CC BY
77
Костяев А. А.1, Утёмов С. В.1, Андреев А. А.1, Полежаева Т. В.2, Мартусевич А. К.3, Исаева Н. В.1 Шерстнев Ф. С.1, Ветошкин К. А.1, Калинина Е. Н., Князев М. Г.1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Киров
ЧЕТЫРЕХКЛАССНАЯ СИСТЕМАТИЗАЦИЯ БИОКРИОКОНСЕРВАНТОВ. I класс хладоограждающих растворов — эндоцеллюлярные криоконсерванты
2
3
Kostyaev A. A.1, Utyomov S. V.1, Andreev A. A.1, Polezhaeva T. V.2, Martusevich A. K.3, Isaeva N. V.1, Sherstnyov P. S.1, Vetoshkin K. A.1, Kalinina E. N.1, Knyazev M. G.1
1 Federal State Budget institution of Science «Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency», Kirov
2 Federal State Budgetary Institute of Physiology of the Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
3 Federal State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Kirov State Medical Academy» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kirov
A FOUR CLASS SYSTEMATIZATION OF BIOCRYOCONSERVANTS. The first class of cold preserving solutions — endocellular cryoprotectants
Резюме. Рассмотрены биокриоконсерван-ты I класса, рецептура которых базируется на моно- (одном) или би- (двух) эндоцеллю-лярных криопротекторах. Охарактеризованы физико-химические, биологические, токсико-фармакологические и криозащитные свойства сильных эндокриоконсервантов для клеток крови и костного мозга. Освещены некоторые аспекты механизма их действия на клетки. Описано применение криопротек-торов в практике низкотемпературного консервирования биологических объектов.
Ключевые слова: эндоцеллюлярные кри-опротекторы, биокриоконсерванты I класса.
Summary. Biocryoconservants of the first class, the formulation of which is based on monosingle) or bi- (two) endocellular cryoprotectors are examined. Physical and chemical, biological, toxicological and pharmacological properties of strong endocrioconservants for blood cells and bone marrow are picked out. Some aspects of their mechanism of action on cells are lighted. The application of cryoprotectants in the practice of low-temperature preservation of various biological objects is described.
Key words: endocellular cryoprotectants, biokyioconservants, classifications.
Введение. Трансфузионная криобиология — сравнительно молодая, динамично развивающаяся наука, но уже широко используемая специалистами экономически развитых стран. Арсенал ее методов и средств неуклонно совершенствуется и обновляется. Отмеченное выше относится к труду проф. Е. П. Сведенцова «Криоконсерванты для живых клеток» [1]. Автор впервые систематизировал известные сложные хладоогражда-ющие растворы, а также еще создающиеся новые композиции биокриоконсервантов
по свойствам и числу входящих в их состав криопротекторов с «реставрирующими» добавками в единую четырехклассную систему. Труд известного Российского ученого оказался весьма актуальным и, судя по поступающим просьбам повторить тираж его издания, необходимым для научных работников и практических врачей в области криобиологии и криомедицины.
Целью настоящей работы является попытка ознакомить широкий круг научных сотрудников и практических врачей, выпол-
няющих исследования в области экспериментальной и клинической трансфузионной криобиологии, с современной четырехклассной систематизацией биокриоконсервантов для замораживания клеток крови и костного мозга.
1. Первый класс хладоограждающих растворов.
Включает сильные биоэндокриоконсер-ванты (проникающие через плазматическую мембрану в клетки животных и человека) на основе глицерина, диметилацетамида (ДМАЦ), диметилсульфоксида (ДМСО) и их сочетаний.
Глицерин — С3Н8О3 — трехатомный спирт, м. м. 92,10. Благодаря наличию ОН-групп, образует водородные связи с молекулами воды, растворяется в ней в любых пропорциях. Глицерин растворяет соли и щелочи, мочевину, сахарозу и газы, а также растворяется в метиловом, этиловом и пропиловом спиртах. Он тропен к клеткам и тканям организма животных.Участвует в энергетическом обмене. Глицерин — вещество с выраженной токсичностью. Его ЛД50 составляет 4,57±0,14 г/кг [2].
В составе криоконсерванта используется глицерин (Glycerol) высшей степени (в/с) очистки или высшего сорта (ГОСТ 6259-75) с относительной плотностью 1,248. Утвержден Фармакологическим комитетом Минздрава и социального развития РФ для консервирования компонентов донорской крови (КДК) и ядерных клеток костного мозга (ЯККМ) и пуповинной крови (ПК) при температурах -10°^-196°С. Криопротекторная активность глицерина высока на различных биологических объектах [3].
1.1. Моноэндоцеллюлярные криокон-серванты на основе глицерина для быстрого замораживания эритроцитов при -196оС.
До настоящего времени криоконсерван-ты этого класса остаются лучшими для замораживания эритроцитной взвеси (ЭВ) [1]. Для быстрого замораживания ЭВ при -196оС в жидком азоте разработан криоконсервант ЦНИИГПК 114, в котором концентрация глицерина составляет 30%: Глицерин в/с, 300 мл; Маннит, 40 г; NaCl, 7 г или ЭДТА Na2 3 г;
Ыа2НР04^12Н20, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл; рН 5,6-6,2.
Криоконсервант добавляют к эритроцитной массе (ЭМ), помешивая в течение 5-8 мин в соотношении 1: 1, приготовленную ЭВ оставляют при комнатной температуре на 15-20 мин для глицеринизации, затем переводят в криоконтейнер, герметизируют и погружают в жидкий азот на 2 мин [1, 4]. В жидком азоте эритроциты хранят до 10 лет. Оттаивание замороженных эритроцитов в криоконтейнере производят в водяной ванне при +45оС в течение 26 сек при ритмичном покачивании криоконтейнера в режиме 200 качаний в минуту. Последующее отмывание глицерина от эритроцитов производят растворами хлорида натрия, маннита или сахарозы до нормотонической концентрации этих растворов. Затем ЭВ центрифугируют, осадок эритроцитов ресуспендируют в плаз-мозамещающем растворе ЦОЛИПК № 8-в, переводят в полимерные контейнеры «Гемакон 300» или «Компопласт 300», герметизируют, паспортизируют и транспортируют в клинику.
Разработан метод консервирования эритроцитов при -25оС,—38оС со сниженной концентрацией глицерина: разработаны рас-
творы ЦНИИГПК 115- и ЦНИИГПК
5-с"
Кон-
центрация глицерина в них составляет 40 %.
Состав криоконсерванта ЦНИИГПК 115-м: Глицерин в/с, 400 мл; Маннит, 40 г; ЫаС1, 7 г; Ыа2НР04^12Н20, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл.
Состав криоконсерванта ЦНИИГПК 115-с: Глицерин в/с, 400 мл; Сахароза, 50 г; ЫаС1, 7 г; Ыа2НР04^12Н20, 0,3 г; Вода бидистиллирован-ная — до 1000 мл.
Криоконсерванты медленно добавляют к ЭМ в соотношении 1:1 при постоянном помешивании ЭВ, затем центрифугируют при 1100 % 20 мин при +4оС, удаляют надосадоч-ную жидкость, осадок эритроцитов перемешивают, ЭВ переводят в криоконтейнер, герметизируют и замораживают в жидком азоте в течение 2-2,5 мин. Срок максимального хранения эритроцитов в замороженном виде составляет 10 лет, после чего эритроциты размораживают, отмывают от криопротек-тора, взвешивают в растворе ЦОЛИПК № 8-в по стандартной технологии, переводят в полимерные контейнеры «Гемакон 300» или «Компопласт 300», герметизируют, паспортизируют и транспортируют в клинику.
1.2. Моноэндоцеллюлярные криокон-серванты на основе глицерина для замораживания эритроцитов по методам Американской ассоциации банков крови (ааВВ).
Американской ассоциацией банков крови (ааВВ) для консервирования эритроцитов замораживанием применяется глицерин в низкой (около 20%) или высокой (около 40%) конечной концентрации [1]. Технология с низкой концентрацией глицерина позволяет использовать биохранилища с жидким азотом (-196оС), а с высокой конечной концентрацией криопротектора — электроморозильники на -80оС. Эритроциты, консервированные с растворами AS-1(СРD) и AS-3 (СР20), могут успешно замораживаться даже после 42 дней хранения в указанных консервантах. Отмечен опыт успешного переливания размороженных эритроцитов, хранившихся 21 год при -196оС [6].
Состав Л5-1: Глюкоза, 11,1 г; Аденин, 0,21 г; Манитол, 4,1 г; Натрия хлорид, 15,4 г.; Объем до 100 мл.
Состав Л5-3: Глюкоза, 5,5 г; Аденин, 0,22 г; Натрия хлорид, 7,0 г.; Ыа2НР04, 1,9 г; Ыа3 цитрат, 1,9; Лимонная кислота, 0,2. Объем до 100 мл.
1.2.1. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант для медленного замораживания эритроцитов с гдицерином в воздушной камере электроморозильников от -60оС до -80оС.
Разработан Г. С. Воробьевой и Ф. Р. Вино-град-Финкель [1]. В состав крироконсерван-та входят: Глицерин в/с, 570 мл; Маннит, 20 г; Натрия хлорид, 4 г; Ыа2НР04^12Н20, 0,8 г; Вода для инъекций — до 1000 мл.
Конечная концентрация глицерина в суспензии эритроцитов составляет 40 %. Вся технология криоконсервирования и де-глицеринизации эритроцитов растворами с трехкратно понижающейся осмолярностью проводится в одном контейнере «Гемакон 500». КДК хранят полноценными при -80оС до 4 лет.
Высокая концентрация глицерина предусматривает глицеринизацию эритроцитов в течение 4 часов. Медленное замораживание клеток в электроморозильнике до -80оС допускает их длительное хранение при -65оС и последующее отмывание от протектора.
1.2.2. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант для замораживания эритроцитов при -25оС т -38оС со сниженной концентрацией глицерина.
Метод предложен В. Н. Мельниковой и со-авт. [1]. Применяется известный криоконсер-вировант ЦНИИГПК 115-м или ЦНИИГПК 115-с,
которые смешивают с ЭМ в соотношении 1:1. Конечная концентрация глицерина в ЭВ составляет 20 %.
Пропись раствора ЦНИИГПК 115-М: Глицерин, 400 мл; Манит, 40,0 г; Натрия хлорид, 7,0 г; Натрия фосфат двузамещенный, 0,3 г; Вода для инъекций до 1000 мл; рН раствора 6,1-6,3. Разливают по 125 мл и 250 мл в стеклянные флаконы вместимостью 250 мл.
Для замораживания используют электроморозильники на -25оС и -38оС, которые обеспечивают сохранность КДК, соответственно, от 5 до 12 мес. Перед трансфузией размороженные эритроциты отмывают в 3 растворах хлорида натрия в убывающей концентрации 3,2; 2,0 и 0,9 %.
1.3. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант для медленного замораживания и хранения эритроцитов с глицерином в электрическом морозильнике при - 30оС
Метод разработан Ю. С. Суханолвым и со-авт. (1987). Для замораживания и хранения ЭВ с глицерином в электрическом морозильнике при -30оС применяют криоконсерван-ты ЦНИИГПК 115-55 и ЦНИИГПК 115-с [1].
Состав ЦНИИГПК 115-55: Глицеринв/с, 550 мл; Маннит, 40 г или Сахароза, 50 мл; Натрия хлорид, 7 г; Натрия фосфат двузамещенный, 0,3 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН раствора 5,8-6,3 (с сахарозой).
Состав ЦНИИГПК 115-с: Глицерин в/с, 400 мл; Маннит, 40 г или Сахароза, 50 мл; Натрия хлорид, 7 г; Натрия фосфат двузамещенный, 0,3 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН раствора 6,0-6,75 (с Маннитом).
Отмеченные криоконсерванты смешивают в течение 10 мин с ЭМ в контейнере из по-ливинилхлорида (ПХВ) в соотношении 1:1 или 1,6:1. К каждым 125 мл ЭМ добавляют 200 мл раствора и выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Конечная концентрация глицерина в ЭВ составляет 24,6% и 27%, соответственно. Размораживают в водяной ванне при темпера-
туре + 38°^ + 40оС в течение 10 мин. Деглице-ринизацию осуществляют при трехкратном серийном центрифугировании ЭВ с применением понижающихся концентраций солевых растворов до нормотонии. Отмытые эритроциты взвешивают в ЦОЛИПК № 8-в.
К настоящему времени созданы высокоэффективные «закрытые» автоматические технологии глицеринизации и деглицерини-зации эритроцитов, позволяющие сохранять в жизнеспособном состоянии до 99 % красных кровяных телец.
1.4. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант на основе глицерина для замораживания гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга при -70оС.
Метод разработан А. Г. Федотенковым и со-авт. [6, 7]. Аспирируемую костно-мозговую взвесь стабилизируют консервирующим раствором ЦНИИГПК № 3, состоящем из смеси №1 и смеси № 2. Его состав:
Смесь № 1: Сахароза, 4,3 г; Глюкоза, 0,4 г; ЭДТА Ыа2, 0,1 г; Вода бидистиллированная до 50 мл; рН смеси 7,0-7,2.
Смесь №2: Натрий лимоннокислый трех-замещенный, 1 г; 10% раствор желатина, 25 мл; Вода бидистиллированная до 50 мл; рН смеси 7,0-7,2.
Смеси № 1 и № 2 расфасовывают по 100 мл в стеклянные флаконы на 250 мл и стерилизуют раздельно (для избежания караме-лизации глюкозы) в течение 30 мин при 1,2 атм. Затем хранят в двойных бязевых мешках при + 4оС в течение 2-х недель.
Перед применением их сливают асептично закрытым способом в один флакон на 500 мл.
Флаконы с заготовленной на растворе ЦНИИГПК № 3 костно-мозговой взвесью ставят на 30 мин под углом 45оС при комнатной температуре.
При криоконсервировании костного мозга в растворе ЦОЛИПК-1 с добавлением 20 % раствора глицерина и катионной сыворотки сохраняется до 85 % жизнеспособных клеток. Авторы сообщают о высокой лечебной эффективности миелоидной ткани, консервированной с 15% раствором глицерина у смертельно облученных собак.
Глицерин, обладая высокой осмолярно-стью и низкой скоростью диффузии через ци-топлазматическую мембрану, способен вызывать осмотический гемолиз клеток в момент
введения их в сосудистое русло реципиента. Поэтому перед трансфузией требуется предварительно удалять криопротектор из костномозговой суспензии [8]. Такая вынужденная процедура приводит к снижению жизнеспособности и потере значительного количества ядерных клеток.
А. Г. Федотенков и соавт. [7] для замораживания ЯККМ (ГСК) предложили крио-консервант на основе 15 % глицерина. Его состав: Глицерин в/с, 30 мл; Надосадочная жидкость, 50 мл; Сыворотка АВ (IV) группы крови, 20 мл.
Миелоэксфузат стабилизируют на консервирующем растворе ЦОЛИПК № 3 с 10% раствором желатина в соотношении 1: 3-1:4 (с учетом свертываемости биосреды). Под влиянием желатина в течение 30 мин происходит четкое разделение биосреды на два слоя. Надосадочный слой, обогащенный ЯККМ и ГСК, переводят в отдельный флакон, центрифугируют 15 мин со скоростью 1200 об/мин при + 5оС. Затем отделяют надосадок, обедненный ЯККМ и ГСК, для ретрансфузии донору. Оставшиеся во флаконе 100 мл биосреды, обогащенной ЯККМ и ГСК, тщательно ресу-спендируют, после чего к ней медленно добавляют криоконсервант в соотношении 1:1. Приготовленную миеловзвесь с 15 % глицерином выдерживают при комнатной температуре 30 мин (для глицеринизации ЯККМ), затем разливают в пластикатные криопакеты, герметизируют и помещают в электроморозильник на -20оС на 25 мин до момента кристаллизации (-9оС). Затем биоконтейнер переносят в электроморозильник на -70оС. Срок хранения ЯККМ и ГСК в этих условиях ограничен 2 мес. После размораживания суспензии в водяной ванне при +39о^ +40оС насчитывается 7692 % эозинорезистентных ядерных клеток. Перед переливанием реципиенту клетки отмывают от глицерина растворами с понижающимися концентрациями глюкозы или сахарозы. Конечная концентрация глицерина в суспензии ЯККМ составляет 3,3 %. Морфологическая сохранность и пролифе-ративная активность ГСК наиболее высоки через 10-15 мин после отогревания и де-глицеринизации клеточной суспензии.
1.5. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант «Пропандиосахароль» на основе пропиленгликоля (1,2 ПД) для замораживания эритроцитов при -196оС.
Пропиленгликоль — С3Н8О2 — двухатомный спирт алифатического ряда, м. м. 76,1, смешивается с водой в любых пропорциях, его эндоосмос в эритроциты проходит быстрее, чем у глицерина. Функциональные группы — «ОН» и «СН». ЛД50 пропиленгликоля для кроликов составляет 13,1 г/кг, для крыс — 6 г/кг. 1,2 ПД вызывает изменения на цитоплазматическом уровне [8]. Обладает протекторными свойствами
в отношении различных клеток животных на более высоком уровне, чем глицерин и ди-метилсульфоксид [9].
Состав криоконсерванта «Пропандиоса-хароль»: Пропиленгликоль (1,2-ПД), 370 мл; Сахароза, 32 г; Натрия хлорид, 6 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 5,5-7,5.
ЭМ смешивают с «Пропандиосахаролем» в соотношении 1:1, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, осадок — ЭМ помещают в криопакет, замораживают со скоростью 12-14оС/мин до температуры хранения -196оС. После размораживания гемолиз клеток не превышает 2-3 %. Пропиленгликоль от эритроцитов однократно отмывают 3 % раствором сахарозы. Его остаточное количество в среде составляет 0,3-0,5 %. Размороженные эритроциты хранят перед трансфузией в ресуспендирующем растворе ЦОЛИПК № 8-в не более 24 ч. Апробация клинического применения эритроцитов, криоконсерви-рованных с «Пропандиосахаролем», в Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова, ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России и Харьковской ОСПК выявила высокую физиологическую полноценность трансфузионной среды и эффективность избранной криотехноло-гии.
1.6. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант для замораживания тромбоцитов на основе диметилацетамида (ДМАЦ).
Ы, Ы-диметилацетамид (ДМАЦ). Химическая формула СН3С(0)Ы(СН3)2, м. м. — 73,10. Разрешен для клинического применения. ЛД50 для мышей составляет 4,2 г/кг (по другим данным 2,58-3,90 г/кг), для крыс — 3,56 г/кг [3]. Обладает высокой криозащитной
активностью в отношении тромбоцитов, лейкоцитов и других клеток [3]. На основе ДМАЦ разработан гемоконсервант «Тромбокриод-мац» (ТКД) для
замораживания тромбоцитов и метод длительного хранения тромбоцитных концентратов (КТ) при -196оС [4,10].
Состав «Тромбокриодмац»: N,
N-диметилацетамид, 50 мл; Глюкоза, 50 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 4,0-5,5.
Приготовленный гемоконсервант стерилизуют при 1,2 атм 30 мин. Хранят при комнатной температуре в закрытом от света месте в течение 2 лет. Замораживание КТ по линейной программе проводят со скоростью 3оС/мин до -60оС, далее КТ переносят в жидкий азот (-196оС). После отогревания при + 38оС по тестам in vitro сохраняется более 80 % кровяных пластинок, из которых 50 % имеют биологическую полноценность.
В 2006г. К.В.Кузнецовым и соавт. [11] в эксперименте разработан метод криокон-сервирования КТ с раствором «Тромбокриодмац» при низких (-80оС) температурах в пла-стикатных контейнерах «Гемакон 300» или «Компопласт 300» в режиме быстрого двухступенчатого замораживания с использованием электрических морозильников на -30оС и -80оС. Первоначально контейнеры с КТ помещают в морозильную камеру с этиловым спиртом, охлажденным до -30оС. На втором этапе, после достижения КТ температуры -29о^30оС, биообъект переносят в хранилище на -80оС. Срок хранения КТ 12 мес.
1.7. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант на основе ДМАЦ для замораживания лейкоцитов при -196оС
В ГНЦ РАМН в 1985 году разработан кри-оконсервант на основе ДМАЦ для замораживания лейкоконцентратов — «Лейкокриод-мац» [5,12].
Состав гемоконсерванта «Лейкокриод-мац»: N, N-диметилацетамид (ДМАЦ), 200 мл; Глюкоза, 20 г; Динатриевая соль ЭДТА, 4 г; Вода для инъекций — до 1000 мл; рН 4,5-5,5.
Стерилизуют автоклавированием при 1,2 атм 30 мин. Хранят в течение 2 лет. Смешивают с суспензией гранулоцитов 1:3, переводят в 100 мл пластикатные криоконтейнеры, замораживают со скоростью 3оС/мин до -196оС. Срок хранения в жидком азоте не более 2 лет. Размораживают в водяной ванне при + 39оС
до температуры биопродукта 0°^ + 2оС. В нем сохраняются жизнеспособными до 78 % ядерных клеток.
1.8. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант на основе ДМАЦ для замораживания ГСК костного мозга при -196оС.
В ВМА им. С. М.Кирова Р. В. Тюриным [13] на основе ДМАЦ разработан криоконсервант для замораживания ЯККМ (ГСК) при -196оС следующего состава: Ы, N -диметилацетамид (ДМАЦ), 24 мл; Глюкоза, 40 г; Трилон Б, 0,4 г; Вода для инъекций — до 1000 мл.
Перед началом криоконсервирования концентрат ЯККМ с ГСК разводят аутоплазмой 1:3. При использовании аллогенного костного мозга консервант разводят 1:3 сывороткой АВ(1У) группы. Затем его смешивают 1:1 с концентратом ЯККМ. Конечная концентрация ДМАЦ составляет 3 %. Время экспозиции — не более 15 мин. ГСК замораживают по программе: на первом этапе — 1оС/мин до начала кристаллизации, на втором — 5о-10оС/ мин до -150оС, затем переносят в хранилище с жидким азотом (-196оС) на срок до 1,5 мес. В размороженных ЯККМ сохраняется до 90 % колониеобразующих единиц грануломоно-цитопоэза (КОЕ-ГМ). ДМАЦ химически стоек, малотоксичен и лишен свойственного ДМСО неприятного запаха.
1.9. Моноэндоцеллюлярные криокон-серванты на основе диметилсульфоксида (ДМСО).
Диметилсульфоксид (ДМСО) — С2Н^0 является органическим веществом, относится к классу оксидов, его м. м. — 78,13. ДМСО хорошо проникает в клетки, реорганизует структуру образующегося льда — происходит его мелкоячеистая кристаллизация, близкая по своей природе к аморфной [3, 14]. Силы взаимодействия между молекулами ДМСО и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды [14]. Установлено [18], что в системах, содержащих ДМСО, в отличие от систем с криопротекторами из класса полиолов, происходит кристаллизация эвтектических составов. Это явление, наряду с девитрифика-цией, представляет собой дополнительный криоповреждающий фактор. Благодаря наличию кислорода, ДМСО обладает высокой способностью вступать в реакции с солями
и оксидами фосфата, серы, формировать связи с глицерином, сахарозой, мочевиной, стеариновой кислотой и другими органическими соединениями. Известны противоишемиче-ское и антиоксидантное свойства ДМСО [15].
Впервые ДМСО в качестве протекторного средства предложили J. Lovelock и M. Bishop [19]. ДМСО был успешно испытан в клинике при криоконсервировании (-196оС) эритроцитов C. E. Huggins и лейкоцитов A. Rowe и E. Cohen [1].
ДМСО является токсичным веществом и обуславливает необходимость его отмывания после размораживания клеточной суспензии, что существенно усложняет процедуру получения качественных деконсервированных клеток и приводит к потере части клеток в процессе отмывания [1, 2, 16]. По данным Е. Е. Rosenbaum [1], токсичность ДМСО на ор-ганизменном уровне имеет видовую зависимость. ЛД50 при внутривенном введении для кроликов, обезьян, лабораторных мышей и собак составляет соответственно: 19,2; 11,0; 3,8 и 2,5 г/кг веса. В последнее время для уменьшения токсичности ДМСО применяют более совершенные методы очистки вещества, а также используют в рецептах гемокон-сервантов широкий спектр улучшающих «реставрирующих» добавок. Из последних методов стали использовать растворы декстрозы, полиглюкина, гидроксиэтилкрахмала (ТЭК) или гексаметиленбистетрагидроксиэтилмо-чевина (ГМБТОЭМ).
1.10. Моноэндоцеллюлярный криоконсервант на основе ДМСО для замораживания тромбоцитов при -80оС и -196оС и лейкоцитов при -196оС.
Для консервирования КТ при -196 °C ДМСО применяют в концентрации 5-11 % [3, 14, 15]. При этом сохранность клеток составляет 30^80 %. Несмотря на то, что для снижения токсичности в раствор ДМСО вводилась гомологичная сыворотка, после замораживания-отогревания КТ находили снижение адгезивных свойств клеток, а у части кровяных пластинок — разрушения лизосом [1]. При переливании размороженных КТ, подвергнутых двукратному отмыванию, у 33% реципиентов наблюдали озноб и лихорадку. Неприятным свойством ДМСО является нестойкость этого соединения при хранении. ДМСО достаточно быстро распадается при
комнатной температуре с образованием токсического вещества с резким неприятным запахом диметилсульфида (СН2)2S [3].
Для консервирования лейкоконцентрата при -196 °С ДМСО применяется в концентрации 6-15 %, при этом лимфоциты переносят замораживание вполне удовлетворительно, а в ядрах и мембранах гранулоцитов обнаруживаются выраженные повреждения [1, 3]. Применяется ДМСО и для криоконсервирова-ния ЯККМ, ГСК периферической и кордовой крови [1, 3]. В обзоре работ отмечено, что растворы ДМСО с применением разных составов гемоконсерванта в 5-20 % конечных концентрациях и разных программ замораживания-отогревания клеток обеспечивали сохранность до 80-90 % жизнеспособных миелока-риоцитов [1].
1.11. Моноэндоцеллюлярный криокон-сервант на основе ДМСО для замораживания ГСК костного мозга и периферической крови.
КонецХХ и начало XXI столетий ознаменовались активным совершенствованием методов получения и криоконсервирования выделенных ГСК. В 2003 г., согласно приказу Минздрава РФ № 325 «О развитии клеточных технологий», начали применять для клинических целей высокоочищенный ДМСО в криоконсерванте следующего состава: Высокоочищенный ДМСО 10%, 30 мл; Поли-глюкин (м. м. —60 000), до 300 мл. рН 4,5-6,5.
Рабочий раствор ДМСО готовят непосредственно перед замораживанием ГСК. При соприкосновении с воздухом ДМСО окисляется и автоклавированию не подлежит: распадается на соединения, усиливающие токсичность химического вещества. Раствор ДМСО добавляют к полиглюкину (не наоборот!), доводя концентрацию ДМСО до 10 %, и ставят на хранение при + 4оС. Затем 10% раствор ДМСО добавляют в клеточную взвесь 1:1 без образования пены, после чего переводят в криопакет, герметизируют и замораживают по двухэтапной программе: на первом этапе со скоростью 1оС/мин до -13оС, на втором — 10оС/мин до -80оС или -196оС. Продолжительность хранения ГСК при -80оС составляет 2 года, при -196оС — до 5 лет. Замороженные ГСК с ДМСО требуют быстрого отогревания в водяной ванне при + 39о^41оС и последующего незамедлительного переливания паци-
енту. Такая методика обеспечивает сохранение биологических свойств более, чем у 80% миелокариоцитов.
Отмывание ДМСО от размороженных клеточных суспензий ведет к потере их части и снижает жизнеспособность последних на 30-40%. Поэтому многие специалисты критически относятся к отмыванию размороженных ядерных клеток от ДМСО. Однако исследования показали, что на каждые 70 трансфузий неотмытых от ДМСО клеточных суспензий развивается одно посттранс-фузионное осложнение, связанное с токсичностью известного криоконсерванта. В их числе: генерализованные судороги, энцефалопатия, спазмы сосудов, рвота, дыхательная недостаточность, неприятный запах выдыхаемого воздуха у реципиента и редко — коматозное состояние [16].
2.0. Биэндоцеллюлярный криоконсер-вант на основе пропиленгликоля и диме-тилацетамида для замораживания эритроцитов при -80оС и -140оС
Авторами способа замораживания эритроцитов под защитой криоконсерванта на основе пропиленгликоля и диметилацетамида являются В. В. Вельяминов и Ш. М. Багаутдинов [1, 17]. Состав биокриоконсерванта включает: а-Пропиленгликоль (ВФС-42-1594-86), 370 г; ДМАЦ (Ы, Ы-диметиацетамид) х. ч. (ТУ 6-09-537-73, ГОСТ 3885-73, 100 г; Сахароза, чда, (ГОСТ 8833-75), 32 г; Натрия хлорид, чда, (ГФХ, с. 428,442), 6 г; Вода для инъекций (ГФХ, с. 74) до 1000 мл.
ЭМ из крови 1-2 суточного хранения при +4оС смешивают 1:1 с криоконсерван-том в полимерном пакете «Гемакон 500» при +20оС^ + 25оС. При этом конечная концентрация пропиленгликоля составляет 18,5 %, диметилацетамида — 5 %. Полученную ЭВ переводят в два контейнера «Компо-пласт 300», закладывают в металлические холдеры и помещают либо в электрический морозильник на -80оС, либо в пары жидкого азота на 35-40 мин, после чего замороженные клетки переносят в электроморозильник-хранилище на -80оС. Размораживание эритроцитов проводят в водяной ванне при +42о^45оС в течение 2-3 мин, отмывают общепринятым способом с использованием стандартных растворов с пониженной концентрацией солевых растворов до нормото-
нии и ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК № 8-в. После размораживания количество эритроцитов составляет (3,95±0,04)*1012/л, уровень свободного гемоглобина — 0,69±0,05
г/л и соответствует (р>0,05) показателям эритроцитов, замороженных с глицерином до -196оС.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сведенцов Е. П. Криоконсерванты для живых клеток. — Сыктывкар, 2010. — 80 с.
2. Anderson K. C., Harris R W., Chen K. K. Toxicological stadies on synthetic glycerin // J. Amer. Assoc. Sci. 1950. Vol. 39, № 8. — P. 583-586.
3. Криоконсервирование клеточных суспензий / ЦуцаеваА.А., Аграненко В. А., Федорова Л. И. и др. [Под общ. ред. Цуцаевой А.А.]. Киев: Наук. думка, 1983. — 240 с.
4. В. А. Аграненко. Раствор «Тромбокриодмац» Временная фармакопейная статья 42-158685 от 16.12.1985.
5. C. R. Valery, L. E. Pivacek, A. D. Gray et.al.The safety and therapeutic effectiveness of human red cells stored et -80oC for as 21 years // Transfusion. — 1989. — V.29. — P. 429-437.
6. А. Г. Федотенков, Л. И. Суханова, И. Д. Шишкина и др. Консервирование костного мозга при низких температурах (-70оС) с применением 15 % глицерина для клинических целей // Методические рекомендации. — М., 1974. — 13 с.
7. А. Г. Федотенков, И. Д. Шишкина, Л. А. Данилова и др. Ограждающие растворы для крио-консервирования костного мозга // Гематология и трансфузиология.— 1972. — Т. 37, № 7-8. —С. 13-15.
8. В. М. Гучок, Э. А. Зборовская. О токсичности а-пропиленгликоля. — Криобиология и крио-медицина, 1981, вып. 8. — С. 46-49.
9. А. М. Воротилин. Криоконсервирование эритроцитов человека под защитой криопро-текторов на основе низкомолекулярных диолов: Автореф.: дис. докт. биол. наук. — Харьков, 1987. — 32 с.
10. В. А. Аграненко, С. М. Бахрамов, Л. А. Жеребцов. Компонентная гемотерапия // Изд-во «Ибн-Сина», Ташкент, — 1995. — 279 с.
11. К. В. Кузнецов. Консервирование тромбоцитов замораживанием при -80оС по экспоненциальной программе: Автореф.: дисс. канд. мед. наук. СПб, 2006. — 23 с.
12. Инструкция по криоконсервированию лейкоцитов с применением Лейкокриодмац» ЦНИИ гематологии и переливания крови. — М., 1985. — 6с.
13. Р. В. Тюрин. Криоконсервирование костного мозга под защитой 3 % раствора диметила-цетамида: Авторф.: дис. канд. мед. наук. — СПб., 1996. — 25 с.
14. Н. С. Пушкарь, М. И. Шраго, А. М. Белоус и др. Криопротекторы. Киев: Наукова думка, 1978. — 204 с.
15. Чуйко В.Л. Механизмы криозащитной эффективности и фармакологические свойства ДМСО // Криобиология. — 1989, № 1. — С. 3-10.
16. Берсенев А. В. Судороги и кома как осложнения, связанные с токсичностью криопро-тектора ДМСО при инфузии гемопоэтических клеток в клинике трансплантации костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.— 2006.— № 1.— С. 31-32.
17. Вельяминов В. В. Низкотемпературное консервирование эритроцитов под защитой комбинированного криопротектора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида: Ав-тереф.: дис. канд. Мед. наук. — СПб, 1997. — 21 с.
18. Зинченко А. В., Боброва Е. Н., Щетинский М. И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0оС // Проблемы криобиологии. — 2003, № 2. — С. 16-21.
19. Lovelock F., Bishop M. W. Prevention of freezing damage to living cells by DMSO. — // Nature, 1959. — V.183, № 4666. — P. 1394-1395.
