CC BY
90
УДК 628.543.96
Э. Р. Бабаев (н.с.)
Анализ активности штаммов-деструкторов в отношении нефтезагрязнений почв Апшеронского полуострова
Институт химии присадок им. акад. А.М.Кулиева НАН Азербайджана, лаборатория присадок к смазочно-охлаждающим жидкостям 370000, г. Баку, Беюксорское шоссе, 24; тел. (99412)4938058, e-mail: elbeibabaev@yahoo.de,
samed@consultant.com
E. R. Babayev
The analysis of activity of destructors concerning petropollution
of Apsheron earth
Institute of Chemistry of Additives of A. M. Kuliev NAS of Azerbaijan 2062, Bejukshorskoe Highway, AZI029, Baku, Azerbaijan; ph. (99412)4938058, e-mail: elbeibabaev@yahoo.de, samed@consultant.com
Проведен экспериментальный скрининг активных микроорганизмов-деструкторов углеводородов для очистки нефтезагряненных почв Апшеронского полуострова. Отобраны и изучены 2 аборигенные культуры (К-1 и К-3), выделенные из нефтезагрязненных почв Сураханского месторождения и 4 тестированных штаммов: Pseudomanas fluoreccuses, Mykobacterium, Rhodococcus luteus, Rhodococcus Erythopolis из рабочей коллекции лаборатории ИХП НАНА, способные расти на питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углерода нефтЬ и нефтепродукты. Анализ активности индивидуальных штаммов-деструкторов и их ассоциаций в отношении разложения компонентов нефтезагрязнений в жидкой среде показал, что ассоциация штаммов Pseudomanas fluoreccuses и Rhodococcus Erythopolis, обладая наибольшей деструктивной активностью по отношению к компонентам нефтезагрязнений может использоваться при создании биопрепаратов для борьбы с нефтезаг-рязнениями.
Ключевые слова: деструктивная активность; нефтезагрязнения; штаммы-деструкторы.
Experimental screening of active microorganisms-destructors of hydrocarbons for clearing Apsheron's petropollution earth is carried out. Two native cultures (K-1 and K-3) allocated from petropolluted earth of Surakhanskoe deposits and four tested strains: Pseudomanas fluoreccuses, Mykobacterium, Rhodococcus luteus, Rhodo-coccus Erythopolis from a working collection of laboratory IHP NANA, capable to grow on the nutrient mediums containing as a unique source of carbon of oil and mineral oil are selected and studied. The analysis of activity of individual strains-destructors and their associations concerning decomposition of components in the liquid petropollution has shown, that association strain Pseudomanas fluoreccuses and Rhodococcus Erythopolis, possessing the greatest destructive activity in relation to components of petropollu-tion can be used at creation of biological products for struggle against petropollution.
Key words: destructive activity; petropollution; strains-destructors.
На современном этапе развития общества значительную экологическую опасность для жизни и здоровья людей среди прочих представляют процессы, имеющие отношение к нефти. Начиная от разведки и добычи нефти, и кончая использованием нефтепродуктов, все стадии в той или иной мере приводят к сильному загрязнению окружающей среды и к отрицательному воздействию на здоровье людей. Попадая в почву, нефтепродукты ухудшают общую экологическую обстановку, существенно изменяя агрофизические и агрохимические
Дата поступления 12.02.10
свойства почв. Разложение нефти и нефтепродуктов в почве в естественных условиях — процесс биохимический. Интенсивность деградации нефти находится в прямой зависимости от биологической (ферментативной) активности почвы, общего количества почвенной микрофлоры и ее физиологической активности.
Среди большого разнообразия методов, позволяющих снизить концентрацию нефтяного загрязнения в окружающей среде, наиболее перспективным является микробиологический. Этот метод, основанный на применении активных микробных штаммов, проявляющих спо-
собность расти и использовать в качестве источника углерода и энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов, получил в настоящее время широкое развитие и применение.
Трудно утилизируемые субстраты — это тяжелые фракции нефти и ее компонентов: этанол-бензольные смолы, масла. Степень деструкции этих соединений может варьировать
1
в широком диапазоне .
В условиях природного микробиоценоза наблюдается одновременная ассимиляция разных компонентов нефти различными группами микроорганизмов. Из литературных источников известно, что одними из активных деструкторов этих нефтепродуктов является микроорганизмы, относящиеся к родам Rhodococcus и Pseudomanas 2.
Цель работы — отбор и изучение деструктивной активности углеводородокисляющих микроорганизмов по отношению к нефтезаг-рязнениям почв.
Материалы и методы
Для исследований были отобраны образцы нефтезагрязненных почв на расстоянии 10 м от скважины с территории месторождения Сураханы. Пробы почв отбирались в местах постоянного загрязнения нефтью, представляли собой песчаную почву темного цвета со специфическим запахом нефти. Перед проведением микробиологических и химических анализов нефтезагрязненные почвы гомогенизировали во избежание получения случайных результатов.
Объектом исследований служили штаммы микроорганизмов из рабочей коллекции лаборатории ИХП НАНА: Mykobacterium lactieolum, Pseudomonas fluorecenses, Rhodococcus luteus, Rhodococcus Erythopolis, а также культуры (К-1 и К-3), выделенные из нефтезагрязненных почв Апшеронского полуострова и способные к биотрансформированию нефтепродуктов.
Экстракцию нефти из почвы осуществляли в аппарате Сокслета горячим гексаном. Осаждение асфальтенов из экстрактов исходной нефти проводили 40-кратным по объему количеством петролейного эфира с температурой кипения 40—70 оС. Далее методом жидко-стно-адсорбционной хроматографии с использованием силикагеля фирмы «Chemopol» 40/100 мкм (Чехия) проводили разделение исследуемой нефти на фракции. В качестве элю-ента использовали: гексан, бензол, смесь спирт—бензол (1 : 1).
Культивирование микроорганизмов проводили в жидкой минеральной питательной среде состава (г/л): КН2РО4 — 0.5; К2НРО4 - 0.5; МдБО4 ■ 7Н2О - 0,3; ГвС13 - 0.01; СаС12 — 0.1; ЫаЫОз — 2.5. В качестве единственного источника углерода вносили 1% (по объему) нефти или ее фракции. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл питательной среды, в течение 10 сут при температуре 28 оС на круговой качалке со скоростью 160 об/мин. Инокулирование колб с нефтепродуктами проводили суспензией клеток микроорганизмов (4%). Критерием оптимизации служили: степень деструктивной активности и величина накапливаемой сухой биомассы. Концентрацию бактериальной биомассы определяли весовым методом после неоднократной промывки ее гексаном и сушки до постоянного веса. В качестве контроля использовали колбы со средой и нефтепродуктами без инокуляции микроорганизмами.
Результаты и их обсуждение
Исследования показали, что свойства и состав нефтяных экстрактов, извлеченных из загрязненных почв, заметно отличаются от состава исходной нефти. Возрастает плотность с 0.8468 до 0.8922 г/см3 и выше (табл. 3). Увеличение плотности экстрактов, по сравнению с исходной нефтью, происходит, очевидно, за счет снижения их в составе легких фракций и увеличения доли смолисто-асфальтеновых веществ.
Выбор активного микроорганизма — деструктора углеводородных загрязнений — проводился с учетом того, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Кроме того, управление процессами биодеградации нефти должно быть направлено, прежде всего, на активизацию микробных сообществ, создание оптимальных условий их существования.
Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами 3. К ним относятся всевозможные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют практический интерес как возможный микробный компонент препаратов для очистки почв от нефтяных загрязнений.
Из нефтезагрязненных почв Апшеронско-го полуострова, в результате целенаправленного скрининга изолятов, способных расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода нефть и нефтепродукты, отобрали два (К-1 и К3) наиболее активных штамма микроорганизмов. В работе также исследованы тестированные штаммы рода Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, ранее выделенные из нефте-загрязненных почв Апшеронского полуострова.
С целью выявления наиболее рациональных составов питательных сред для культивирования исследуемых микроорганизмов были изучены следующие составы (г/л):
Среда I (г/л): KH2PO4 - 0.7; MgSO4 ■ 7H2O - 0.8; NH4H2PO4 - 1.5; NaCl - 0.7; вода - 1000 мл.
Среда II (г/л): K2HPO4 - 0.5; KH2PO4 - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O - 0.3; FeCl3 - 0.1; KNO3 - 0.1; NaNO3 - 2.5; NaCl - 0.1; вода 1000 мл.
Среда III (г/л): KH2PO4 - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O - 0.5; FeSO4 - 0.01; NH4Cl - 0.1; KNO3 - 1.0; NaCl - 0.2; вода — 1000 мл.
Таблица 1 Подбор рациональных составов питательных сред
Среда Культура Степень деструкции нефти, % Вес биомассы
I Mycobakterium 17 100
II ............ 20 150
III ............ 18 50
I Pseudomonas flureccenses 30 120
II ............ 65 320
III ............ 40 120
I Rhodococcus Eryhotropolis 42 150
II ............ 48 260
III ............ 46 200
Из данных табл. 1 следует, что для исследуемых культур подходящей является среда II.
Проведены работы по определению деструктивной активности исследуемых культур по отношению к углеводородным фракциям, полученным адсорбционным разделением нефти, выделенной из нефтезагряненных почв Апшеронского полуострова (табл. 2). Исследованные культуры микроорганизмов имеют различную активность в отношении отдельных фракций нефти, выделенной из загрязненных почв. Максимальная степень деструкции достигается у культур Pseudomonas flureccenses —
52%, близкими по активности являются Rhodococcus Eryhotropolis — 48% и отселекти-рованной культуры К-3 — 46 %. Очень пассивной по отношению к нефтепродуктам оказалась культура Mycobacterium (17%).
Смолистые фракции являются наиболее труднодоступными субстратами для биодеструкции. Утилизация бензольных смол наиболее активно происходила при культивировании Pseudomonas flureccenses и составил 21% от исходного содержания субстрата, несколько ниже у Rhodococcus Eryhotropolis (17.5%) и минимальная у Mycobacterium (7.5%).
Активность вышеприведенных микроорганизмов объясняется толерантностью культур данного рода по отношению к нефтезагрязне-ниям.
Сложный химический состав нефти ставит перед необходимостью использования ассоциаций из двух и более штаммов — деструкторов, каждый из которых деградирует определенные углеводороды нефти. Создание эффективной ассоциации предполагает не только наличие активных штаммов-деструкторов, но и изучение вопросов их совместимости в составе ассоциации (табл. 2).
Среди исследованных ассоциаций, состоящих из 2-х штаммов, наиболее эффективными деструкторами нефти оказались ассоциации бактерий (К-3 + Rhodococcus Eryhotropolis) — 62% и (Pseudomonas flureccenses + Rhodococcus Eryhotropolis) — 54%. Следует отметить, что ассоциация К-3 + Rhodococcus luteus несколько более пассивна по отношению к нефти (30%).
Композиции микроорганизмов проявляют различную активность по отношению к фракциям нефти. Полученные данные подтверждают, что в случаях живых организмов свойства целого (ассоциация) не являются простым сложением отдельных единиц (каждого штамма). Кроме того, при создании искусственных ассоциаций нефтедеструкторов необходимо учитывать как экологические, так и трофические (пищевые) свойства каждого штамма.
В табл. 3 представлены данные фракционного состава нефти после ее деструкции. В качестве контроля взята исходная нефть и ее фракции. Также изучена нефть и ее фракции после их биодеградации в жидкой среде. Из данных таблицы следует, что в результате микробного окисления в групповом составе уменьшается доля гексановой фракции и увеличивается количество спирто-бен-зольных смол, что, очевидно, приводит к дополнительной конденсации данных соедине-
Таблица 2
Изменения фракционного состава нефтезагрязнений после деструкции микроорганизмами
Таблица 3
Изменение фракционного состава нефтей после деструкции микроорганизмами
Культура Нефть (из почв) Гексановая фракция Бензольная фракция
Степень Вес Степень Вес Степень Вес
деструкции, % сухой биомассы деструкции, % сухой биомассы деструкции, % сухой биомассы
К-1 35 120 32 96 10 -
К-3 46 150 34 120 18 70
Pseudomonas 52 240 36 160 21 80
flureccenses
Rhodococcus
Eryhotropolis Rhodococcus luteus 48 36 200 140 33,2 28,0 150 120 17,5 13,7 75 60
Mycobakterium 17 10 15 10 7,5 48
Pseudomonas
flureccenses +
Rhodococcus 54 260 36 140 21 75
Eryhotropolis
К-3 + Mycobakterium 20 50 17 10 11 -
К-3 + Rhodococcus 62 270 37 160 22 110
Eryhotropolis
К-3 + Rhodococcus 30 75 24 80 12 100
luteus
№№ Объект исследования Плотность, г/см3 Компонентный состав фракций, %
гексановая бензольная спирто-бензольная
1 Нефть (исходная) 0.8488 41 nD20 1,4880 19.5 nD20 1.5229 10
2 Нефтезагрязнения 0.8922 39 nD20 1,4815 17 nD20 1.5225 12
3 Нефтезагрязнения (после деградации в жидкой среде) 0.8867 34.2 nD20 1,4878 15,3 nD20 1.5010 15
ний и соответствующему увеличению смол и ас-фальтенов.
Проведенное исследование разложения нефтезагрязнений штаммами-деструкторами и их ассоциациями показало высокую избирательную способность микроорганизмов утилизировать различные компоненты нефтепродуктов. Некоторые штаммы показали способность разлагать не только легкие, но и тяжелые фракции нефтезагрязнений. Большую деструктивную активность показали ассоциации, состоящие из двух штаммов: родококк-псевдомонада. Полученные данные свидетельствуют о том, что при создании биопрепаратов для борьбы с нефтезагрязнениями предпочтительно использовать комбинацию микроорганизмов, например, родококков с псевдомонадами.
Учитывая результаты исследований, предложенные ассоциации микроорганизмов-деструкторов (Pseudomonas flureccеnses + Rhodococcus Eryhоtropolis) и (К-3 + Rhodococcus Ery^tropolis) могут быть рекомендованы для применения в составах препаратов в процессах биоремедиации нефтезаг-рязненных почв Апшеронского полуострова.
Литература
1. Кодина Л. А. Геохимическая диагностика нефтяного загрязнения почвы / Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.— М.: Наука, 1988.- С. 112.
2. Белоусова Н. И., Барышникова Л. М. Шкид-ченко А. Н. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Т.38.- № 5.- С. 513.
3. Квасников Е. И., Клюшникова Г. М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах.- Киев: Наукова думка, 1981.- С. 165.
