".
Статья поступила в редакцию 16 марта 2016 г.
