CC BY
190
УДК 579.222 + 574.24 + 579.6
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В ОЦЕНКЕ ПРОЦЕССА БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ МИКРОБНЫМИ
АССОЦИАЦИЯМИ
Т.В. Фунтикова, А.И. Ломовский, Л.И. Ахметов, И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов, Р.А. Нарманова, О.Н. Понаморева
С использованием методов гравиметрии и ИК-спектрофотометрии оценена степень деструкции нефти различными микробными ассоциациями. Данные, полученные с использованием этих методов, близки в пределах погрешностей. Метод ИК-спектрофотометрии более экспрессный, однако метод гравиметрии более точен. Для мониторинга биодеградации углеводородов нефти можно использовать оба метода. Фракционирование остаточной нефти методом жидкостно-адсорбционной хроматографии позволило выявить наиболее эффективную микробную ассоциацию, состоящую из штамма Pseudomonas sp. и двух штаммов рода Rhodococcus.
Ключевые слова: биодеградация, нефть, микробные ассоциации, гравиметрия, ИК-спектрофотометрия, жидкостно-адсорбционная хроматография
Введение
Нефть и продукты ее переработки являются самыми распространенными загрязнителями окружающей среды. Нефть состоит из из нескольких сотен разнообразных органических соединений (алифатические, алициклические, ароматические углеводороды и гетероатомные соединения), соотношения между которыми различаются в зависимости от источников происхождения нефти. Во многих случаях процесс деградации нефти может быть активирован путем внесения минеральных и/или органических добавок (биостимуляция), а также внесением специальных культур микроорганизмов, способных деградировать различные углеводороды нефти (биоаугментация). Проведение исследований процесса деградации нефтезагрязнений как в лабораторных условиях, так и в окружающей среде требует оперативной информации о количестве углеводородов в исследуемых образцах (почве и водных системах). Для оценки уровня нефтезагрязнений используют различные методы анализа углеводородов нефти (рис. 1).
Одной из важных задач при определении эффективности биодеградации углеводородов нефти является использование адекватных методов анализа содержания нефти в образцах. Для оценки потребления нефти почвенной микробиотой или интродуцированными в почву микроорганизмами широко используется экстракционно-гравиметрический метод. Суть метода состоит в использовании специальных растворителей для экстракции углеводородов нефти из загрязненных почв. Количественными показателями до и после
биоремедиации служат изменения веса почвы после экстракции углеводородов и/или количества углеводородов в экстракте. В последние годы для определения содержания нефти в экстрактах используют экстракционно-ИК-спектроскопический метод, где на основе спектра поглощения функциональных групп, характерных для углеводородов нефти (С-Н-, СН3- и СН2-групп), определяют количество алифатических углеводородов [1]. Фракционирование нефти методом жидкостно-адсорбционной хроматографии с применением микроколонок позволяет оценить потребление отдельных фракций нефти: парафино-нафтеновые и моноароматические углеводороды; полициклические ароматические углеводороды; нафтеновые кислоты и спирто-бензольные смолы [2].
ИК-СПЕКТРОМЕТРИЯ води, почва, донные отложения
• 1Д 52.24.454-95
• Щ 52.24.476-95
• 1Д 52.24.505-98
• Щ 52.18.575-96
• ПНДФ 14.1:2.4.168-00
• ПНДФ 16.1:2.2.22-98 • ПНДФ 14.1:2.5-95
•ASTMD 3414-85
• ISO 9377-2 ▲
Т
основан на измерении оптической плотности полосы поглощения v ^ 2930 см1
ГАЗОВАЯ. ГАЗОЖИДКО С ТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ вода, почва
• ГОСТ 52406-2005
• ПНДФ 16.1.38-02
• ASTM D 3338-82
• IS0 6468
• Унифицированные методы исследования качества вод
ж. т
основан на расчете площадей методом внутренней нормализации
Ф,ТУОРИМЕТРИЯ ГРАВИМЕТРИЯ
вода, почва вода, почва
• ПНДФ 14.1:2:4.128-98 • ПНДФ 14.1:2.116-97
• ПНДФ 16.1.21-98 • ПНДФ 16.1.41-04
• ASTMD 3650-82 • ISO 9377-1
ж ж
т ■W
основан на измерении основан на измерении
интенсивности массы выделенных
флуорес□е в пн и нефтепродуктов
СПЕКТРОМЕТРИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
КОМБИНИРОВАННАЯ вода
донные отложения
• ПНДФ 14.1:2.62-96
• Щ 52.24.80-89 ж
ЧГ основан на измерении
основан на измерении интенсивности
светопоглощения в ИК- светопоглощения на длине
н УФ-о&ластях волны А, = 270 нм
Рис. 1. Методы анализа углеводородов нефти в исследуемых образцах
Целью данной работы была оценка эффективности процесса биодеградации нефти различными микробными ассоциациями.
Материалы и методы исследования Бактериальные штаммы. В работе были использованы 8 штаммов-деструкторов нефти и дизельного топлива, выделенные из нефтезагрязненных почв, и один штамм Ааж1оЬас1ег Ьаитаппи 7 из коллекции ЗАО «Биоойл» (табл. 1).
Питательные среды, источники углерода и энергии. В качестве минимальной среды использовали среду Эванса (Е), следующего состава (г, мл/л) [3]: 50 мМ К2НР04; 5 М раствор N^0 - 1 мл; 1 М раствор - 1 мл; 62 мМ раствор MgQ2 - 1 мл; 1 мМ раствор СаС12 - 1мл; 0,005 мМ раствор (МН4)6Мо7О24ЧН2О - 1 мл; микроэлементы - 1мл (состав микроэлементов: 7пО - 0,41 г/л; Feaз•6 Н2О - 5,4 г/л; МдСЪЧ^О - 2 г/л; СиСЬ^О - 0,17 г/л; СоСЬ^О - 0,48 г/л; Н3ВО3 - 0,06 г/л).
Таблица 1
Характеристика штаммов, использованных в работе_
Штамм Характеристика Плазмида т.п.н.
Rhodococcus sp. Dsf+ Ше+ Phe+ вп7+ 300
Ф2/1-Н4 150
Rhodococcus Npht+ Dsf+ Ше+ Phe+ 300
erythropolis Ф2/2-Н4 150
Rhodococcus sp. Npht+ Dsf+ Hde+ Phe+ вп7+ еьп7+ 1000
Т3-ДТ 20
Rhodococcus Npht+ Dsf+ Ше+ Phe+ еьп7+ 350
erythropolis Б/1-Н
Rhodococcus Npht+ Dsf+ Ше+ Phe+ вп7+ еьп7+ 800
erythropolis Т3-ДТ4
Rhodococcus sp. Npht+ Dsf+ Hde+ Phe+ 1000
К2-Н 25
Rhodococcus Npht+ Dsf+ Ше+ Phe+ вп7+ еьп7+ 400
erythropolis К1-Н4
Pseudomonas sp. Npht+ Dsf+ Hde+ Nah+ Sal+ Gnt+ Сат+ 100
К3-Н
Acinetobacter Npht+Dsf+Hde+ Oct+ Dec+ Non+ 50, 42, 20,
baumannii 7 12, 6
Примечание: способность к росту на - нефти; Dsf" - дизельном топливе; Ше+ - гексадекане; Phe+ - феноле; вп7+ - бензоле; еьп7+ -этилбензоле; ОС:+- октане; Dec+- декане; №п+ - нонане; Сат+- камфаре; Nah+ - нафталине; Sal+ - салицилате; Gnt+ - гентизиновой кислоте
В качестве богатой среды использовался L- бульон [4], содержащий (в %): бакто-триптон (Pronadisa, Испания) - 1,0; дрожжевой экстракт (Pronadisa, Испания) - 0,5; №С1 - 1,0.
Для получения агаризованной среды добавляли 20 г агара (Pronadisa, Испания).
Среды стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 1
атм.
В работе использовали нефть с месторождения «Ащисай» Республика Казахстан. Состав нефти приведен в табл. 2.
Таблица 2
Углеводородный состав нефти месторождения «Ащисай» (АО «КОР»), __Республика Казахстан___
Месторождение Алканы Нафтены Арены Другие соединения
Неразвет-вленные Разветвленные
«Ащисай» (АО КОР) 65,28 12,36 6,73 3,72 11,91
Условия культивирования. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса с добавлением нефти до конечной концентрации 2% весовых (по объёму). Посевная концентрация микроорганизмов в среде составляла 2-3 х106 кл/мл. После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и выращивали микроорганизмы в течение 10 сут при 24°С или при 4-6°С.
Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов. Для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) (концентраций живых клеток) в суспензии применяли метод стандартных серийных разведений. Чашки помещали в термальную комнату с оптимальной для роста микроорганизмов температурой (30°С) на 24 - 48 часов, после чего производили подсчет числа выросших колоний и вычисляли концентрацию микробных клеток в исходной суспензии:
С(КОЕ / мл) = 10" х N х 10, где п - разведение, в котором выросли колонии; N -количество колоний, выросших в разведении п; 10 - коэффициент пересчёта исходя из вносимого на чашки Петри 0,1 мл образца.
Определение степени деструкции нефти гравиметрическим методом. Остаточную нефть экстрагировали из культуральной среды 50 мл хлороформом (2:1 об./об.), экстракт отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 4500 об/мин и высушивали перемешиванием над 3 г безводного сульфата натрия. Для удаления хлороформа пробирки с 5 мл экстракта 4 ч выдерживали при 70-75°С, затем при 35-40°С в течение ночи и взвешивали.
Определение общего содержания углеводородов нефти и нефтепродуктов методом инфракрасной (ИК) - спектрофотометрии.
Углеводороды нефти для анализа концентрировали путём экстракции четыреххлористым углеводородом из исследуемых проб (1:1 об./об.) и измеряли концентрацию на приборе АН-2 в спектральной области X = 3,42 мкм.
Определение содержания нефтепродуктов проводили в соответствии с методическими указаниями «Определение концентрации
нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии» (МУК 4.1.1956-05) и ПНД Ф. 14.1:2.5-95 «Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в природных и сточных водах методом инфракрасной спектрофотометрии»
В случае превышения концентрации углеводородов в определяемом образце за пределы измерения прибора производили разведение экстракта четыреххлористым углеродом. Коэффициент пропорциональности определяли по калибровочной кривой на приборе АН-2.
Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах. Оценку фракционного состава остаточной нефти проводили методом жидкостно-адсорбционной хроматографии с применением микроколонок, заполненных по 0,7 г силикагеля 60, 63-200 microns RE (70-230 mesh) (Panreac, Испания). Сорбент уравновешивали гексаном. Навески проб (по 0,05 г), полученных экстракцией в ходе весового анализа, диспергировали в 1 мл гексана, наносили на микроколонки и оставляли на 20 мин. Элюцию углеводородов осуществляли гексаном, бензолом и смесью бензол-этанол в соотношении (1:1 об./об.) 4-мя порциями по 1 мл в тарированные пробирки. Полученные "гексановые", "бензольные" и "спиртобензольные" фракции упаривали на воздухе и досушивали в вентилируемом сушильном шкафу при 750С до постоянного веса. Содержание фракций рассчитывали в пересчете на исходную навеску пробы. Потери исходного образца за счет необратимой в данных условиях сорбции на силикагеле условно принимали за асфальтены и высокомолекулярные смолистые вещества.
Статистическая обработка результатов. Обработку результатов осуществляли c помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).
Результаты и их обсуждение
Определение деструктивной активности исследуемых штаммов.
Разработка и совершенствование технологий биоремедиации территорий, загрязненных углеводородами нефти, в настоящее время является областью активных фундаментальных и прикладных исследований. Сырая нефть является смесью химических веществ, содержащей сотни компонентов. Основное различие между нефтью, добытой в различных географических районах, обусловлено не химическим составом, а содержанием отдельных компонентов; последнее и влияет на химические и физические свойства сырой нефти. Поэтому в последнее время в биоремедиации используют микробные ассоциации, состоящие из двух и более штаммов, поскольку интродукция монокультуры углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязнённую среду не может полностью решить проблему очистки [5].
На первом этапе работы было необходимо выбрать из имеющихся штаммов-нефтедеструкторов наиболее эффективных с целью создания
микробных ассоциаций, деградирующих углеводороды в широком температурном диапозоне. Внесение эффективных микроорганизмов-деструкторов нефти в почву совершенно необходимо как в северных районах, где тёплый период года непродолжителен и природная микрофлора не успевает адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, так и в жарких регионах, где ограничено разнообразие аборигенных микроорганизмов [6]. Поэтому эксперимент по изучению степени деструкции нефти исследуемыми штаммами в жидкой минеральной среде с 2% нефти проводили при двух температурах (24°С и 4°С). Микроорганизмы культивировали в колбах в течение 10 дней. Для определения остаточного содержания углеводородов нефти использовали метод ИК-спектрофотометрии.
Степень деструкции нефти индивидуальным микроорганизмом определяли по следующей формуле с учетом данных, полученных для контроля:
Р -Р О,% = —-L • 100%,
Рк
где О - степень деструкции %; Рк - концентрация углеводородов в контроле (среда Е+2%нефти); Р^ концентрация углеводородов нефти в образцах(среда Е+2% нефти + микроорганизм). Данные представлены в табл. 3.
Таблица 3
Деградация нефти микроорганизмами-нефтедеструкторами _в течение 10 суток при температуре 24 °С и 4 °С_
Штамм 24 °С 4 °С
Деградация нефти, %
Б/1-Н 16,8 6,2
Т3-ДТ4 58,4 35,6
Ф2/1-Н4 54,8 29,5
Ф2/2-Н4 54,7 24,5
К1-Н4 11,8 10,2
К2-Н 19,1 12,4
Т3-ДТ 17,6 23,1
BS3701 35,5 25,8
7 25, 1 10, 6
На основании полученных данных по биодеградации нефти при двух температурах, а также с учетом полученных раннее физиолого-биохимических данных были отобраны 5 наиболее активных штамма (Т3-ДТ4, Ф2/1-Н4, Ф2/2-Н4, BS3701, 7), которые потребляли от 25 до 60 % нефти при 24° С и от 10 до 35 % нефти при 4 °С.
Разработка микробных ассоциаций. Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами [7]. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Описано более 20 родов бактерий и более 10 родов грибов, способных к биодеградации различных нефтяных углеводородов [8]. Анализ литературных данных показал, что наиболее распространенными в загрязненных нефтью местообитаниях являются бактерии - представители родов Rhodococcus, Arthrobacter, Pseudomonas, Acinetobacter [9].
Четких критериев составления микробных консорциумов для включения их в состав биопрепаратов в настоящее время нет. Большинство исследователей при разработке таких консорциумов опираются на совместимость штаммов и их катаболическую активность, а основным параметром, на основании которого формируется ассоциация, служит степень суммарной деструкции нефти. Для составления ассоциации штаммов-деструкторов углеводородов нефти можно использовать различные подходы: 1) на основании анализа и последующего комбинирования физиологических, метаболических и деструктивных свойств микроорганизмов; 2) селекция при периодическом культивировании смешанной ассоциации отобранных микроорганизмов в жидкой минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии [10].
Нами ранее были исследованы физиолого-биохимические и метаболические свойства используемых в данной работе микроорганизмов-нефтедеструкторов [11]. На основании полученных результатов составлены 4 ассоциации микроорганизмов: две ассоциации были составлены из микроорганизмов только рода Rhodococcus, одну ассоциацию дополнили эффективным микроорганизмом-деструктором ПАУ рода Pseudomonas, другую ассоциацию усилили эффективным деструктором короткоцепочечных н-алканов рода Acinetobacter (рис. 3).
Ассоциации культивировали при температуре 24 °С в жидкой минеральной среде Эванса, содержащей 2 % нефти, в течение 10 суток для анализа процесса деградации. Исходная концентрация микроорганизмов в среде составляла 2-3 х106 кл/мл. В конце эксперимента численность микроорганизмов возрастала до 108 - 109кл/мл. Остаточную концентрацию улеводородов нефти после культивирования оценивали методом ИК-спектрофотометрии и гравиметрическим методом.
Гравиметрический метод оценки биодеградации нефти различными микробными ассоциациями. Гравиметрический метод анализа содержания углеводородов нефти в исследуемых объектах является одним из наиболее доступных и широко распространенных. В данном методе определяют массу сухого остатка углеводородов нефти в образцах.
Ассоциация №1 Ассоциация №2 Ассоциация №3 Ассоциация №4
Rhodococcus sp. Ф2/1-Н4 Rhodococcus erythropolis Ф2/2-Н4 Rhodococcus Rhodococcus sp. Rhodococcus sp. Ф2/1-Н4 Rhodococcus erythropolis Ф2/2-Н4 Acinetobacter
Rhodococcus sp. Ф2/1-Н4 Rhodococcus erythropolis Ф2/2-Н4 Ф2/1-Н4 Rhodococcus erythropolis Ф2/2-Н4 Pseudomonas sp. K3-H
erythropolis ТЗ-ДТ4 baumannii 1
Рис. 3. Состав ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов
Как видно из представленных данных в табл. 4, после 10 суток культивирования при 24 °С в среде без микроорганизмов убыль нефти составила 19 % вследствие стерилизации при температуре 121 °С и испарения. Убыль нефти в среде с микроорганизмами, составляющими ассоциацию № 1 (два штамма рода Rhodococcus), составила 50 %. При добавлении к ним еще одного штамма рода Rhodococcus (ассоциация № 2) убыль нефти составила 80%, а при добавлении штамма рода Pseudomonas (ассоциация № 3) и штамма рода Acinetobacter (ассоциация № 4) убыль составила 87 % и 84 %, соответственно. После вычета абиотической деградации степень биодеградации нефти различными ассоциациями составила от 30 до 70 %. Данные представлены на рис. 4.
Таким образом, при добавлении третьего штамма к ассоциации № 1, состоящей из двух штаммов рода Rhodococcus, эффективность деградации нефти ассоциациями № 2, № 3, № 4 возросла в 2 раза и составила от 60 до 70 %.
Сравнение результатов биодеградации нефти исследуемыми ассоциациями микроорганизмов, полученных ИК-
спектрофотометрией и гравиметрическим методом анализа. Одновременно с гравиметрическим методом анализа остаточной нефти после культивирования микробных ассоциаций использовали метод ИК-спектрофотометрии.
Таблица 4
Данные гравиметрического метода анализа степени деструкции
нефти в исследуемых образцах
Результаты Контроль Абиотическая деградация Ассоциация № 1 Ассоциация № 2 Ассоциация № 3 Ассоциация № 4
Вес сухого образца остаточной нефти, г 0,117 ±0,006 0,095± 0,005 0,058± 0,003 0,024± 0,001 0,015± 0,001 0,019± 0,001
Деструкция нефти, % 0 19±5 50±5 80±4 87±7 84±5
Примечания: Контроль - Среда Е+2% нефти; Абиотическая деградация- Среда Е+2% нефти (культ. 10 суток при 24оС)
80 - 70 -60 - £ 50 | 40 -я 30 -£ 20 -5 10 - О. п . 1 1 1 1 N
и Ассоциация №1 Ассоциа М ция №2 Ассоциа 1икробные ассоциац* ция №3 Ассоциа 1И ция №4
Рис. 4. Степень деградации нефти различными ассоциациями микроорганизмов при культивировании в жидкой минеральной среде
Эванса, содержащей 2% нефти, в течение 10 суток при 24 оС (результаты гравиметрического анализа) за вычетом абиотической деградации; абиотическая убыль нефти составила 19±5
Как видно из данных табл. 5, степень деградации соответствует данным, полученным с использованием гравиметрического метода. Также при добавлении третьего штамма к ассоциации № 1 (два штамма рода Rhodococcus) эффективность деградации ассоциациями № 2, № 3, № 4 возросла в 2 раза и составила от 50 до 60 %. Полученные с использованием двух методов, близки в пределах погрешностей.
Таблица 5
Степень деградации нефти различными ассоциаци^и микроорганизмов при 24 оС в течение 10 суток, полученная _ различными методами_
Методы определения нефти в образцах Степень биодеградации нефти, %
Ассоциация № 1 Ассоциация № 2 Ассоциация № 3 Ассоциация № 4
ИК- спектрофотометрия 30±15 52±14 58±16 60±10
Гравиметрия 32±5 60±4 68±7 65±5
Метод гравиметрии прост в применении, не требует сложного оборудования. Однако по времени он более длительный, чем метод ИК-спектрофотометрии, и занимает 2 суток.
Метод ИК-спектрофотометрии прост в исполнении, однако необходимо специальное оборудование, а именно анализатор содержания нефтепродуктов АН-2. Время проведения анализа сокращается до 1 часа. Относительная погрешность четырехкратного определения углеводородов из почвенных и водных объектов составляет 24 % при доверительной вероятности 0,95 согласно руководству по эксплуатации. Погрешность измерений считается удовлетворительной, если составляет 5 < 24 %. В наших экспериментах погрешность метода составила 10-15 %.
На основании данных, полученных с использованием двух физико-химических методов анализа содержания остаточных углеводородов, можно выбрать ассоциации эффективных деструкторов № 2, № 3 и № 4, в состав которых входят три штамма: ассоциация № 2, состоящая из микроорганизмов только рода Rhodococcus, ассоциация № 3 - из микроорганизмов рода Rhodococcus и рода Pseudomonas, ассоциация № 4 -из микроорганизмов рода Rhodococcus и Acinetobacter (рис. 3).
Фракционный анализ остаточной нефти после ее биодеградации различными микробными ассоциациями. Навески проб, полученных экстракцией в ходе весового анализа, диспергировали в гексане и наносили на микроколонки с силикагелем. Применение фракционирования позволяет разделить остаточную нефть на три условные фракции: гексановую - содержит парафино-нафтеновые и ароматические углеводороды; бензольную - полициклические
ароматические углеводороды; спирто-бензольную - нафтеновые кислоты, спирто-бензольные смолы (табл. 6).
Таблица 6
Данные фракционного анализа нефти после ее деградации различныыми ассоциациями микроорганизмов в течение 10 суток при 24 оС
Фракции Масса фракций ( г , %)
Контроль Ассоциа-ция№ 1 Ассоциация № 2 Ассоциация № 3 Ассоциация № 4
Гексановая 0,024± 0,001 47,2% 0,019± 0,002 32,4% 0,016± 0,001 32,4% 0,015± 0,001 29,8% 0,016± 0,001 31,4%
Бензольная 0,009± 0,002 17,2% 0,007± 0,001 13,8% 0,007± 0,001 13,6 % 0,004± 0,001 7,4% 0,007± 0,001 14,2%
Этанол-бензольная 0,005± 0,001 10,8% 0,008± 0,001 16,2% 0,007± 0,001 14,8% 0,015± 0,002 29,6% 0,013± 0,001 25%
На колонке сорбировалось до 25 % нанесенной нефти в случае контроля (среда с нефтью без микроорганизмов), что соответствует полученным раннее данным [2]. Сорбированную на силикагеле фракцию принимали за асфальтены и высокомолекулярные смолистые вещества.
Таблица 7
Убыль фракций нефти по отношению к контролю_
Фракции Убыль франкций нефти, %
Ассоциация № 1 Ассоциация № 2 Ассоциация № 3 Ассоциация № 4
Гексановая 18±4 32±6 37±7 34±6
Бензольная 20±7 21±5 57±5 17±4
Все ассоциации наиболее эффективно утилизировали гексановую фракцию нефти, т.е. в основном потребляли в качестве источника углерода и энергии парафинонафтеновые и моноароматические углеводороды
(гексановая фракция) (см. табл. 7). Убыль данной фракции составила от 18 до 37%. Также эффективно потреблялись соединения бензольной фракции (полициклические ароматические углеводороды), убыль составила 1757 %.
Наиболее эффективной оказалась ассоциация № 3, состоящая из штамма рода Pseudomonas (K3-H) и двух штаммов рода Rhodococcus (Ф2/2-Н4, Ф2/1-Н4), поскольку убыль гексановой и бензольной фракций была максимальна - 37 и 57 %, соответственно.
Штамм Pseudomonas sp. K3-H является эффективным деструктором ароматических и полиароматических соединений (салицилат, генитизат, бензоат, бензол, нафталин, фенантрен, антрацен), а также способен к деградации камфары и гексадекана.
Добавление штамма Pseudomonas putida BS3701 к двум штаммам рода Rhodococcus (Ф2/2-Н4, Ф2/1-Н4) привело к увеличению убыли гексановой фракции в 2 раза, а убыль бензольной фракции - в 3 раза.
Использование жидкостно-адсорбционной хроматографии для фракционирования остаточной нефти позволило оценить спектр потребляемых углеводородов и выбрать микробную ассоциацию №3, состоящую из Pseudomonas sp. (K3-H) и двух штаммов рода Rhodococcus (Ф2/2-Н4, Ф2/1-Н4), эффективно потребляющую как парафино-нафтеновые, так и полициклические ароматические углеводороды.
Таким образом, применение различных физико-химических методов анализа остаточных углеводородов нефти в исследуемых образцах позволило комплексно оценить процесс биодеградации нефти различными микробными ассоциациями и выбрать наиболее перспективную как основу эффективного биопрепарата для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений.
Работа выполнена при поддержке гранта «У.М.Н.И.К.» № 9950ГУ2/2015, Казахстанско-Российского проекта № 142 «Разработка концепции мониторинга загрязненных нефтью почв Приаральского региона и технологий их очистки с использованием новых биопрепаратов», гранта РФФИ 16-05-00617_а.
Список литературы
1. Другов Ю.С. Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов: практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. 270 с.
2. Биодеградация нефтешламов в открытой проточной системе / А.Н. Шкидченко, А.Б. Гафаров, Е.С. Иванова [и др.] // Биотехнология. 2007. Т.6. С.55-59.
3. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // Methods Microbiol. 1970. V. 2. P. 277-327.
4. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. 480 p.
5. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти / И.А. Пырченкова, А.Б. Гафаров, И.Ф. Пунтус [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 3. С. 298305.
6. Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. 254 с.
7. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы -деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наук. думка, 1981. 131 с.
8. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде / Л.М. Барышникова В.Г. Грищенков, М.У. Аринбасаров [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 542-548.
9. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский [и др.] // Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 5. С 917-923.
10. Биодеструкция нефти отдельными штаммами и принципы составления микробных консорциумов для очистки окружающей среды от углеводородов нефти / А.А. Ветрова, А.А. Иванова, А. Е. Филонов [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2013. Вып. 2. Ч.1. С. 241-257.
11. Деградативные свойства микроорганизмов, утилизирующих углеводороды нефти в широком температурном диапазоне / Т.В. Фунтикова, И.Ф. Пунтус, Л.И. Ахметов [и др.] // ActualScience. 2015. Т.1. №3. С. 18-20.
Фунтикова Татьяна Вячеславовна, аспирант, duimo(@,mail.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,
Ломовский Алексей Игоревич, магистрант, gresfers@ya.ru, Россия, Пущино Московской области, Пущинский государственный естественно-научный институт,
Ахметов Ленар Имаметдинович, канд. биол. наук, научный сотрудник, akhmetovscience'arambler.rii, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,
Пунтус Ирина Филипповна, канд. биол. наук, научный сотрудник, puntus66@,mail. ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,
Филонов Андрей Евгеньевич, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, filonov.andrev'a rambler.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,
Нарманова Роза Абдибековна, канд. тех. наук, профессор, roza anatmail.ru, Республика Казахстан, Кызылорда, Кызылординский государственный университет им. Коркыт Ата,
Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, доц., зав. кафедрой, olgaponamoreva'atsii. tula. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
PHYSICAL-CHEMICAL ANALYTICAL METHODS FOR ASSESSING CRUDE OIL BIODEGRADATION PROCESSED BY MICROBIAL ASSOCATIONS
T. V. Funtikova, A.I. Lomovsky, L.I. Akhmetov, I.F. Puntus, A.E. Filonov, R.A.
Narmanova, O.N. Ponamoreva
Degree of oil degradation by different microbial associations was assessed using gravimetry and IR-spectrophotometry methods. The Data obtained by using the methods are similar within error limits. IR-spectrophotometry method is faster but gravimetry is more precise. Monitoring of crude oil hydrocarbons biodegradation may be realized applying both the methods. Fractionation of residual oil by liquid-adsorption chromatography resulted in determining the most efficient association formed from a Pseudomonas sp. strain and two Rho-dococcus ones.
Key words: biodegradation, crude oil, microbial associations, gravimetry, IR spec-trophotometry, liquid-adsorption chromatography
Funtikova Tatyana Vyacheslavovna, PhD student, dujmoatmaiL ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,
Lomovsky Alexey Igorevich, master student, gresfers@ya.ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, Pushchino State Institute for Natural Sciences,
Akhmetov Lenar Imametdinovich, Ph.D. Biol. Sci., Researcher, akhmetovscienceai rambler.rn, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms.,
Puntus Irina Filippovna, PhD Biol. Sci., Research Scientist, puntus66(@,mailru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology ofMicroorganisms,
Filonov Andrey Evgenievich, D. Biol. Sci., Leading Research Scientist, filonov. andrey@rambler. ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,
Narmanova Roza Abdibekovna, PhD Tech. Sci., Professor, roza anai maiLru, the Republic of Kazakhstan, Kyzylorda, Korkyt Ata Kyzylorda State University,
Ponamoreva Olga, D. Chem. Sci., Assoc. Prof., Head of Department, olgaponamoreva@tsu. tula. ru, Russia, Tula, Tula State University
