CC BY
52
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
© ГАРМАЕВА Е.А., НИКОЛАЕВА Г.Г., МАНТАТОВ В.В., ДАРГАЕВА Т.Д., МАРКАРЯН А.А. -
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ «ФИТОПРОСТ»
Е.А. Гармаева, Г.Г. Николаева, В.В. Мантатов, Т.Д. Даргаева, А.А. Маркарян (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ, директор - проф. В.М. Корсунов)
Резюме. Изучен качественный состав сухого экстракта «Фитопрост», идентифицированы флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, фенологликозиды. Разработана методика количественной оценки сухого экстракта по содержанию суммы фенологликозидов.
В настоящее время одной из насущных проблем современной медицины является профилактика и лечение хронического простатита (ХП). В России, данным заболеванием страдают 30-40% мужчин в возрасте 18-80 лет [6,9]. Необходимость профилактики и лечения ХП, поиск путей повышения эффективности фармакотерапии определяются широкой распространенностью и наблюдающейся тенденцией к росту данного заболевания в общей структуре урологических заболеваний.
Современная медицина располагает достаточным количеством препаратов синтетического происхождения с выраженным фармакологическим эффектом, но их длительное применение оказывает побочные эффекты. В случаях, не требующих экстренного вмешательства, все большее значение уделяется фитотерапии простатита [12,16], но работ по фармакотерапии лекарственными растениями простатита мало.
В связи с этим, актуальной задачей является поиск и изучение новых эффективных препаратов, полученных из лекарственного сырья, которые обладают выраженным фармакологическим эффектом и при этом не оказывают побочного действия при их длительном применении. Перспективным направлением в области создания фитопрепаратов является разработка экстракционных препаратов, представляющих собой сумму биологически активных веществ в концентрированном виде и сохраняющие все преимущества растительных лекарственных средств. [7]
Новое растительное средство, биологически активная добавка к пище в виде сухого экстракта «Фитопрост», предназначена для профилактики хронического простатита [13]. Комплексный экстракт разработан на основе тибетской рецептуры и содержит биологически активные вещества из растительного сырья: трава горца птичьего (Polygonum Aviculare L.), листья ортосифона тычиночного (Ortosiphon Stamineus Benth.), листья толокнянки обыкновенной (Artostaphylos Uva-Ursi L.), цветки календулы лекарственной (Calendula Officinalis), корни солодки голой (Glycуrhisa Glabra L.)
По литературным данным было установлено, что в сухом экстракте содержатся полифенольные соединения, которые являются основными действующими веществами растений, относящиеся к классам соединений: органические кислоты, полисахариды, фенологлико-зиды, тритерпены, флавоноиды, дубильные вещества [10,11,14].
Исследованиями, проведенными в Отделе Тибетской медицины Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ), выявлено, что полифитоэкстракт обладает широким спектром фармакологической активности: противовоспалительной, спазмолитической, анальгезирующей, мочегонной, мембраностабилизирующей, антиоксидантной, а также антибактериальным действием [13].
«Фитопрост» обладает направленным действием благодаря преимущественному содержанию в его составе фенольных соединений.
В связи с выше изложенным целью данной работы стало фитохимическое изучение состава и разработка методики контроля качества на полученный сухой комплексный экстракт из чая «Фитопрост». Стандартизация по действующим веществам с помощью физико-химических методов анализа осуществляет контроль на всех стадиях производства и точность дозирования в готовом продукте[15].
Материалы и методы
Материалами для изучения служил сухой экстракт, полученный из чая «Фитопрост» по разработанной методике.
Разделение фенольных соединений проводили двумерной хроматографией на бумаге марки «Filtrak» FN- 16 в системах: 1. 15% уксусная кислота, 2. н-бута-нол-уксусная кислота-вода (БУВ) 4:1:2.
Идентификацию веществ проводили со стандартными образцами. Использовали 0,05% растворы государственных стандартных образцов (ГСО): рутина, кверцетина, апигенина, гиперозида, лютеолина, а также арбутина, галловой, хлорагеновой кислот.
Для характеристики подлинности экстракта применен метод ТСХ на пластинках «Kieselgel 60 F-254 (Merck), в системе этилацетат-метилэтилкетон-муравьи-ная кислота-вода (50:30:10:10). Фронт прохождения растворителей 10 см. Наблюдение в УФ-свете (365 нм) до и после обработки 3 % спиртовым раствором алюминия хлорида, с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при температуре (100-105)°С в течение 2-3 мин.
Для идентификации глицирризиновой кислоты использовали метод тонкослойной хроматографии с прямым сравнением с известным образцом, стандартным раствором глицирризиновой кислоты. Из сухого экстракта готовили извлечение: 1,0 г экстракта помещали в стакан емкостью 100 мл, прибавляли 50 мл
горячего 3% ацетонового раствора трихлоруксусной кислоты. Затем настаивали в течение 20 минут. Раствор остужали и декантировали через складчатый фильтр. Извлечение повторяли дважды, прибавляя при этом 25 мл ацетона. К этому извлечению прибавляли по капле концентрированный раствор аммиака до появления обильного светло-творожистого осадка. Этот осадок переносили через воронку Бюхнера, промывая 50 мл ацетона. Затем осадок перенесли в колбу и растворили в 50 мл 70% спирта этилового.
Исследуемый стандартный растворы наносили капилляром на пластинки и хроматографировали восходящим способом, обнаружена 1 зона с - 0,56 нм, флюоресцирующая синим цветом.
Для обнаружения арбутина использован метод ТСХ на пластинке "БПиЯэР' в системе хлороформ-этанол (7:3) с последующей обработкой хроматограмм 10% водно-спиртовым раствором едкого натра и свежеприготовленным диазореактивом.
При разработке методики количественного определения использован хроматографически чистый стандарт - РСО арбутин.
Приготовление раствора РСО арбутина. Около 0,05 г (точная навеска) РСО арбутина (ТУ 9369-133-1048269298), предварительно высушенного при температуре (72-78)°С в течение 2 часов, растворяют в спирте 96% в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом 96% и перемешивают (раствор А).
1 мл раствора А наносят на колонку с алюминия окисью и элюируют 25 мл спирта 60% в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят спиртом 60% до метки и перемешивают (раствор Б).
Определение суммы фенологликозидов.
Около 0,2 г (точная навеска) сухого экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в 30 мл теплой воды (40-50)°С, прибавляют 15,5 мл спирта 96%, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).
1 мл раствора А наносят на колонку, заполненную алюминия окисью, и элюируют 25 мл спирта 60% со скоростью 4 мл /мин. Раствор собирают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят спиртом 60% до метки и перемешивают (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность раствора Б на саморегистрирующем спектрофотометре «ГЕЛИОС» при длине волны 284 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм (рис.1, 2). В качестве раствора сравнения используют спирт 60%. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Б РСО арбутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Результаты и обсуждения
Методом двумерной хроматографии флавоноидные соединения обнаруживают по их собственной флуоресценции в фильтрованном УФ-свете (зоны адсорбции от бледно-желтого до коричневого цвета). После проявления хроматограмм 3% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревании в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 2-3 мин флуоресценция зон усиливается и зоны флавоноидного характера приобретают ярко желтый, зеленовато-желтый цвет. В УФ-свете зоны адсорбции фенолкарбоновых кислот имеют голубую флуоресценцию. После обработки хроматограмм в парах аммиака окраска зон
становится ярко-голубой. С помощью тонкослойной хроматографии в сухом экстракте «Фитопрост» было подтверждено наличие флавоноидов: кверцетина, рутина, апигенина, лютеолина; фенолкарбоновых кислот: галловой и хлорагеновой; фенологликозидов: арбутина; глицирризиновой кислоты.
УФ - спектр поглощения
Nm A
284.0 0.424
Рис. 1. УФ-спектр РСО арбутина в спирте 60 %.
Содержание суммы фенологликозидов (Х) в процентах в пересчете на арбутин и абсолютно сухое вещество в экстракте рассчитывают по формуле:
X = д'50'25-"0 •'100 .100% D0 • m • 1 • 50 • 25 • (100 - W)
где D - оптическая плотность испытуемого раствора, Do _ оптическая плотность раствора РСО арбутина, m - масса экстракта в граммах, mo - масса РСО арбутина в граммах, W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.
Таким образом, результаты проведенного качественного анализа подтвердили предполагаемое наличие в комплексном сухом экстракте «Фитопрост» флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, тритерпенов, фенологликозидов, глицирризиновой кислоты, органических кислот.
Предложен хроматоспектрофотометрический метод определения фенологликозидов в сухом экстракте «Фитопрост». По разработанной методике проведен количественный анализ шести серий препарата, полученных на оборудовании экспериментального завода НПО «ВИЛАР». Содержание суммы феноло-гликозидов в сухом экстракте в пересчете на арбутин-стандарт регламентируется не менее 1,59%.
Для стандартизации препарата предложено использовать ТСХ и УФ-спектр поглощения препарата в спирте 60 % при длине волны 284±2 нм. Методика спектрофотометрического определения
фенологликозидов в сухом экстракте характеризуется специфичностью, высокой точностью, малой трудоемкостью.
THE PHYTOCHEMICAL STUDY AND STANDARDIZATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVE
ADDITION «PHITOPROST»
E.A. Garmaeva, G.G. Nikolaeva, V.V. Mantatov, T.D. Dargaeva, A.A. Markaryan (Institute of General and Experimental Biology SD RAS, Ulan-Ude)
Studied are the qualitative composition of dried extract «Phitoprost», identified flavonoids, fenolcarbonic acids, fenologlicozids. The method of quantitative analysi of dried extract on the content of fenologlicozids in presented.
ЛИТЕРАТУРА
1. Максютина Н.П., Литвиненко В.И. Методы выделения и исследования флавоноидных соединений. // Фенольные соединения и их биологические функции. - М.: Наука, 1968.-С.7-26.
2. Азизов И.К. Анализ и контроль качества лекарственных веществ с использованием спектральных методов анализа в видимой области спектра: Дисс... докт. фарм. наук. - М., 1993. - 222 с.
3. Беликов В.В., Точкова Т.В., КолесникН.Т. Некоторые особенности спектрофотометрического метода анализа флавоноидных соединений. // Тезисы докладов IV съезда фармацевтов. - Казань, 1986. -С.514-515.
4. Георгиевский В.П., Казаринов Н.А., Каррыев М.О. Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения. -Ашхабад, 1976. - 239 с.
5. Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. В трех томах. М.,2001.-Т.1.-350 с., Т 11-764 с.-2002, ТШ.-216 с.
6. Кан Д.В., Сегал А.С., Козьменко А.П. Диагностика и лечение хронического простатита: Методические рекомендации. - М., 1980. - 30 с.
7. Кравченко Н.В. О возможности замены лекарственных чаев аналогичными по составу суммарными препаратами. // Сб.тез.докл.Ш
Всесоюз. съезда фарм-тов. - Свердловск, 1975. -С.151-152.
8. Краснов К.А., Березовская Т.П., Алексюк Н.В. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. - Томск, 1987. - 184 с.
9. Кругляк Л.Г. Простатит. - Элиста, 1996. - 64с.
10. Лекарственные растения Бурятии. - Улан-Удэ, 1974.
- 207 с.
11. Лекарственные растения Государственной фармакопеи: Фармакогнозия. /И.А. Самылина, В.А Северцев, А. А. Сорокина, В. А. Ермакова и др. - М.: АНМИ, 2003. - 534 с.
12. Мамчур Ф.И., Кушнирук Ю.И. Фитотератия в комплексном лечении половых расстройств у мужчин. - Киев, 1992. - 144 с.
13. Мантатов В.В. Влияние комплексного средства «Фитопрост» на течение экспериментального хронического простатита: Дисс. ... канд. биол. наук.
- Улан-Удэ, 1999. - 20 с.
14. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник.-4-е изд., перераб. и доп. -М.: Медицина, 2002. - 656 с.
15. Настои, экстракты, эликсиры и их стандартизация /Под ред. Багировой В.Л., Северцева В.А. - С-Пб., 2001. - С.129-147.
16. Суворов А.П., Тюренков И.Н., Богословская С.И. и др. Фитотерапия воспалительных заболеваний мочеполовой системы. - Саратов, 1994 .- 39 с.
© ЧХЕНКЕЛИ В.А., ШКИЛЬ Н.А. -
ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БАЗИДИОМИЦЕТА CORIOLUS PUBESCENS (SHUM.:FR.) QUEL. И ПРЕПАРАТА, ПОЛУЧАЕМОГО НА ЕГО ОСНОВЕ
В.А. Чхенкели, Н.А. Шкиль (Иркутский филиал института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН, г. Иркутск,
директор - д.в.н., А.С. Донченко)
Резюме. При экспериментальном моделировании туберкулезной инфекции установлено, что антимикробный препарат «Леван-2», полученный на основе базидиального гриба Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. с использованием современных методов биотехнологии, обладает противотуберкулезной активностью в дозе 2,0 мл/кг массы тела при введении внутримышечно. Монотерапия препаратом приводит к излечению животных и увеличению массы их тела. Активность препарата сравнима с активностью широкоизвестных туберкулостатиков (изониазида). Ключевые слова. Базидиомицеты, биотехнология, модель, противотуберкулезная активность.
Расширение применения препаратов, получаемых с использованием современных методов биотехнологии в медицине и ветеринарии, создает необходимость изучения их фармакокинетических свойств, способов, доз и кратности их введения. Не является исключением в этом отношении и антимикробный препарат «Леван-2», разработанный на основе штамма Сопо1ш риЬе8сеш
(Shum. :Fr.) Quel. 0663 и, обладающий широким спектром действия. Ранее нами были проведены исследования антимикробной активности препарата на референтных штаммах микроорганизмов и на штаммах, выделенных от больных животных из хозяйств Иркутской области (родов Salmonella, Escherichia, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter,
