CC BY
111
я
АКТИВНОСТЬ МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ПЕЧЕНИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ В УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОЙ ДЕПРИВАЦИИ ПРОТЕИНА
Волощук О. Н., Копыльчук Г. П., Бучковская И. М.
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича.
ACTIVITY OF THE MARKER LIVER ENZYMES UNDER THE CONDITIONS OF TOXIC HEPATITIS AND ALIMENTARY DEPRIVATION OF PROTEIN
Voloshchuk O. N., Kopylchuk G. P., Buchkovskaia I. M.
Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych.
Волощук
Оксана Николаевна Voloshchuk Oksana N. E-mail: [email protected]
Волощук О. Н., Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича, кафедра биохимии и биотехнологии, канд.биол.наук, доцент.
Копыльчук Г. П., Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича, кафедра биохимии и биотехнологии, зав. кафедры, докт. биол. наук, профессор.
Бучковская И. М, Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича, кафедра биохимии и биотехнологии, канд.биол.наук, ассистент.
Voloshchuk O. N, Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych, Biochemistry and biotechnology department, Сandidate of Вiological sciences, docent.
Kopylchuk G. P., Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych, Biochemistry and biotechnology department, Doctor of Вiological sciences, professor.
Buchkovskaia I. M, Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych, Biochemistry and biotechnology department, Сandidate of Вiological sciences, assistant.
Резюме
В работе исследована активность сорбитолдегидрогеназы, аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крыс с ацетаминофен-индуцированным гепатитом в условиях алиментарной депривации протеина. Исследования проведены на 3 группах животных: 1 — крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе; 2 — крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина; 3 — контроль. Активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови определяли кинетическим методом, активность щелочной фосфатазы и АлАТ определяли фотометрически.
активность маркерных ферментов печени при токсическом гепатите... | activity of the marker liver enzymes.
Показано, что у животных с модельным гепатитом активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке повышается в 20 раз, при этом достоверной разницы между показателями животных с гепатитом, содержавшихся в условиях полноценной или низкопротеиновой диеты, не установлено. В группе животных с ацетамино-фен-индуцированным гепатитом наблюдалось сохранение активности щелочной фосфатазы на уровне контроля на фоне повышения активности аланинаминотрансферазы в 2,2 раза, при этом соотношение АлАТ: ЩФ > 5, что свидетельствует о гепатоцеллюлярном типе повреждения печени. В группе животных с моделированным лекарственным гепатитом, предварительно содержавшихся в условиях алиментарной депривации протеина, наблюдается повышение активности как щелочной фосфатазы, так и аланинаминотрансферазы, при этом соотношение АлАТ: ЩФ находится в пределах 2-5, что свидетельствует о смешанном типе повреждения печени.
Сделан вывод, что алиментарная депривация протеина является критическим фактором для развития нарушений функциональной и структурной целостности печени, при этом терапевтические подходы к коррекции последствий лекарственного повреждения печени в зависимости от полноценности белкового питания в анамнезе, должны отличатся, учитывая различный тип повреждения печени.
Ключевые слова: ацетаминофен-индуцированный гепатит, алиментарная депривация протеина, аланинами-нотрансфераза, щелочная фосфатаза, сорбитолдегидрогеназа
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 108 (8):96-100
Summary
The activity of the sorbitoldehydrogenase (SDH), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) in the blood serum of rats with acetaminophen-induced hepatitis under the conditions of alimentary deprivation of protein was studied. The animals were divided into 3 groups: 1 — rats with acute acetaminophen-induced hepatitis, maintained on the full ration; 2 — rats with acute acetaminophen-induced hepatitis, maintained under the conditions of alimentary deprivation of protein; 3 — control. The activity of the sorbitol dehydrogenase in blood serum was determined by the kinetic method, activity of the alanine aminotransferase and alkaline phosphatase — photometrically.
It is shown, that in animals with the model hepatitis the activity of sorbitol dehydrogenase in blood serum increases 20-fold, wherein statistical significance between animals with hepatitis maintained under the conditions of full ration and those of low-protein diet is not established.
In the group of animals with acetaminophen-induced hepatitis the preservation on the control level of the alkaline phosphatase activity on the base of the increase of alanine aminotransferase by 2.2 times and ratio ALT/ALP>5 testifies about hepatocellular liver injury. In the group of animals with drug-induced hepatitis and alimentary deprivation of protein, the increase of the alkaline phosphatase and alanine aminotransferase activity is observed, herewith the ratio ALT/ALP ranges from 2 to 5 and testifies about mixed liver injury.
The conclusion was made, that alimentary deprivation of protein is the critical factor for the development of the disturbances of functional and structural liver integrity, and the therapeutic approaches to the correction of the drug-induced liver injury should be different depending on the value of protein ration in the anamnesis, taking into account the different types of liver injury.
Keywords: acetaminophen-induced hepatitis, alimentary deprivation of protein, sorbitol dehydrogenase, alanine amino-transferase, alkaline phosphatase
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 108 (8):96-100
Введение
Проблема лекарственной гепатотоксичности на сегодня особенно актуальна, учитывая тенденцию к ежегодному возростанию случаев регистрации побочных эффектов влияния лекарственных препаратов [1-3]. Необоснованное, часто неконтролируемое использование ряда медикаментов рассмаривается как одна из распространенных
причин экзогенных интоксикаций. Последствия лекарственных повреждений печени, связанные с токсическим влиянием метаболитов ряда лекарственных препаратов, часто непредсказуемы [4]. Токсическое повреждение печени может протекать скрыто, клинически не проявляясь. В то же время, учитывая роль печени в реализации
Рисунок 1.
Активность сорбитолде-гидрогеназы в сыворотке крови крыс в условиях ацетаминофен-индуциро-ванного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
Примечание:
*- достоверная разница по сравнению с контрольной группой
Легенда: К — контроль Г — ацетаминофен-индуци-рованный гепатит НПР+Г — ацетаминофен-ин-дуцированный гепатит на фоне алиментарной депри-вации протеина
нмоль/с л
12
10
iüii-^Oiiüii: " ! "i ! "i ï" ! "" ! "il
gSäSSg
ШШШ ШШШ
¡шмш
□ К S Г
S НПР+Г
НПР+Г
группа
8
6
4
2
0
Рисунок 2.
Активность щелочной фос-фатазы в сыворотке крови крыс в условиях ацетамино-фен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
мкмоль/с л
30
25
20
15
10
НПР +Г группа
*
5
0
Рисунок 3.
Активность АлАТ в сыворотке крови крыс в условиях ацетаминофен-индуциро-ванного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина.
мкмоль/с л
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
НПР+Г
группа
0
активность маркерных ферментов печени при токсическом гепатите. | activity of the marker liver enzymes.
метаболических процессов, оценка состояния ее основных функций при патологии является необходимой для понимания биохимических механизмов нарушения ее функционирования.
Моделирование медикаментозных повреждений печени является чрезвычайно важным направлением гепатологии в диагностическом, терапевтическом и профилактическом аспекте, поскольку позволяет оценить глубину повреждения печени, открывает возможности для разработки критериев ранней диагностики гепатопатологических состояний и поиска эффективных гепатопротекторных
Материал и методы исследования
Исследования проводили на белых нелинейных крысах массой 90-100 г и возрастом 2-2,5 месяца. Работу с животными проводили с учетом положений Хель-синской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания. Исследования проводили на 3 группах животных: 1 — крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе (Г); 2 — крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина (НПР+Г); 3 — контроль (К).
Животные 1-й и 3-й группы на протяжении 28 суток получали рацион, включающий 14 % белка (в виде казеина), 10 % жиров и 76 % углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [7]. Животные 2-й группы получали рацион, содержащий 4,7 % белка, 10 % жиров, 85,3 % углеводов.
Результаты исследования
Результаты наших исследований показали, что у животных с модельным гепатитом активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке повышается в 20 раз (рис. 1), при этом достоверной разницы между показателями животных с ацетамино-фен-индуцированным гепатитом, содержащихся в условиях полноценной или низкопротеиновой диеты, не установлено. Изменение активности сорбитолдегидрогеназы является чувствительным маркером, используемым для диагностики деструктивных изменений в печени [10]. В то же время, результаты проведенных исследований показали, что в группе животных с острым токсическим гепатитом активность щелочной фосфа-тазы по сравнению с показателями контрольной
препаратов. Лекарственные препараты могут вызывать различные типы повреждений печени: ци-толитический, холестатический или смешанный. Биохимическими критериями определения типа повреждения печени является определение активности щелочной фосфатазы, аланинаминотрансфе-разы, а также их соотношение [4-6].
Целью нашей работы была оценка активности аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крыс с аце-таминофен-индуцированным гепатитом в условиях алиментарной депривации протеина.
После четырехнедельного содержания крыс на экспериментальной диете моделирование ацетами-нофен-индуцированного гепатита осуществляли путем введения per os ацетаминофена в дозе 1 г/кг массы животных в 2 % крахмальной взвеси на протяжении 2 дней с помощью специального зонда [8].
Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 31 сутки эксперимента.
Активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови определяли кинетическим методом [9], в основе которого лежит способность сорбитолдегидрогеназы восстанавливать D-фруктозу до D-сорбитола с одновременным окислением NADH. Активность щелочной фосфатазы и АлАТ определяли фотометрически.
Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Ман-на-Уитни с применением программы обработки статистических данных «Statistica 6.0».
группы животных достоверно не изменяется (рис. 2). На фоне установленного нами сохранения активности щелочной фосфатазы на уровне контроля наблюдается повышение активности маркера гепатоцеллюлярного некроза печени — аланинаминотрансферазы в 2,2 раза (рис. 3), при этом соотношение АлАТ: ЩФ > 5. Следует отметить, что в группе животных с моделированным лекарственным гепатитом, предварительно содержавшихся в условиях алиментарной депривации протеина, наблюдается повышение активности щелочной фосфатазы в 6,4 раза (рис. 2), а аланинаминотрансферазной активности — в 3,8 раза (рис. 3), при этом соотношение АлАТ: ЩФ находится в пределах 2-5.
Обсуждение полученных результатов
Определение активности органоспецифического фермента печени сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови используется как надежный скри-нинговый тест для диагностики нарушения ге-патобиллиарной системы [11, 12]. Учитывая, что сорбитолдегидрогенеза в организме локализируется в цитозоле гепатоцитов, и в норме исследуемая ферментативная активность в сыроватке крови
не обнаруживается [13], то установленное нами повышение сорбитолдегидрогеназной активности (рис. 1) является маркером острого гапато-целлюлярного повреждения паренхимы печени в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита. В то же время, данный тест не позволяет определить тип повреждения клеток печени при токсическом гепатите.
Анализ результатов исследования активности ЩФ и АлАТ (рис. 2, рис. 3), а также их соотношения в сыворотке крыс с ацетаминофен-индуцирован-ным гепатитом свидетельствует о гепатоцеллюляр-ном типе повреждения печени. Биохимическими критериями гепатоцеллюлярного или цитолити-ческого варианта гепатотоксического эффекта лекарственного средства является повышение АлАТ в 2 и выше раз при практически нормальных показателях уровня щелочной фосфатазы, тогда как соотношение АлАТ: ЩФ превышает 5 [2, 4, 14]. В литературе [5, 15] показано, что в условиях введения ацетаминофена внутриклеточная перестройка ге-патоцита будет включать гиперплазию агрануляр-ной эндоплазматической сети, ассоциированной с редукцией белоксинтезирующей системы, а также деструкцию и компенсаторную гиперплазию мито-хондриального аппарата.
В то же время следует отметить, что в группе крыс с лекарственным гепатитом, предварительно содержавшихся в условиях алиментарной деприва-ции протеина, наблюдается другая картина. Нами отмечено повышение активности как индикатора гепатоцеллюлярного некроза АлАТ (рис. 3), так и маркера холестаза ЩФ (рис. 2), при этом их соотношение колеблется в пределах 2-5. Установленные показатели являются биохимическими маркерами смешанного типа повреждения печени [2, 4]. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что предварительное
Литература
1. Borlak J., Chatterji B., Londhe K. B., Watkins P. B. Serum acute phase reactants hallmark healthy individuals at risk for acetaminophen-induced liver injury // Genome Medicine.— 2013.— Vol. 5:86.— P. 2-14.
2. Еремина Е. Ю. Лекарственные поражения печени // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга.— 2012.— № 1.— С. 6-25.
3. Somanawat K., Thong-Ngam D., Klaikeaw N. Curcum-in attenuated paracetamol overdose induced hepatitis // World J. Gastroenterol.— 2013.— Vol. 19 (12).— P. 1962-1967.
4. Попик Г. С., Коваленко С. Ф., Корнован Г. В. и др. Лекарственные поражения печени в амбулаторной практике // КТЖ.— 2010.— Т. 2, № 2.— С. 300-304.
5. Скрипник И. Н. Эссенциальные фосфолипиды в лечении и профилактике медикаментозных поражений печени // Сучасна гастроентеролопя.— 2009.— № 4 (48).— С. 22-31.
6. Степанов Ю. М., Филлипова А. Ю., Кононов И. Н. Лекарственные поражения печени: патогенез, классификация, диагностика, лечении. // Провизор.— 2005. — №5. — С. 15-18.
7. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute ofNutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr.— 1993.— Vol. 123, № 11.— P. 1939-1951.
белковое голодание является фактором риска, усугубляющим течение гепатотоксического состояния, поскольку кроме цитолиза клеток печени наблюдается обструкция желчных протоков или нарушение оттока желчи. Повышение активности ЩФ в данных экспериментальных условиях отображает либо усиленное освобождение щелочной фосфатазы в кровь вследствие деструкции канали-кулярных мембран, либо ее индуктивный синтез в желчевыводящих каналах.
Итак, предварительное содержание крыс в условиях алиментарной депривации протеина приводит к углублению повреждений билиарной системы с деструкцией мембран гепатоцитов и клеток, формирующих внутренние желчные протоки, следствием чего является активная элиминация печеночных энзимов в кровь. Резкое увеличение активности сорбитолдегидрогеназы, АлАТ и ЩФ в сыворотке крови крыс, у которых гепатотоксиче-ское состояние проявлялось на фоне белковой недостаточности, свидетельствует, что алиментарная депривация протеина является критическим фактором для развития нарушений функциональной и структурной целостности печени.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что терапевтические подходы к коррекции последствий лекарственного повреждения печени в зависимости от полноценности белкового питания в анамнезе, должны отличатся, учитывая различный тип повреждения печени.
8. Kuvandik G., Duru M., Nacar A. et al. Effects of Erdoste-ine on Acetaminophen-induced Hepatotoxicity in Rats // Toxicologic Pathology.— 2008.— Vol. 36.— P. 714-719.
9. Rose, C.I, Henderson, A. R. Reaction rate assay of serum sorbitol dehydrogenase activity at 370C // Clin.Chem.— 1975.— Vol. 21.— P. 1619-1624.
10. Boone L., Meyer D., Cusick P. et al. Selection and interpretation of clinical pathology indicators of hepatic injury in preclinical studies // Vet. Clin. Pathol.— 2005.— Vol. 34, № 3.— P. 182-188.
11. Kumar G., Banu G. S., Rajasecara M. Biochemical activity of selenium and glutathione on country made liquor induced hepatic damage in rats // Ind. J. Clinic. Biochem.— 2007.— Vol. 22, № 1.— P. 105-108.
12. Ozer J., Ratner M., Shaw M. et al. The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity / Toxicology.— 2008. — Vol. 245, № 3.— Р. 194-205.
13. Singh A., Bhat T. K., Sharma O. P. Clinical Biochemistry of Hepatotoxicity // J. Clinic. Toxicol.— 2011.— S4:001.— P. 2-19.
14. Yu Z., Fu S.— P., Zhan J., Li C.— Q. Investigation of application of ALT/ALP ratio in the differential diagnosis of jaundice // J. Biosci. Med.— 2012.— Vol. 2, № 3.— P. 1-4.
15. Иванишкин В. Т., Непомнящих Г. И., Айдагулова С. В. и др. Лекарственно-индуцированное поражение печени: универсальные структурные маркеры // Рос. журн. гастроэнтер., гепатол. и колопроктол.— 2009.— Т. 19, № 2.— С. 20-29.
