CC BY
62
волнистые, с умеренно выраженным соединительнотканным каркасом и отчетливо дифференцируемыми клеточными элементами эндомизия (рис. 1).
Мышечные волокна свинины 3-й группы (МЭК-СХ-3) также находятся в различном функционально-морфологическом состоянии (рис. 2). Основная их часть характеризуется широкоамплитудной волнистостью, остальные имеют спрямленную форму. В большинстве мышечных волокон поперечная исчер-ченность отчетливо выражена. Фрагментарно выявляются волокна с признаками созревания мяса - появлением поперечных разрывов. Ядра хорошо прокрашиваются и характеризуются отчетливым хроматином. В значительно большем количестве массы они располагаются вблизи сарколеммы. Соединительнотканные прослойки волнистые, плотно прилегают к пучкам мышечных волокон, развиты несколько слабее, чем в других группах животных.
Таким образом, исследование химического состава и микроструктурный анализ мяса свиней крупной белой породы свидетельствует о возможности использо-
INFLUENCE OF ENZYME PREPARATIONS IN FORAGE ON CHEMICAL COMPOSITION OF PORK
A.V. GIRO
Saratov State Agricultural University by name of N.I. Vavilov,
1, Teatralnayapl., Saratov, 410012;ph.: (8452) 65-60-29, e-mail: giroannasgau@gmail.com
On the basis of researches of chemical, fatty-acid composition and the microstructural analysis of meat of pigs of large white breed use possibility in their ration of enzyme preparations of Rovabio and MEK-SH-3 for the purpose of meat food value increase is established.
Key words: fattening ration of pigs, chemical composition of pork, multienzyme MEK-SH-3, enzyme Rovabio XL z.
Рис. 2
вания в их рационе добавок ферментных препаратов Ровабио и МЭК-СХ-3 с целью повышения пищевой ценности мяса.
Поступила 30.12.11 г.
664.137:576.08:577.152.3
ДЕЙСТВИЕ ПИЩЕВОЙЛАКТУЛОЗЫIN VITRO НА МЕМБРАНУ И АКТИВНОСТЬ NA/K-АТФАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ
P.O. БУДКЕВИЧ, И.А. ЕВДОКИМОВ
Северо-Кавказский государственный технический университет,
355029, г. Ставрополь, пр-т Кулакова, 2; факс: (865) 223-58-34, электронная почта: eia@ncstu.ru, budkev@mail.ru
Исследовано влияние лактулозы в эксперименте in vitro на мембрану эритроцитов с использованием атомно-силовой микроскопии и биохимических методов. Показано, что лактулоза может напрямую влиять на состояние эритроцитов in vitro, изменяя структуру поверхности мембраны, и повышать активность Na/K-АТФазы.
Ключевые слова: лактулоза, эритроциты, Na/K-АТФаза, атомно-силовая микроскопия, олигосахариды, дисахариды.
Лактулоза - углевод, относящийся к классу олиго- ния дисбиотических явлений. Как наиболее изученная
сахаридов и подклассу дисахаридов, его молекула со- в плане медицинского применения, лактулоза стала
стоит из остатков галактозы и фруктозы. Лактулоза классическим средством воздействия на метаболизм
представляет собой белое кристаллическое вещество, микрофлоры кишечника. Многие продукты лечебного
не имеющее запаха, хорошо растворимое в воде и слад- и функционального назначения содержат лактулозу
кое на вкус. Являясь признанным бифидус-фактором, [1]. Механизм ее влияния на организм связывают с ро-
лактулоза широко используется во многих странах ми- лью бифидобактерий в сохранении здоровья человека
ра как профилактическое и терапевтическое средство [2]. Однако этот механизм полностью не объясняет воз-
при ряде заболеваний, особенно в случае формирова- действия лактулозы.
В экспериментах на крысах показано, что лактулоза снижает устойчивость к кишечной инфекции, вызванной сальмонеллой. Вероятно, стимуляция эндогенных лактобацилл и бифидобактерий не является гарантией улучшения защиты организма от кишечных инфекций [3]. Клинические исследования ставят под сомнение развитие дисбактериоза и, как следствие, роль бифидобактерий. Предполагается, что главную роль играет состояние организма, обусловливающее способность мембран эпителия к адгезии определенных микроорганизмов [4]. Не исключается и прямое воздействие пищевой лактулозы на мембраны клеток млекопитающих, но этот вопрос практически не изучен. В литературе есть данные о влиянии хитоолигосахаридов на мембраны эритроцитов [5], что позволяет предположить возможность действия лактулозы на мембрану. Вероятно наличие прямого контакта молекул лактулозы с эритроцитами, исходя из проницаемости кишечника. Даже у здоровых людей кишечник способен слабо пропускать данные молекулы. Так, употребление сиропа в дозе 325 мг/кг повышает концентрацию лактулозы в крови до 10 мг/мл уже через 2 ч. Через 8 ч ее уровень снижается в 3 раза. Однако при патологии кишечника барьерная функция нарушается, и лактулоза напрямую проникает в кровоток, достигая уровня более 20 мг/мл [6].
Цель данного исследования - оценка влияния лактулозы в эксперименте in vitro на мембрану эритроцитов по данным атомно-силовой микроскопии (АСМ) и по активности Na/K-АТФазы.
В опытах использовали кровь белых крыс (Вистар). В работе с животными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964, 2000 ред.). Кровь получена из хвостовой вены под легким эфирным наркозом в пробирку с гепарином. Для проведения АСМ эритроциты отмывали 4 раза физиологическим раствором, разбавляя в 10-15 раз. Центрифугирование осуществляли при 3000 об/мин в течение 15 мин. Готовили суспензию эритроцитов из 0,1 мл осадка эритроцитов и 0,9 мл физиологического раствора с концентрацией лактулозы в каждой пробе 5 мг/мл, исходя из концентрации лактулозы, представленной производителем. Инкубировали пробы 15 мин при 37°С без добавления (контроль) и с добавлением лактулозы. В 1-й пробе добавляли сухой препарат фирмы Иналко (Италия) с содержанием лактулозы 98% (Л1). Во 2-й пробе - препарат Лазет (ООО «Шехонь-Лактулоза», Россия) с содержанием лактулозы 41% (Л2). В 3-й пробе - концентрат пищевой лактулозы ТУ BY 100377914.512-2008 (Беларусь) с содержанием лактулозы 34% (Л3). Центрифугированием отделяли эритроциты, осадок разводили 2,5%-м раствором глутаро-вого альдегида на физиологическом растворе. Взбалтывали 20-30 с каждую пробирку и каплю наносили на стеклянную подложку. На последнем этапе в центрифужную пробирку помещали стеклянную подложку и проводили центрифугирование при 1500 об/мин в те-
чение 3 мин. Затем подложку высушивали при комнатной температуре на воздухе. Этот способ позволил получить равномерный монослой эритроцитов, прочно закрепленных на подложке. Сканирование проводили с использованием стандартных зондов в полуконтакт-ном режиме на серийном атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА (ЫТ-МБТ, Россия). Активности Ка/К-АТ-Фазы определяли в цельных эритроцитах крысы, как описано в [7]. По данной методике отмывали эритроциты дважды - до и после обработки лактулозой по описанной выше схеме. Затем проводили преинкуба-цию эритроцитов с твином-20 и оценивали активность Ка/К-АТФазы на 1 мл эритроцитов. Полученные данные обрабатывали с использованием пакета 81а11$Иса 6.0 [8]. Для оценки вариационных рядов и анализа соответствия видов распределения использовали критерий Шапиро-Вилкса. В работе данные представлены как медиана (Ме) и интерквартильный размах - значения 25-го и 75-го процентилей. Для сравнения применялся критерий Манна-Уитни.
Сканирование контрольных проб показало закономерную топографию эритроцитов крыс, получаемых с использованием АСМ, представлявших вогнутые структуры (дискоциты) с углублением в центре 0,3-0,6 мкм и возвышениями на краях 1,2-2,5 мкм. Следует отметить расхождение получаемых размеров эритроцитов в сравнении с оптическими методами и в зависимости от режима сканирования [9]. Во всех случаях контрольные эритроциты представляли относительно гладкую поверхность. Активности Ка/К-АТФа-зы эритроцитов соответствовали литературным данным [7] и были на уровне 22,9 (22,18; 24,3) мкмоль/мл эритроцитов.
Судя по результатам АСМ, обработка эритроцитов в среде с лактулозой изменила поверхность мембраны (рис.1).
Оценка морфологии поверхности с использованием АСМ выявила шероховатость, состояние которой зависело от производителя лактулозы. После обработки Л1 частицы на поверхности эритроцитов представлены структурами размером 0,2-0,5 мкм, а при воздействии Л2 - менее 0,3 мкм. Раствор с Л3 вызывал появление наименьших по размеру структур на поверхно-
Рис. 1
контроль Л1 J12 ЛЗ
Рис. 2
сти клеток - около 0,1 мкм. Аналогичная шероховатость наблюдалась при обработке мембраны эритроцитов хитоолигосахаридами [5]. Следовательно, кратковременная обработка лактулозой вызывает изменение поверхности мембраны эритроцита, причем размер частиц на поверхности мембран зависит от производителя пищевой лактулозы.
Активность Ка/К-АТФазы эритроцитов после воздействия лактулозы увеличивалась во всех случаях действия олигосахарида по сравнению с контролем (рис. 2: * - статистически значимые отличия от контроля, # - статистически значимые отличия с Л1). Изменения характеризовались ростом активности фермента в инкубационной среде в соответствии с образцом добавленной лактулозы (Л1 - Л2 - Л3). Следует отметить достоверный рост ферментативной активности при воздействии Л3 по сравнению с Л1. Выявляется зависимость между активностью фермента и величиной шероховатости после обработки лактулозой. Вероятно, наличие крупных частиц на поверхности мембраны снижает активность фермента. Аналогичные данные в литературе не обнаружены. Есть указание на защитное действие лактулозы, предупреждающее повреждение ДНК при воздействии гентоксичным препаратом [10].
Таким образом, лактулоза может напрямую влиять на состояние эритроцитов in vitro, изменяя структуру поверхности мембраны, и повышать активность Na/K-АТФазы. После обработки эритроцитов латуло-зой наблюдается шероховатость мембраны, увеличение которой снижает активность Na/K-АТФазы, величина шероховатости зависит от производителя лактулозы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лактоза и ее производные / Б.М. Синельников, А.Г. Храмцов, И.А. Евдокимов и др. - СПб.: Профессия, 2007. - 768 с.
2. Panesar P.S., Kumari S. Lactulose: Production, purification and potential applications // Biotechnol. Adv. - 2011. - Aug. 12.
3. Bovee-Oudenhoven I.M., ten Bruggencate S.J., Lettink-Wissink M.L., Van der Meer R. Dietary fructo-oligosaccharides and lactulose inhibit intestinal colonisation but stimulate translocation of salmonella in rats // Gut. - 2003. - Vol. 52. - № 11. - P. 1572-5728.
4. Маянский А.Н. Дисбактериоз: иллюзия или реаль-
ность // Педиатрия. - 2000. - № 4. - С. 80-88.
5. Effects of chitooligosaccharides on human red blood cell morphology and membrane protein structure / J.C. Fernandes, P. Eaton, H. Nascimento et al. // Biomacromolecules. - 2008. - Vol. 9. - № 12. -P. 3346-3352.
6. Evaluation of intestinal permeability in patients with inflammatory bowel disease using lactulose and measuring antibodies to lipid A / T. Oriishi, M. Sata, A. Toyonaga et al. // Gut. - 1995. - № 36. -P. 891-896.
7. Казенное А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Na/K-АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. - 1984. - № 7. - С. 1089-1094.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. -М.: МедиаСфера, 2006. - 312 с.
9. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови / М.З. Федорова, Н.А. Павлов, Е.В. Зубарева и др. // Биофизика. - 2008. - 53. - Вып. 6. - С. 1014-1018.
10. Rowland I.R., Bearne C.A., Fischer R., Pool-Zobel B.L.
The effect of lactulose on DNA damage induced by DMH in the colon of human flora-associated rats // Nutr. Cancer. - 1996. - Vol. 26. - № 1. -P. 37-47.
Поступила 30.12.11 г.
EFFECT OF FOOD LACTULOSE IN VITRO ON THE ERYTHROCYTES MEMBRANE AND ACTIVITY OF NA/K-ATPASE
R.O. BUDKEVICH, I.A. EVDOKIMOV
North Caucasus State Technical University,
2, Kulakova av., Stavropol, 355029; fax: (8652) 23-58-34, e-mail: eia@ncstu.ru, budkev@mail.ru
The influence of lactulose on the membrane of erythrocytes in the in vitro experiment using atomic force microscopy and biochemical techniques is examined. It was shown that lactulose can directly affect the state of erythrocytes in vitro, altering the structure of the membrane surface and increase the activity of Na/K-ATPase.
Key words: lactulose, erythrocytes, Na/K-ATPase, atomic force microscopy, oligosaccharides, disaccharides.
