Activity of the Respiratory Chain Enzymes of Blood Leucocytes’ Mitochondria Under the Conditions of Toxic Hepatitis Induced Against the Background Alimentary Deprivation of Protein Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 4 2015, pp. 51-57 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Voloshchuk, Kopylchuk

ORIGINAL ARTICLE

Activity of the Respiratory Chain Enzymes of Blood Leucocytes’ Mitochondria Under the Conditions of Toxic Hepatitis Induced Against the Background Alimentary

Deprivation of Protein

O.N. Voloshchuk, G.P. Kopylchuk

Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych, Chernovtsi, Ukraine

*E-Mail: [email protected]

Received September 30, 2015

Full functioning of the leucocytes' energy supply system is one of the essential factors for the immune surveillance system effective work. The pivotal enzymes of the leucocytes' energy biotransformation system are NADH-ubiquitin reductase, a marker of the Complex I of respiratory chain activity, and succinate dehydrogenase, key enzyme of the Complex II of respiratory chain. The aim of research - to study the NADH-ubiquitin reductase and succinate dehydrogenase activity of the blood leucocytes' mitochondria under the conditions of toxic hepatitis induced against the background alimentary deprivation of protein. It is shown, that under the conditions of acetaminophen-induced hepatitis a reduction of the NADH-ubiquitin reductase enzymatic activity is observed on the background activation of the succinate-dependent way of the mitochondrial oxidation.

Conclusion was made that alimentary deprivation or protein is a factor, aggravating the misbalance of the energy biotransformation system in the leucocytes of rats with toxic hepatitis. Established activity changes of the leucocytes’ mitochondria respiratory chain key enzymes may be considered as one of the mechanisms, directed on the maintenance of leucocytes energy supply on a level, sufficient for their functioning.

Research results may be used for the biochemical rationale of the therapeutic approaches to the elimination and correction of the leucocytes' energy metabolism disturbances consequences under the conditions of acetaminophen-induced hepatitis, aggravated by the alimentary protein deprivation.

Key words: alimentary deprivation of protein, leucocytes, mitochondria, NADH: ubiquinone reductase, succinate dehydrogenase

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

52

Activity of the Respiratory Chain Enzymes...

Метаболические превращения, происходящие в лейкоцитах периферической крови, отражают состояние обменных и регуляторных процессов в организме (Marchenko, Voloshchuk, 2014; Kramer et a/., 2014), а изучение активности отдельных звеньев энергетического обмена позволяет оценить эффективность функционирования системы биотрансформации энергии,

обеспечивающей исполнение лейкоцитами своих функций. Полноценное функционирование системы энергообеспечения лейкоцитов является одним из необходимых условий эффективной работы системы иммунного надзора (MacIver et a/., 2008).

Центральными ферментами системы энергообеспечения лейкоцитов является NADH-убихинонредуктаза, маркер активности Комплекса I дыхательной цепи (Finel et a/., 1992), и

сукцинатдегидрогеназа, ключевой фермент Комплекса II дыхательной цепи (Miles, 2003). NADH-убихинонредуктаза обеспечивает транспорт четырех протонов из матрикса в межмембранное пространство и восстановление убихинона (Sharova, Vekshin, 2004), сукцинатдегидрогеназа (сукцинат- foQ-редуктаза) обеспечивает

функционирование дополнительного пути для входа электронов в дыхательную цепь за счет окисления сукцината (Jones, Hirs, 2013).

На сегодня остается открытой и требует подробного изучения проблема биохимических механизмов формирования дисбаланса системы биотрансформации энергии в клетках иммунной

системы в условиях лекарственного гепатита, формирующегося в условиях алиментарного дефицита белка.

Цель исследований - определение активности NADH-убихинонредуктазы [КФ 1.6.5.3] и сукцинатдегидрогеназы [КФ 1.3.5.1] митохондрий лейкоцитов в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина.

MATERIALS AND METHODS

Исследования проводили на 27 белых нелинейных крысах массой 90-100 г и возрастом 22,5 месяца. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.

Исследования проводили на 3 группах животных: 1 - контроль (К); 2 - крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом,

содержащиеся на полноценном рационе (Г); 3 -крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина (НПР+Г).

Животные 1-й и 2-й группы на протяжении 28 суток получали рацион, включающий 14 %

протеина (в виде казеина), 10 % жиров и 76 % углеводов, сбалансированный по всем нутриентам (Reeves et a/., 1993). Животные 3-й группы

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Voloshchuk, Kopylchuk

53

получали изоэнергетический рацион, содержащий экстинкции 6,22^103 М'^см"1. Сукцинатдегид-

4,7 % белка, 10 % жиров, 85,3 % углеводов. рогеназную активность определяли по

После четырехнедельного содержания крыс на интенсивности восстановления феррицианида

экспериментальной диете моделирование калия (Sharova, Vekshin, 2004). Содержание белка

ацетаминофен-индуцированного гепатита определяли по Лоури.

осуществляли путем введения per os Статистическую значимость полученных

ацетаминофена в дозе 1 г/кг массы животных в 2 результатов биохимических анализов оценивали с

% крахмальной взвеси на протяжении 2 дней с помощью непараметрического критерия Манна-

помощью специального зонда (Voloshchuk, Уитни с применением программы обработки

Kopylchuk, 2015). статистических данных «Statistica 6.0».

Цервикальную дислокацию крыс под легким RESULTS AND DISCUSSION

эфирным наркозом осуществляли на 31 сутки Результаты исследований показали, что в

эксперимента. условиях ацетаминофен-индуцированного

Выделение лейкоцитов периферической крови гепатита наблюдается нарушение функциональной

осуществляли с помощью метода седиментации в активности энзиматических маркеров дыхательной

градиенте плотности фиколл-верографина (р = цепи митохондрий лейкоцитов. Нами установлено

1,077 г/мл). Жизнеспособность клеток, торможение активности NADH-убихинонредуктазы

определяемая в тесте с трипановым синим, лейкоцитов крыс с токсическим гепатитом в 1,3

составляла не менее 97%. раза по сравнению с показателями контрольной

Для выделения митохондриальной фракции группы животных (рис. 1). Вероятно, причиной

суспензию лейкоцитов ресуспендировали в 5 установленного факта является нарушение

объемах буфера, содержащего 0,25 М сахарозу, структурно-функциональной организации

10 мМ фосфата калия, 1 мМ ЭДТА (рН 7,2). Комплекса 1 дыхательной цепи в данных

Суспензию клеток гомогенизировали. Гомогенат экспериментальных условиях. Показано, что

центрифугировали при 800 g на протяжении 10 метаболит ацетаминофена - N-ацетил-р-

минут. Осадок центрифугировали при 8000 g 10 бензохинонимин (NAPQI) способен связываться с

минут и ресуспендировали с буфером без ЭДТА остатками цистеина белков дыхательной цепи

(Biswas et al., 1997). Определение NADH- (Heard et al., 2011). Учитывая, что структурными

убихинонредуктазной активности проводили компонентами NADH-убихинонредуктазного

спектрофотометрически (Marchenko, Voloshchuk, комплекса являются железо-серные кластеры,

2014). NADH-убихинонредуктазную активность возможно, одним из механизмов нарушения

расчитывали с учетом коэффициента молярной функциональной активности исследуемого фермента является образование комплексов

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

54

Activity of the Respiratory Chain Enzymes...

NAPQI-протеин. Сегодня образование

ковалентных комплексов метаболитов

ацетаминофена с митохондриальными белками рассматривается как триггер первичной митохондриальной дисфункции, определяющий дисбаланс процессов энергообеспечения (Andringa et al., 2008).

В то же время у белок-дефицитных животных с токсическим гепатитом наблюдается практически десятикратное снижение активности NADH-

убихинонредуктазы. Вероятно, такие изменения связаны с нарушением синтеза отдельных субъединиц NADH-убихинонредуктазного

комплекса в условиях дефицита белка. Установленный факт свидетельствует, что в условиях токсического гепатита, усугубленного алиментарной белковой недостаточностью, в митохондриях лейкоцитов происходит нарушение способности транспортировать электроны в дыхательную цепь от NADH-зависимых субстратов.

Л

п

(в

Ё

о.__

i S !5

х Ю

zi

fi °

Ь<

о Z

£ -О

“ ц,

? о

Ё £

<0 1

0,35

0,3

0,25

0Л

0,15

0,1

0jD5

0

□ К

■ г

□ НПР+Г

к

НПР+Г

Figure 1. Активность NADH-убихинонредуктазы в митохондриальной фракции лейкоцитов периферической крови в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина

Примечание (тут и далее):

К - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе

Г - крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе

НПР + Г - крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на низкопротеиновом рационе *- статистическая значимость различий между опытной и контрольной группой (Р < 0,05)

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Voloshchuk, Kopylchuk

55

----------------------- ПНПР+Г

I -------1---------------1

К Г НПР+Г

Figure 2. Активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной фракции лейкоцитов периферической крови в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина

Поэтому на следующем этапе исследований актуальным было изучение активности сукцинатдегидрогеназы лейкоцитов

периферической крови у животных с токсическим гепатитом как посредника между FAD-зависимыми субстратами и дыхательной цепью. Именно активность сукцинатдегидрогеназы в значительной степени определяет скорость использования кислорода и синтеза АТР в митохондриях в условиях нарушения активности NADH-убихинонредуктазы (Cecchini, 2003). Результаты наших исследований показали, что у животных с ацетаминофен-индуцированным гепатитом,

содержащихся в различных режимах белкового питания, происходит активация

сукцинатзависимого пути окисления по сравнению с интактными животными (рис. 2). Вероятно, в условиях повышенной потребности в энергии,

активация сукцинатдегидрогеназы позволяет сохранить энергосинтезирующую функцию цитохромного участка дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов. Увеличение потока электронов через Комплекс II дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов на фоне нарушения работы Комплекса I, вероятно, отражает активацию компенсаторных метаболических потоков в условиях повышенной потребности в энергии и обеспечивает поддержание энергообеспечения лейкоцитов на уровне, достаточном для их функционирования.

Установленные закономерности работы ферментов дыхательной цепи митохондрий лейкоцитов могут быть основополагающими в обеспечении их функционирования в условиях токсического гепатита на фоне алиментарной

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

56

Activity of the Respiratory Chain Enzymes...

депривации протеина.

Результаты исследований могут использоваться для биохимического обоснования терапевтических подходов к устранению и коррекции последствий нарушения энергетического обмена лейкоцитов в условиях ацетаминофен-индуцированного

гепатита, усугубленного алиментарной депривацией протеина.

REFERENCES

Andringa K.K., Bajt M.L., Jaeschke H., Bailey S.M. (2008) Mitochondrial Protein Thiol Modifications in Acetaminophen Hepatotoxicity: Effect on HMG-CoA Synthase. Toxicol. Lett., 177 (3). 188197.

Biswas S., Ray M., Misra S., Dutta D.P., Ray S. (1997) Selective inhibition of mitochondrial respiration and glycolysis in human leukaemic leucocytes by methylglyoxol. J. Biochem., 323, 343-348.

Cecchini G. (2003) Function and structure of complex II of the respiratory chain. Annu. Rew. Biochem., 77, 77-109.

Finel M., Skehel J.M., Albracht S.P.J., Fearnley I.M., Walker J.E. (1992) Resolution of NADH:ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria into two subcomplexes, one of which contains the redox centers of the enzyme. Biochemistry., 31, 11425-11434.

Heard K.J., Green J.L., James L.P., Judge B.S., Zolot L., Rhyee S., Dart R.C. (2011) Acetaminophencysteine adducts during

therapeutic dosing and following overdose. BMC Gastroenterology, 11, 20-29.

Jones A.J.Y., Hirs J. (2013) A spectrophotometric coupled enzyme assay to measure the activity of succinate dehydrogenase. Analytical Biochemistry., 442, 19-23.

Kramer P.A., Ravi S., Chacko B., Johnson M.S., Darley-Usmar V.M. (2014) A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology, 2, 206-210.

Maclver N.J., Jacobs S.R., Wieman H.L., Wofford J.A., Coloff J.L., Rathmell J.C. (2008) Glucose metabolism in lymphocytes is a regulated process with significant effects on immune cell function and survival. J. Leukocyte Biol., 84 (4), 949-957.

Marchenko M.M., Voloshchuk O.N. (2014) The state of the energy-supply system of the blood leukocytes in the dynamics of guerin's carcinoma growth under the conditions of the low-level irradiation. Biomed. Chem., 60 (6), 631-635.

Miles B. (2003) The electron Transport Chain. LSM., 2, 1-11.

Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. (1993) AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet. J. Nutr., 5, 1939-1951.

Sharova I.V., Vekshin N.L. (2004) Rotenone-insensitive NADH oxydation in mitochondrial

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015

Voloshchuk, Kopylchuk

57

suspension occurs by NADH dehydrogenase of respiratory chain fragments. Biophysic., 49, 814821.

Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P. (2015) The Peculiarities of the Structural and Functional

State of the Cytochrome Component of the Liver Mitochondrial Respiratory Chain under Conditions of Acetaminophen-Induced Hepatitis on the Background of Alimentary Protein Deprivation. Biophysics., 60 (3), 420-424.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 4 2015