CC BY
118
УДК 615.011.5-451.16
О.В. Нагаслаева, Г.Г. Николаева, В.Б. Хобракова
определение фенольных соединений полиэкстракта «иммунополифит»
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ)
Изучен качественный состав сухого полиэкстракта «Иммунополифит»; идентифицированы флавоноиды, фенилпропаноиды (гидроксикоричные кислоты). Разработаны, методики, стандартизации сухого полиэкстракта по содержанию суммы, флавоноидов и фенилпропаноидов.
Ключевые слова: полиэкстракт «Иммунополифит», фитохимическое изучение
DEFINING pHENoL compounds oF poLYExTRAcT «iMMuNopoLYFYT»
O.V. Nagaslayeva, G.G. Nikolayeva, V.B. Khobrakova
Institute of General and Experimental Biology SB RAS (Ulan-Ude)
The qualitative structure of a dry polyextract «Immunopolyfyt» is studied; flavоnoids, phenilpropanoids (hy-droxycinnaroic acids) are identified. Techniques of standardization of a dry polyextract by the sum. content of flavоnoids and phenilpropanoids are developed.
Key words: polyextract «Immunopolyfyt», phytochemical studying
В последние годы возрос интерес к лекарственным растениям, обладающими иммуномодулирующими свойствами [3, 9]. Значительное число врожденных и приобретенных заболеваний человека сопровождается нарушением функций иммунной системы [5]. Поэтому создание новых иммунопрепаратов, оказывающих лечебное и профилактическое действие, является одной из основных задач современной фитотерапии.
Полиэкстракт «Иммунополифит» сухой изготавливается на основе растительной композиции, состоящей из корней солодки и вздутоплодника, плодов лимонника и шиповника, травы горца птичьего и пустырника, семян льна, цветков календулы [2, 8]. По данным литературы было установлено, что в 8-компонентной растительной композиции (8-КРК) содержатся фенольные соединения (дубильные вещества, флавоноиды, фенилпропанои-ды), которые являются основными действующими веществами растений [7]. Исследованиями, проведенными в лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ (зав. лаб. проф. С.М. Николаев), выявлено, что полиэкстракт «Иммунополифит» сухой обладает направленным иммуномодулирующим действием [10] благодаря преимущественному содержанию в его составе фенольных соединений.
Цель настоящего исследования — разработка методик количественного определения флавоноидов и фенилпропаноидов в полиэкстракте «Иммунополифит», стандартизация по действующим веществам с использованием спектрофотометрии [1].
материалы и методы
Материалами для изучения служил сухой полиэкстракт, полученный путем последовательного экстрагирования 8-компонентной растительной композиции несколькими растворителями по разработанной методике [4].
Разделение фенольных соединений проводили двумерной хроматографией на бумаге марки «РД1так»
Б№12 и Б№16 в системах: 1. 15% уксусная кислота, 2. н-бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) 4:1:2.
Метод ВЭЖХ был использован при изучении флавоноидов и гидроксикоричных кислот полиэкстракта сухого. Разделение проводили на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» на колонке (2 х 75 мм), упакованной сорбентом «Nucleosill 100-5, С18», с эффективностью равной 5000 т.т. по пику хризена (к' = 10) с компьютерной обработкой данных. Флавоноидные гликозиды и их агликоны (лютеолин, мирицетин, гиперозид и рутин) определяют при градиентном режиме хроматографии. Градиентное элюирование осуществляют смешиванием двух элюентов:
• элюент А — смесь водного раствора фосфата калия (КН2РО4, 0,05 М, рН = 3,0) и ацетонитрила в соотношении 95 : 5 (об/об);
• элюент В — метанол. Градиент элюента В от 15 % до 70 % за 23,3 мин, при расходе элюен-тов 0,15 мл/мин. Объем вводимой пробы 2 мкл. Температура колонки 50 °С. УФ-детектирование осуществляют при 3 длинах волн одновременно: 280, 330 и 350 нм.
Галловую, кофейную, коричную кислоты определяют в градиентном режиме элюирования: градиент элюента В от 0 до 65 % за 22,7 мин, при расходе элюентов 0,15 мл/мин. Детектирование при 272, 300 и 322 нм.
Пики на хроматограммах идентифицируют по двум параметрам: время удерживания (у и интегральное спектральное отношение (Я). Значения Я рассчитывают как отношения площадей пиков, зарегистрированных на использованных длинах волн детектирования.
Для характеристики подлинности полиэкстракта применен метод ТСХ: для идентификации гиперо-зида на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ-254» (10 х 15 см) в системе растворителей «н-бутанол — уксусная кислота — вода» (4:1:2). Фронт прохождения растворителей около 13 см. Наблюдение в УФ-свете
(365 нм) до и после обработки 3% спиртовым раствором алюминия хлорида, с выдерживанием 2 — 3 мин в сушильном шкафу при температуре 100 °С.
Для обнаружения кофейной кислоты на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (5 х 10 см) в системе растворителей «хлороформ — этиловый эфир уксусной кислоты — муравьиная кислота» (5:4:1). Когда фронт растворителей дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры и сушат на воздухе в течение 10 мин.
Количественное определение суммы флаво-ноидов проведено методом дифференциального спектрофотометрирования. Сумму фенилпропа-ноидов определяли методом прямого спектрофо-тометрирования [6].
результаты и обсуждение
Методом двумерной хроматографии флавоно-идные соединения обнаруживают по их собственной флуоресценции в УФ-свете (зоны адсорбции от бледно-желтого до коричневого цвета). После проявления хроматограмм 3% спиртовым раствором хлорида алюминия и нагревании в сушильном шкафу флуоресценция зон усиливается, и зоны флавоноидного характера приобретают яркожелтый и желтовато-зеленый цвета. В УФ-свете зоны адсорбции гидроксикоричных кислот имеют голубую и фиолетовую флуоресценцию. После обработки хроматограмм в парах аммиака окраска зон адсорбции кофейной — ярко-голубая, галловой
— темновато-фиолетовая. При этом обнаружено 26 зон, из них 15 отнесено к веществам флавоноидного характера, 5 — к фенолкарбоновым кислотам. По значениям Rf и окраске пятен на хроматограмме со свидетелями идентифицированы: гиперозид Rf-0,34 (система 1), Rf-0,59 система (2); рутин Rf-0,48 (1), Rf-0,51 (2); лютеолин Rf-0,08 (1), Rf-0,81 (2); мирице-тин Rf-0,05 (1), Rf-0,65 (2); галловая Rf-0,44 (1), Rf-0,79 (2) и кофейная Rf-0,27 (1), Rf-0,75 (2) кислоты.
С помощью тонкослойной хроматографии в сухом полиэкстракте «Иммунополифит» было подтверждено наличие флавоноидов. На уровне пятна-свидетеля должно обнаруживаться доминирующее желтое пятно гиперозида : Rf-0,59. Допускается наличие других пятен флавоноидов c Rf-0,83 — лютеолина, Rf-0,50 — рутина; гидроксикоричных кислот: с Rf-0,87 — кофейной кислоты.
Методом ВЭЖХ обнаружены: гиперозид, рутин, лютеолин, мирицетин (табл. 1, рис. 1); галловая, коричная, кофейная кислоты (табл. 2, рис. 2).
Для стандартизации полиэкстракта разработана методика определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием реакции комплексообразова-ния со спиртовым раствором алюминия хлорида. Максимум поглощения комплекса гиперозида с алюминия хлоридом имеет значение близкое максимуму комплекса, образуемого полиэкстрактом с тем же комплексообразователем (рис. 3). Навеску, соотношение сырья и экстрагента, аликвоту подбирали экспериментально. Также были изучены
оптимальные условия проведения фотометрической реакции комплексообразования (табл. 3).
Таблица 1
Время удерживания и спектральные отношения флавоноидных гликозидов и их агликонов на хроматограмме полиэкстракта (градиентное элюирование)
Соединение tR, мин R = S330/S350
Гиперозид 9,30 ± 0,09 1,63 ± 0,09
Рутин 9,52 ± 0,10 0,82 ± 0,05
Мирицетин 11,34 ± 0,11 0,98 ± 0,05
Лютеолин 15,22 ± 0,15 0,85 ± 0,05
Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ полиэкстракта «Иммунополифит» сухого.
Таблица 2
Время удерживания и спектральные отношения гидроксикоричных кислот на хроматограмме стандартной смеси и полиэкстракта (градиентное элюирование)
Кислота Время удерживания, мин Спектральные отношения А272/А300
галловая 2,25; 2,25* 0,38; 0,34*
кофейная 7,82; 7,90* 3,16; 2,93*
коричная 18,15; 18,20* 0,46; 0,51*
примечание: * - значения, соответствующие пикам в образце полиэкстракта.
Хроматограмма раствора экстракта «0» (увеличенный фрагмент)
Рис. 2. Хроматограмма ВЭЖХ полиэкстракта «Иммунополифит» сухого.
Таблица 3
Условия проведения реакции комплексообразования
Концентрация раствора AICI3, %
1 2 3 4 5 6
Оптическая плотность, нм
0,243 0,255 0,261 0,264 0,266 0,266
Количество 5% раствора AICI3, мл
1 2 3 4 5 6
Оптическая плотность, нм
0,262 0,271 0,276 0,274 0,275 0,273
Name Peaks(nm) Abs(AU)
1 giperozid +AlCl3 415.0 0.67455
2 polyextract +AlCl3 411.0 0.34622
Рис. 3. Дифференциальные спектры поглощения комплексов растворов полиэкстракта сухого и ГСО гиперозида.
Установлено, что максимальная оптическая плотность достигается при использовании З мл извлечения с З мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида. Устойчивое окрашивание извлечений из полиэкстракта сухого с хлоридом алюминия наступает через З5 — 40 мин и сохраняется в течение 2 часов.
На основании результатов проведенных исследований нами разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в полиэкстракте сухом.
Методика 1
Около 0,З г (точная навеска) сухого полиэкстракта помещают в стаканчик, приливают ЗО мл спирта 7О%, растворяют при слабом нагревании, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора спиртом 70% до метки. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). З мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют З мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора спиртом 70 % до метки и перемешивают (раствор Б).
Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 41З нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор,
состоящий из З мл раствора А, 1—2 капель 1% уксусной кислоты помещенного в мерную колбу вместимостью 25 мл и доведенного спиртом 70% до метки.
Параллельно, в тех же условиях, измеряют оптическую плотность раствора Б ГСО гиперозида, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид и абсолютно сухое вещество (Х) в процентах вычисляют по формуле:
х_ Dx50x25xm0xlxl00x 100 _ Dx50xm0xl00
"" D0xmx3xlOOx25 (100-W) _ D0xmx3x(100-W) ,
где: D — оптическая плотность испытуемого раствора, D0 — оптическая плотность раствора ГСО гиперозида, m — масса полиэкстракта в граммах, m0 — масса ГСО гиперозида в граммах, W — потеря в массе при высушивании полиэкстракта в процентах.
Среди производных гидроксикоричных кислот исходной композиции доминирующим компонентом является кофейная кислота. Были изучены оптимальные условия экстракции и возможность использования прямой спектрофотометрии без предварительной очистки суммы фенилпропаноидов. Максимумы поглощения кофейной кислоты и суммы фенилпропаноидов полиэкстракта сухого находятся в одной области (рис. 4).
Name Peaks(nm) Abs(AU)
1 Kofein.k-ta st. 323.0 0.63073
2 polyextract 320.0 0.40868
Рис. 4. Дифференциальные спектры поглощения комплексов растворов полиэкстракта сухого и ГСО гиперозида.
Таблица 4
Метрологические характеристики методик количественного определения фенольных соединений в полиэкстракте «Иммунополифит» ^ = 6, P = 95 %, t(P,f) = 2,45)
Содержание: X S2 S A x E, %
флавоноиды 2,14 1,13x10-3 3,36x10-2 8,24x10-2 ± 3,85
фенилпропаноиды 4,16 2,24x10-3 4,74x10-2 1,16x10-1 ± 2,79
Методика 2
Около 0,1 г (точная навеска) сухого полиэкстракта, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл спирта 40%, доводят объем раствора спиртом 40% до метки. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 1,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом 40% до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 322 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт 40%. Параллельно, в тех же условиях, измеряют оптическую плотность
0,02% раствора РСО кофейной кислоты, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту и абсолютно сухое вещество (Х) в процентах вычисляют по формуле:
Dx50x25xm„ xlxlOO 100 Dx50xm0xl00
—-----------------X-------—----------------- ,
D0xmxl,5x100x25 (100-W) D0 xmxl,5x(100-W)
где: D — оптическая плотность испытуемого раствора, D0 — оптическая плотность раствора РСО кофейной кислоты, m — масса полиэкстракта в граммах, m0 — масса РСО кофейной кислоты в граммах, W — потеря в массе при высушивании полиэкстракта в процентах.
С целью доказательства достоверности разработанных методик было проведено определение содержания суммы флавоноидов и фенилпропа-ноидов на одной серии полиэкстракта сухого в 7 независимых повторностях (табл. 4).
Данные таблицы свидетельствуют о том, что единичная ошибка методик с 95% вероятностью не превышает ± 4 % и ± З %.
По разработанным методикам проведен количественный анализ пяти серий полиэкстракта сухого, полученных по лабораторному регламенту.
Содержание суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в иммунополифите регламентируются не менее 1 % и З % соответственно.
выводы
1. Изучен состав фенольных соединений полиэкстракта «Иммунополифит» сухого методом ТСХ и ВЭЖХ; обнаружены рутин, гиперозид, лю-теолин, мирицетин; галловая, коричная, кофейная кислоты.
2. Разработаны методики количественного определения в полиэкстракте «Иммунополифит» сухом суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид и суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту спектрофотометрическим методом.
3. Установлено, что содержание суммы флавоноидов составляет 1,55 — 2,21 %; суммы фенилпропаноидов — З,54 — 4,25 %.
литература
1. Багирова В.Л. О стандартизации лекарственных средств на современном этапе / В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева, Н.П. Садчикова // Хим.- фарм. журнал. - 2000. - № 11. - С. 46-47.
2. Государственная фармакопея СССР, 11-е изд., Вып. 2. - М. : Медицина, 1989. - 400 с.
3. Иммуномодуляторы растительного происхождения (обзор) / А.Д. Бакуридзе [и др.] // Хим.-фарм. журнал. - 199З. - Т. 27, № 8. - С. 4З-47.
4. Каухова И.Е. Новая методика получения растительных препаратов / И.Е. Каухова // Фармация.
- 2006. - Вып. 1. - С. З7 — З9.
5. Ковальчук Л.В. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека на современном этапе / Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев // Иммунология. - 1990. - № 5. - С. 4-7.
6. Количественное определение суммы гидрок-сикоричных кислот в надземной части Echinacea purpurea(L.) Moench / В.А. Куркин [и др.] // Раст. ресурсы. — 1998. — Т. З4, Вып. 2. — С. 81—85.
7. Ловкова М.Я. Почему растения лечат / М.Я. Ловкова, А.М. Рабинович, С.М. Пономарев. — М. : Наука, 1990. — 256 с.
8. Нагаслаева О.В. Пути поиска лекарственных растений с иммуномодулирующими свойствами / О.В. Нагаслаева, В.Б. Хобракова, И.Г. Николаева // Вестник Бурятского университета. Серия 11; Медицина. — Вып. 3. — Улан-Удэ: Изд-во Бурятского госуниверситета, 2003. — С. 179—188.
9. Николайчук Л.В. Как повысить ваш иммунитет с помощью растений / Л.В. Николайчук, Э.В. Николайчук. — Ростов на/Д: Феникс, 2005. — 224 с.
10. Хобракова В.Б. Иммуномодулирующие свойства сухого экстракта «Иммунополифит» / В.Б. Хобракова, О.В. Нагаслаева // Сибирский медицинский журнал. — 2006. — Т. 63, № 5. — С. 72-74.
Сведения об авторах:
Нагаслаева Ольга Васильевна - младший научный сотрудник, к.фарм.н. 670047, г. Улан-Удэ, ул. М. Сахьяновой, д. 6, ИОЭБ СО РАН, лаб. мед.-биол. исследований. Д. тел. 8 (3012) 433746
Николаева Галина Григорьевна - ведущий научный сотрудник, д.фарм.н., 670047, г. Улан-Удэ, ул. М. Сахьяновой, д. 6, ИОЭБ СО РАН, лаб. мед.-биол. исследований
Хобракова Валентина Бимбаевна - старший научный сотрудник, к.б.н., 670047, г. Улан-Удэ, ул. М. Сахьяновой, д. 6 ИОЭБ СО РАН, лаб. экспериментальной фармакологии
