CC BY
178
Костяев А. А.1, Утёмов С. В.1, Андреев А. А.1, Полежаева Т. В.2, Мартусевич А. К.3, Исаева Н. В.1, Шерстнев Ф. С.1, Ветошкин К. А.1, Калинина Е. Н.1, Князев М. Г.1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Киров
АННАЛЫ КРИОБИОЛОГИИ. КЛАССИФИКАЦИИ КРИОПРОТЕКТОРОВ И КРИОКОНСЕРВАНТОВ ДЛЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА
Kostyaev A. A.1, Utyomov S. V.1, Andreev A. A.1, Polezhaeva T. V.2, Martusevich A. K.3, Isaeva N. V.1, Sherstnyov P. S.1, Vetoshkin K. A.1, Kalinina E. N.1, Knyazev M. G.1
1 Federal State Budget institution of Science «Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency», Kirov
2 Federal State Budgetary Institute of Physiology of the Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
3 Federal State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Kirov State Medical Academy» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kirov
ANNALS OF CRYOBIOLOGY. CLASSIFICATIONS OF CRYOPROTECTANTS AND CRYOCONSERVANTS FOR BLOOD CELLS AND BONE MARROW
Резюме. Рассмотрены физико-химические, биологические, токсико-фармакологи-ческие и криозащитные свойства известных и новых в криобиологии криопротекторов и гемоконсервантов на их основе для клеток крови и костного мозга. Освещены некоторые аспекты механизма их действия на клетки и предъявляемые к антифризам требования. Описано применение криоконсервантов в практике низкотемпературного консервирования различных биологических объектов.
Ключевые слова: анналы, криобиология, криопротекторы, криоконсерванты, классификации.
Summary. The physicochemical, biological, toxicological, pharmacological and cryoprotec-tive properties of known and new in cryobiology cryoprotectants and gemoconservants are examined. Some aspects of their mechanism of action on cells are shown. The use of cryoconservants in the experiment and the low temperature preservation of different biological objects is described.
Key words: annals, cryobiology, cryoprotectants, cryoconservants, classifications.
Введение. В ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства» с 1976 г. активно разрабатываются методы экспериментальной и клинической трансфузионной криобиологии. Под руководством Е. П.Сведенцова учениками его научной школы были разработаны новые криопротекторы и криоконсер-ванты на их основе для живых клеток, достигнуты серьезные успехи в длительном сохранении в замороженном виде в биологически полноценном состоянии клеточных суспензий компонентов крови и костного мозга. Из-
учены результаты применения трансфузий размороженных эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитных концентратов, а также трансплантаций аутологичных и аллогенных гемо-поэтических стволовых клеток при лечении гемобластозов, сепсиса, некоторых солидных опухолей и других патологий. Подтверждены выводы отечественных и зарубежных исследователей, о том, что, наряду с положительными защитными свойствами, используемые в клинике криоконсерванты проявляют побочное токсическое действие на клеточном и организменном уровне [1-3]. Поэтому одним из нерешенных вопросов в трансфузи-
онной криобиологии является создание, изучение и использование новых нетоксичных или малотоксичных клеточных антифризов. Важная роль в научном поиске оптимального метода криоконсервации компонентов крови и костного мозга отводится систематизации накопленных в мировой криобиологии теоретических сведений о криопротекторах и криоконсервантах.
Целью настоящей работы явилось ознакомление специалистов биологических и медицинских учреждений с историческими вехами развития науки о криопротек-торах и криоконсервантах на их основе для длительного сохранения компонентов крови и костного мозга, применяемых с лечебной целью.
Материалы и методы. Проанализирована отечественная и зарубежная литература по различным аспектам криоконсервирова-ния клеток крови и костного мозга.
Проблема сохранения в замороженном состоянии эритроцитной массы (ЭМ), эри-троцитной взвеси (ЭВ), лейкоконцентрата (КЛ), тромбоконцентрата (КТ), гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ГСК) и ядерных клеток костного мозга (ЯККМ) является одной из актуальных задач современной трансфу-зионной криобиологии. Основоположником криобиологии и учения о криопротекто-рах — защитных веществах, способных предотвращать развитие терминальных крио-повреждений в живых биосистемах на этапах их низкотемпературного консервирования, является Н.А.Максимов. Ученому принадлежит приоритет в выявлении криозащитного свойства в отношении живых клеток у многоатомного спирта глицерина [4]. Первая трансфузия размороженных клеток крови с лечебной целью была осуществлена Моллисоном и Словитером в 1951 г. [5].
В многостороннем глубоком изучении вопросов адаптации клеточных суспензий растительного и животного мира к гипо-и анабиозу преуспели ученые Харьковского Института проблем криобиологии и крио-медицины НАН Украины, в котором активно сотрудничают теоретики-экспериментаторы, химики, криофизиологи, криобиологи, криоинженеры, токсикологи, фармакологи, трансфузиологи и другие специалисты. В работах ученых ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, выполненных на высоком международном уровне совместно с Харьковскими кри-
обиологами, показано, что криопротекторы и криоконсерванты на их основе уменьшают интенсивность адаптационного процесса, снижают уровень клеточного метаболизма, делают клетки менее восприимчивыми к криоповреждениям [6]. Основная масса повреждений клеточных структур на этапах холодовой адаптации-замораживания-отогревания КДК и ЯККМ связана с обезвоживанием, образованием вне- и внутриклеточных кристаллов льда, а также токсичностью кри-опротекторов.
К настоящему времени в качестве перспективных криопротекторов апробировано больше 120 веществ, принадлежащих к разным классам химических соединений. Это спирты (метанол, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, диэтиленгликоль, глицерин, манит, сорбит и др.), альдегиды, амины, аминокислоты и их амиды (диметилацета-мид, мочевина и др.), оксиды (диметилсуль-фоксид и др.), углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза и др.), искусственные полимеры (поливинилпирролидон, оксиэтилирован-ный крахмал, полиэтиленоксид и др.), неорганические соли (натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый, натрий фосфорнокислый одно-, двух- и трехзамещен-ный, динатриевая соль ЭДТА и др. [3, 4].
В изучении известных и синтезе новых криопротекторов и криоконсервантов на их основе очень важен выбор рабочей классификации разрабатываемых химических соединений. В историческом плане следует отметить работу J. Lovelock [7], который одним из первых предложил различать крио-протекторы по способности проникать через плазматическую мембрану клетки. Автор выделил эндоцеллюлярные криопротекторы, проникающие в клетки (КПК), и экзоцеллю-лярные криопротекторы, не проникающие в клетки (КНК).
Н. С. Пушкарь и соавт. [8] добавили к двум названным третью группу—криопротекто-ры смешанного действия (КСД), проявляющие одновременно эффекты КПК и КНК.
Н. Maryman [9] уточнил, что эффектом КПК из низкомолекулярных обладают глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), диметилаце-тамид (ДМАЦ), а-пропиленгликоль (1,2-ПД), этиленгликоль (ЭГ) и др., у которых молекулярная масса (м. м.) до 101. Активными КНК являются вещества с м. м. выше 101: поливи-нилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал
(ТЭК), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и углеводы.
Эффективные КСД имеют м. м. 400 и выше. Это полиэтиленоксид (ПЭО с м. м. 400), гекса-метиленгидроксиэтил мочевина (ГМБТОЭМ с м. м. 378), оксиэтилированный глицерин с м. м. до 1400. ПЭ0-400 имеет в составе мономерные фракции как эндо-, так и экзоцеллю-лярного действия. Причем, основная масса полимера не проникает через плазматическую мембрану внутрь клетки [4, 8]. В работах подчеркнута зависимость сохранности клеток от скорости проникновения криопро-тектора внутрь биообъекта, молекулярной массы (чаще понижается с увеличением м. м.) и видовой принадлежности клеток [10].
Для систематизации имеющихся многокомпонентных хладоограждающих растворов, а также создающихся новых криофи-лактиков с реставрирующими добавками Е. П. Сведенцов предложил оригинальную классификацию гемоконсервантов, разделенную на четыре класса [3], в которых учитываются устоявшиеся названия криопро-текторов и их свойства, описанные и обоснованные J. Lovelock [7], Н. С. Пушкарем и соавт. [8], H. Meryman [9] и другими исследователями. Обращают внимание отличия от известных классификаций криоконсервантов по характеру состава, количеству и, особенно, по классу комбинированных криоконсерван-тов, выделеных в IV класс:
I класс криоконсервантов включает эндо-целлюлярные криоконсерванты; по числу криопротекторов в составе криоконсерван-та: монокриоконсерванты — содержат по одному эндоцеллюлярному криопротектору и бикриоконсерванты — содержат по два эн-доцеллюлярных криопротектора;
II класс криоконсервантов образуют экзо-целлюлярные криоконсерванты; монокрио-консерванты — содержат по одному экзоцел-люлярному криопротектору; бикриоконсерванты — содержат по два экзоцеллюлярных криопротектора;
III класс криоконсервантов образован криоконсервантами смешанного действия; монокриоконсерванты — содержат по одному криопротектору смешанного действия; бикриоконсерванты — содержат по два кри-опротектора смешанного действия;
IV класс криоконсервантов включает комбинированные криоконсерванты, в т.ч.: би-комбинированные криоконсерванты эндо-и экзоцеллюлярного действия — содержат
два криопротектора I и II классов; бикомби-нированные криоконсерванты эндоцеллю-лярного и смешанного действия — содержат два криопротектора I и III классов.
Во всех классах криоконсервантов могут быть использованы одна-две и больше «улучшающих» добавок.
Обращает на себя внимание то, что кри-опротекторы разной химической природы не имеют определенных границ по молекулярной массе и уровню токсичности (табл. 1) [3, 4]. Как показали исследования, высокая хладоограждающая активность обнаруживается как у низкомолекулярных (этиленгли-коля с м. м. 62; ДМСО с м. м. 78, 13; глицерина с м. м. 92,1), так и у высокомолекулярных химических веществ (ГЭК с м. м. 250 000500 000, ПЭГ с м.м. 1500).
Токсичность криопротекторов характеризуется показателями их общей токсичности — токсичности на организменном уровне, и цитотоксичности — токсичности на клеточном уровне. Токсичность веществ оценивается среднелетальной дозой (ЛД50 г/кг), при введении которой погибает 50 % подопытных животных [3, 4]. Значительной токсичностью обладают «сильные» эндоцеллюлярные кри-опротекторы (КПК). В несколько раз меньше токсичность у КСД. Очень слабую токсичность проявляют КНК. Практика показывает, что методические приемы определения общей и ци-тотоксичности требуют совершенствования. В криобиологии принято сравнивать токсичность криопротекторов по выявленной ЛД50 у белых лабораторных мышей. В то же время, токсичность КПК уменьшается с увеличением их молекулярной массы [3, 4]. Далее, теряя свойства КПК, химические соединения переходят в класс КНК, Так, например, происходит с производными глицерина монометилгли-церином и диметилглицерином. А. А. Цуцаева и соавт. [4], а также другие исследователи [3, 6, 10] считают, что все криопротекторы, за исключением ПЭ0-400-500 и ГМБТ0ЭМ-380, в зависимости от условий экспозиции в клеточной суспензии способны оказывать токсическое действие на организм и требуют удаления из клеточной суспензии перед введением ее в организм субъекта. Данная технология затратна, а также снижает морфологическую и биологическую полноценность трансфузи-онной среды.
Новым направлением в совершенствовании методов криоконсервирования КДК
и ЯККМ стали исследования по созданию многокомпонентных сред, в рецепты которых, наряду с криопротекторами, вводятся «реставрирующие» добавки: углеводы, белки плазмы, биологически активные соединения, соли и другие вещества с целью поддержания
энергетического обмена в размороженных клетках, уменьшения токсичности, других побочных воздействий, а также содействия репаративным процессам в клеточной суспензии после замораживания-отогревания [3, 4].
Свойства криопротекторов с выраженным хладоограждающим действием на КДК и ЯККМ
Таблица 1.
Криопротектор М. м. ЛД50, г/кг Авторы Компонент крови или ЯККМ
Этиленгликоль (КПК) 62 Низкая на клеточном и выраженная на организменном уровне P.Bautron at al. [1979] КЭ
Пропиленгликоль или 1,2-ПД (КПК) 76,1 13,1 В. М. Гучок [1981] КЭ
Глицерин (КПК) 92,1 4,57±0,14 K. C. Anderson at al. [1950] КЭ, ГСК
ДМСО (КПК) 78,13 3,8±0,1 M. J. Ashwood-Smith [1961] КТ, КЛ ГСК
ДМАЦ (КПК) 87 4,2 (2,5-3,9) А. А. Цуцаева и соавт. [1983] КТ, КЛ, ГСК
Декстраны 40-60 тыс. Не исселедовано А. М. Белоус и соавт. [1979] КЭ и др.
Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) 60-120 тыс. Не исселедовано А. М. Белоус и соавт. [1979] КЭ, КЛ, ГСК
ПЭО-400 (КСД) ПЭО-1500 400 12,5 В. М. Г учок [1977, 1980, 1981] ГСК КЭ
Поливинилпирроли-дон (ПВП) Гемодез (КНК) 12-25 тыс 12 тыс. Не исселедовано Не исселедовано M. D. Persidsky [1966] Г. Т. Черненко [1999] С. С. Лаврик [1964-1975], П. М. Перехристенко и соавт. [1998] КЭ, ГСК
ГМБТОЭМ (КСД) 378 15,5±0,6 Е. П.Сведенцов [1987, 2010] ГСК, КТ, КЛ
Благодаря успехам, достигнутым в исследовании механизмов криозащиты КДК и ЯККМ, получили развитие трансфузии размороженных аутологичных, сингенных и ал-логенных ГСК, КЭ и КТ с лечебной целью [1, 2, 3]. Наряду с положительными результатами трансфузий криоконсервированных КДК и ЯККМ, описаны случаи токсичного воздействия такого вида гемотерапии на организм реципиентов [10]. Накопленный научный и практический опыт по криоконсервиро-ванию КДК и ГСК показывает, что до настоящего времени остается открытым вопрос о поиске нетоксичного хладоограждающего вещества, не дающего опасных для здоровья реципиентов побочных эффектов [3, 6].
Вопрос о том, какими свойствами должен обладать эффективный криопротектор, до сих пор не имеет исчерпывающей оценки,
хотя некоторые из этих свойств известны [3].
В том числе:
— обладать способностью предупреждать развитие летальных криоповреждений форменных элементов, обеспечивать их сохранность в жизнеспособном состоянии после замораживания-отогревания и биологическую полноценность;
— быть нетоксичным, не требующим отмывания от размороженных клеток;
— хорошо растворяться в воде и стабилизировать молекулы воды;
— эффективно снижать количество вымораживаемой воды, способствовать образованию мелких кристаллов и стеклованию вне- и внутриклеточной воды;
— не откладываться (накапливаться) в клетках, тканях и органах макроорганизма;
— быстро выводиться из организма;
— не вызывать разрушения клеточных мембран и органелл;
— не приводить к развитию побочных эффектов: сенсибилизации, аллергии, гипертермии, не изменять функцию эндокринной системы и репродуктивных органов;
— не должны иметь неприятного запаха, не вызывать рвоту, не приводить к диарее;
— участвовать в метаболических процессах жизнеспособных клеток макроорганизма.
Вещество, обладающее перечисленными свойствами, предстоит искать либо среди уже существующих криопротекторов, либо синтезировать вновь, зная физико-химические особенности известных веществ [4]. Успех в целевых исследованиях может быть связан с представленным в данной работе материалом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Руководство по общей, производственной и клинической трансфузионной медицине. Изд.2-е, изм. и дополн. [Под ред. Е.П.Сведенцова]. — М.: Медицинская книга, 2012.— 618 с.
2. Руководство по трансфузионной медицине [Под ред. Е. П. Сведенцова]. — Киров, 1999. — 716 с.
3. Е. П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. — Сыктывкар, 2010. — 80 с.
4. А. А. Цуцаева, В. А. Аграненко, Л. И. Федорова и др. Криоконсервирование клеточных суспензий [Под ред. А. А. Цуцаевой]. Киев: Наукова думка. — 1983. — 240 с.
5. H.A.Sloviter. Recoveri of human red blood-cells after freezing // Lancet.— 1951. — V. 1.— P. 823-824.
6. А. А.Костяев. Низкотемпературное консервирование гемопоэтических стволовых клеток в режиме быстрого двухступенчатого замораживания (экспериментальное исследование). Дисс. докт мед. наук. — СПб, 2003. — 228 с.
7. F. Lovelock, M. W. Bishop. Prevention of freezing damage to living ceels by DMSO. — Nature, 1959. — V.183, № 4666. — P. 1394-1395.
8. Н. С. Пушкарь, М. Н. Шраго, А. М. Белоус и др. Криопротекторы. Киев: Наукова думка, 1978. — 204 с.
9. H. T. Maryman Cryoprotective agents: A review // ^yobiology. — 1971. — V. 3, № 2. — P. 173183.
10. Е. А. Гордиенко, Н. С. Пушкарь. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. — Киев, «Наукова думка», 1994. — 143 с.
