CC BY
43
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2016 УДК 616.9-022:615.33.015.8
ЗНАЧЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ГОСПИТАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ В ОТДЕЛЕНИИ ГНОЙНОЙ ОСТЕОЛОГИИ
В.Н. Митрофанов, Н.А. Гординская, Е.В. Сабирова, Н.В. Абрамова, Г.Н. Карасева
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Верхневолжская наб., 18/1 603155, г. Нижний Новгород, Российская Федерация
Проанализированы 434 штамма микроорганизмов, выделенных у пациентов отделения гнойной остеологии. 203 возбудителя инфекции выделены у больных, лечившихся по поводу нагноения после эндопротезирования крупных суставов, 148 - у больных с хроническим остеомиелитом, 83 - с синдромом диабетической стопы. Грамположитель-ных микроорганизмов выделено 302 штамма, Грамотрицательных - 132.
Независимо от нозологии основными возбудителями инфекции были различные стафилококки, третья часть которых экспрессировала mec A ген, проявляя фенотип метициллинрезистентных штаммов. Второе место по частоте обнаружения занимали Ps. Aeruginosa, среди которых у 9 штаммов из 51 выявлен ген, кодирующий продукцию метало-бета-лактамаз VIM-типа. На третьем месте по частоте выделения находились A. baumanii. Среди 29 изолятов ацинетобактеров обнаружены 15 штаммов, продуцирующих ОХА-40-подобные карбапенемазы. Из 19 штаммов K. pneumoniae 14 продуцировали бета-лактамазы расширенного спектра.
Таким образом, в отделении гнойной остеологии у пациентов с различными инфекционными процессами выявлены однотипные закономерности в структуре возбудителей инфекции: преобладание стафилококков и циркуляция большого числа полирезистентных к антибиотикам микроорганизмов. Тщательный бактериологический мониторинг дает возможность определения фенотипа и генотипа антибиотикорези-стентности и назначения рациональной антимикробной терапии.
Ключевые слова: госпитальная инфекция, антибиотикорезистентность, детерминанты резистентности.
THE VALUE OF MICROBIOLOGICAL MONITORING AND DETERMINING THE MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF HOSPITAL MICROFLORA OF PURULENT OSTEOLOGY DEPARTMENT
V.N. Mitrofanov, N.A. Gordinskaya, E.V. Sabirova, N.V. Abramova, G.N. Karaseva
Federal State Budgetary Institution «Privolzhsky Federal Research Medical Centre» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Verkhne-Volzhskaya nab., 18/1 603155, Nizhniy Novgorod, Russian Federation
434 microbial strains found in Purulent Osteology Department patients were analyzed. 203 infectious agents were found in patients with purulence after major joint prosthetics, 148 - in patients with chronic osteomyelitis, 83 - in diabetic foot patients. Grampositive microorganisms accounted for 302 strains, gram-negative ones - for 132 strains.
Irrespective of nosology, main infectious agents were represented by various staphylococci, a third of which expressed mec A gene displaying a phenotype of methicillin-resistant strains. Ps. Aeruginosa was second in detection rate, among which 9 strains out of 51 had a gene encoding VIM-type Metallo-beta-lactamase production. The third place in detection rate belonged to A. baumanii. 15 strains producing 0XA-40-like carbapenemases were found among 29 acinetobacter isolates. 14 out of 19 K. pneumoniae strains produced extended spectrum beta-lactamases.
Therefore, similar patterns in infectious agent structure were found in Purulent Osteology Department patients with various infectious processes: staphylococci predominance and circulation of a great number of antibiotic multiresistant microorganisms. A thorough microbiological monitoring enables determining of phenotype and genotype of antibiotic resistance and prescribing a balanced antimicrobic therapy.
Keywords: hospital infection, antibiotic resistance, resistance determinants.
Актуальность проблемы хирургической инфекции определяется значительной распространенностью заболевания, сложностью этиологической диагностики, тяжестью и длительностью лечения. Несмотря на достижения современной медицины, частота неудовлетворительных результатов лечения хирургической инфекции в целом остается достаточно высокой [1-5]. Традиционные схемы лечения больных основаны на хирургической санации очага в комплексе с антибактериальной терапией. Однако на сегодняшний день процесс лечения многократно усложнился за счет распространения приобретенной антибиотикорезистентности возбудителей [6, 7]. Продолжительность нетрудоспособности, стоимость лечения инфекционных осложнений, высокий процент инва-лидизации определяют социально-экономическую значимость борьбы с инфекцией в отделениях гнойной хирургии.
Материалы и методы В работе проанализированы 434 штамма микроорганизмов, выделенных у 384 пациентов, лечившихся в отделении гнойной остеологии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России в течение 2014 года. Среди всех пациентов 193 человека лечились по поводу глубокого нагноения по-
сле эндопротезирования крупных суставов, 138 больных - по поводу хронического остеомиелита различной локализации, 43 пациента - по поводу синдрома диабетической стопы.
Видовая идентификация микрофлоры проводилась на анализаторе iEMS Reader FM (Labsystems, Финляндия) c помощью набора тест-систем (Lachema, Чехия). Анализ видового состава микрофлоры и устойчивости к антибактериальным препаратам осуществляли с помощью компьютерной программы «Микроб-автомат».
Антибиотикорезистентность определялась диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон с помощью сенси-дисков (Bio-Rad Laboratories), минимальные подавляющие концентрации препаратов (МПК) рассчитывали на анализаторе антибиотикограмм «ADAGIO» (Bio-Rad Laboratories) [8].
Выявление генов наиболее распространенных метало^-лактамаз (группы Vim, Imp, NDM) и сериновых карбапене-маз (групп КРС и типы ОХА-48, 0ХА-40), а также видоспецифических ОХА-51 осуществляли методом ПЦР с гибридизаци-онно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» с использованием коммерческих
наборов «АмплиСенс MDR MBL-FL», «АмплиСенс MDR КРС/ОХА-48-FL» и «АмплиСенс MDR Acinetobacter ОХА-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Амплификация проводилась на приборе «Rotor Gene 6000» (Corbet Research, Австралия) в соответствии с методическими указаниями к наборам. Детекция бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) проводилась с помощью Е-тестов с цефтазидимом и цефтазидим/клавуланатом (Bio Merieux, Франция). Для сравнения зоны задержки использовали штамм E.coli АТСС 25922, не продуцирующий бета-лактамазы и штамм E.coli АТСС 700603, продуцирующий БЛРС. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica общепринятыми методами.
Этиология инфекционн отделения гно\
Результаты и их обсуждение
При изучении этиологической структуры возбудителей инфекции в отделении гнойной остеологии выявлено, что в среднем грамположительных микроорганизмов вдвое больше (302 штамма), чем грамотрицательных (132 штамма). Подавляющее число грамположительных бактерий - это стафилококки.
Анализ структуры грамотрицательных возбудителей показал преобладание неферментирующих грамотрицательных палочек, энтеробактерии выделялись реже. Среди неферментирующих бактерий чаще выделялась Ps.aeruginosa, а половину энтеробактерий у пациентов с периим-плантной инфекцией и остеомиелитом составила K.pneumoniae. Структура возбудителей инфекции в разных группах пациентов представлена в таблице 1.
Таблица 1
процессов у пациентов т остеологии
Возбудители инфекции Группы пациентов
Периимплантная инфекция Хронический остеомиелит Синдром диабетической стопы
S. aureus 77 76 16
S. epidermidis 50 25 9
P.aeruginosa 20 19 12
A.baumanii 15 3 11
K.pneumoniae 11 6 2
E.coli 6 2 4
Proteus spp. 4 3 5
E.cloacae 1 0 5
Enterococcus spp. 10 4 12
Из общего числа 203 микроорганизмов, выделенных у пациентов с периим-плантной инфекцией, стафилококки составили 62,5%, при этом золотистых стафилококков было выделено 77 изолятов, коагулазонегативных - 50 штаммов. Ме-тициллинрезистентные штаммы среди S.aureus (MRSA) составили 33,7%, среди коагулазонегативных стафилококков (MRSE) -32%, т.е. можно сказать, что среди всех стафилококков - возбудителей периим-плантной инфекции - каждый третий изо-лят является госпитальным штаммом.
Второе место по частоте выделения занимают неферментирующие грамотри-цательные палочки (28,0%), среди которых 20 изолятов составили P.aeruginosa и 15 - A.baumanii. Далее следуют энтеро-бактерии, которых всего выделено 22 штамма, причем 11 из них - это клебсиел-лы. Энтерококки всегда выделялись в ассоциациях с вышеперечисленными микроорганизмами, а не самостоятельно.
Среди неферментирующих грам-отри-цательных палочек значительное количество штаммов отличались устойчивостью к различным антибактериальным препаратам.
/°>У
Р JS ¿Г .
«г ^
W
V (V
J*
у
/V /// ///У
¿О* А> У <2>Л
Ц 32,5%
J 53,4% Щ 56,2%
Ц 82,1%
J 41,7%
1 79,3%
139,2%
3 3,2%
J 36,0%
\48.1%
2 68,5%
78,2%
14,3%
22,1%
| 61,4% ZU 68,4%
24,1%
J 22,9%
J 29,5%
51,4% 59,3% 57,6%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
□ Резистентность A.baumanii
□ Резистентность Ps.aeruginosa
Рис. 1. Резистентность неферментирующих грамотрицательных бактерий, выделенных у пациентов с периимплантной инфекцией
Проведенные молекулярно-
генетические исследования показали, что 4 изолята P.aeruginosa среди выделенных штаммов являлись продуцентами метал-ло-бета-лактамаз VIM группы и 1 - КРС группы. Из 15 штаммов A.baumanii у 9 изолятов выявлено наличие генов 0ХА-40 подобных карбапенемаз.
Среди энтеробактерий также встречались полирезистентные штаммы. 8 штаммов Klebsiella pneumoniae были полирезистентными в отношении трех и более классов антибактериальных препаратов. Фенотип резистентности Klebsiella pneumoniae представлен на рисунке 2.
/
1,3% 1,2% ] 2,7%
32,7% 2 30,6%
I 97,0% I 87,4% I 89,4% 81,3% 94,1%
»2> ■if
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
У
□ Резистентность Klebsiella pneumoniae
Рис. 2. Резистентность Klebsiella pneumoniae - возбудителей периимплантной инфекции
Все полирезистентные штаммы Klebsiella pneumoniae продуцировали бе-та-лактамазы расширенного спектра, продуцентов метало-бета-лактамаз среди клебсиелл не было выявлено.
Анализ 148 штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом, показал, что подавляющее большинство изолятов (68,2%), также как у больных с периимплантной инфекцией, составили стафилококки, из них 76 штаммов - S.aureus и 25 -S.epidermidis. Среди золотистых стафилококков было 20 штаммов MRSA, а среди
коагулазонегативных - 10 штаммов MRSE, т.е. третья часть всех стафилококков, выделенных при остеомиелите, были полирезистентными.
Из 23 неферментирующих грамотри-цательных палочек (22,9% всех микроорганизмов), выделенных у пациентов с обострением хронического остеомиелита, подавляющее большинство - 19 штаммов - составили P.aeruginosa, три штамма A. baumanii и один штамм Аlcaligenes faecalis. Фенотип резистентности синегнойных палочек у пациентов с остеомиелитом в анализируемый период имел свои отличия (рис. 3).
Рис. 3. Резистентность синегнойных палочек, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом
У Н tf *
/VV
JA че <9 к
^ ifi О*
/•у /V
/W
А*
О* ^ ^ 1
к* ■
^ .«Г
0,0%
0,0%
0,0%
7,8%
7,7% 7,7%
16,2% 15,7%
23,1% 25,0%
38,5%
15,6%
15,4%
,ЯГ »О V®
vv
Ф л® 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
□ Резистентность синегнойных палочек
Как видно из рисунка, резистентность штаммов P.aeruginosa, выделенных из остеомиелитических очагов, ниже резистентности изолятов P.aeruginosa, обнаруженных при периимплантной инфекции. У двух полирезистентных штаммов выявлен ген, кодирующий продукцию ме-талло-бета-лактамаз VIM группы.
Три штамма A.baumanii, выделенные у пациентов с хроническим остеомиелитом, были полирезистентными и фенотипически
не отличались от таковых у пациентов с пе-риимплантной инфекцией, кроме того, у них выявлен ген, кодирующий продукцию ОХА-40 подобных карбапенемаз.
Фенотип и генотип резистентности эн-теробактерий при остеомиелите не отличался своеобразием. Четыре из шести клебсиелл и один штамм из двух выделенных E.coli продуцировали БЛРС, проявляя резистентность ко всем цефалоспоринам, фторхино-лонам и тикарциллину/клавуланату.
Группа больных с синдромом «диабетической стопы» была самой немногочисленной по сравнению с другими группами пациентов, получавших лечение в отделении гнойной остеологии в отчетный период. Из «диабетических очагов» было выделено 83 микроорганизма, среди которых стафилококки составили 30,1%, что в два раза меньше, чем у пациентов с другими заболеваниями в этом отделении. Золотистых стафилококков обнаружено 16 штаммов, из них 6 - метициллинрезистентных, коагулазонегативных изолятов было 9, из них 4 - метициллинрезистентных, т.е. более
трети всех стафилококков являются «проблемными» и требуют для эрадикации специальной антибактериальной терапии.
Грамотрицательных палочек у пациентов с синдромом «диабетической стопы» было выделено вдвое больше (48,4%), чем у других пациентов, большинство из них (23 штамма) составили неферменти-рующие бактерии и 16 штаммов - энтеро-бактерии. Среди грамотрицательных не-ферментирующих бактерий было 12 изо-лятов P.aeruginosa и 11 A.baumanii. Фенотип резистентности неферментирующих палочек представлен на рисунке 4.
/» Н
* vv
/у
Z>°> i
/ // -I
/Л4 А'
# оГ A* jr ^
^ о/ V „
^ <4® .
* ¿r ^
^V* 0%
82,1%
L40
58,0% J%
_\51,6% 50,0%
75,4%
20% 40%
60% 80% 100%
□ Резистентность A.baumanii
□ Резистентность Ps.aeruginosa
Рис. 4. Резистентность неферментирующих грамотрицательных бактерий, выделенных у пациентов с синдромом диабетической стопы
Более половины всех неферменти-рующих бактерий были резистентны к цефалоспоринам III-IV поколений. К цеф-тазидиму устойчивость проявляли 40,1% штаммов A.baumanii, в то же время к до-рипенему среди ацинетобактеров были устойчивы половина изолятов. Все карба-пенемрезистентные штаммы исследованы на наличие бета-лактамаз. Результаты мо-
лекулярных исследований показали, что два штамма Ps.aeruginosa экпрессировали ген, кодирующий продукцию метало-бета-лактамаз Vim-типа, а у трех штаммов A.baumanii выявлен ген 0ХА-40 подобных карбапенемаз.
Группу энтеробактерий, выделенных у пациентов с синдромом «диабетической стопы», составили 5 изолятов Enterobacter
cloacae, 5 изолятов Proteus spp., 4 штамма E.coli и 2 штамма Klebsiella pneumoniae. Три штамма энтеробактерий - обе клеб-сиеллы и одна кишечная палочка - продуцировали БЛРС, остальные изоляты отличались хорошей чувствительностью к антимикробным препаратам разных классов.
Анализ возбудителей инфекции у пациентов отделения гнойной остеологии показал, что чаще других микроорганизмов выделяются стафилококки. Молекулярно-генетические исследования свидетельствуют о высокой частоте обнаружения mecA гена как у золотистых, так и коагулазонега-тивных стафилококков, подтверждая фенотип метициллинрезистентных штаммов. В целом антибиотикорезистентность стафилококков у пациентов с разной патологией была практически одинаковой.
Анализируя устойчивость синегной-ных палочек в отношении антимикробных препаратов, следует отметить, что полирезистентные штаммы чаще выделялись у пациентов с периимплантной инфекцией, чем у пациентов с хроническим остеомиелитом и синдромом диабетической стопы. Та же закономерность наблюдалась у выделенных A.baumanii. Возбудители пери-имплантной инфекции нередко обладают фенотипом полирезистентных госпитальных микроорганизмов. Все более широкое назначение карбапенемов ведет к увеличению числа карбапенемрезистеных штаммов среди грамотрицательных микробов, что еще раз подчеркивает необходимость тщательного анализа фенотипа и генотипа полирезистентных штаммов для назначения адекватной антибиотикотерапии.
В силу большого количества бета-лактамаз продуцирующих штаммов среди энторобактерий, особенно среди клебси-елл, назначение цефалоспоринов, включая
Литература
1. Алексеев Д.Г. Комплексное лечение хронического остеомиелита с применением рациональной антиинфекционной химиотерапии и иммунокор-
цефепим, не может рассматриваться как рациональная терапия. Для полноценной эрадикации энтеробактерий также необходимо привлечение молекулярно-генети-ческих методов исследования, позволяющих наиболее тщательно подобрать антимикробный препарат.
Заключение Таким образом, пациентов отделения гнойной остеологии, несмотря на различные нозологические формы, объединяют основные возбудители инфекционных процессов. Чаще других микроорганизмов выделяются S.aureus и S.epider-midis, третья часть из которых экспресси-руют ген mec A, а значит, обладают высокой перекрестной устойчивостью ко всем Р-лактамам и ассоциированной устойчивостью к антибиотикам других групп. Наибольшую антистафилококовую активность в отношении этих стафилококков показали ванкомицин и линезолид. Второе место по частоте выделения занимают неферментирующие грамотрицательные палочки - Ps.aeruginosa и A.baumanii, в значительной доле случаев полирезисте-ные к антимикробным препаратам. Максимально активными для эрадикации Ps.aeruginosa и A.baumanii были карбапе-немы и цефоперазон/сульбактам.
В рамках одного отделения для купирования инфекции без тщательного микробиологического анализа крайне сложно назначить адекватную рациональную антимикробную терапию. В терапии инфекционных процессов у пациентов отделения гнойной остеологии предпочтительной может быть комбинированная антибактериальная терапия, которая эффективна в отношении полирезистентных штаммов особенно при хронической или рецидивирующей инфекции.
Конфликт интересов отсутствует.
рекции: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Самара, 2006. 36 с. 2. Божкова С.А., Тихилов Р.М., Краснова М.В., Рукина А.Н., Тишина В.В., Полякова Е.М. Профиль резистентно-
сти возбудителей как основа выбора 2 эффективного антибиотика при стафилококковых инфекциях протезированных суставов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2013. Т. 15, №2. С. 115-120.
3. Теплякова О.В., Руднов В.А., Шлыкова Г.И., Доценко Т.Г. Септический артрит у взрослых // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015. Т. 17, №3. С. 187-206.
4. Slater R., Lazarovitch I., Boldur I .Swab cultures accurate ly identify bacterial pa- 3 thogens in diabetic foot wounds not involving bone // Diabet Med. 2004. Vol.
21. P. 705-709.
5. Ong K.L., Kurtz S.M., Lau E., Bozic K.J., Berry D.J., Parvizi J. Prosthetic joint infection risk after total hip arthroplasty in the 4. medicare population //J. Artrhroplasty. 2009. Vol. 24 (6 Suppl.). S105-109.
6. Гостев В.В., Гончаров А.Е., Грачева М.А., Сидоренко С.В. Распростране- 5 ние генов комплекса Immune evasion claster и других факторов вирулентности у Staphylococcus aureus // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2013. Т. 15, №4. 6 С. 270-279.
7. Lie S.A., Havelin L.I., Furnes O.N., En-gesaeter L.B., Vollset S.E. Failure rates for 4762 revision total hip arthroplasties in the Norwegian Arthroplasties Register // J.Bone Jt. Surg. 2004. Vol. 86-B, №4. P. 504-509.
8. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». М., 2004. 7
References
1. Alekseev DG. Kompleksnoe lechenie hronicheskogo osteomielita s primene-niem racional'noj antiinfekcionnoj himi-oterapii i immunokorrekcii [Comprehen- 8 sive treatment of chronic osteomyelitis with the use of a balanced anti-infectious chemotherapy and immune correction]: avtoref. dis. ... kand. med. nauk. Samara; 2006. (in Russian)
Bozhkova SA, Tihilov RM, Krasnova MV, Rukina AN, Tishina VV, Poljakova EM. Profil' rezistentnosti vozbuditelej kak osnova vybora jeffektivnogo antibiotika pri stafilokokkovyh infekcijah pro-tezirovannyh sustavov [Agent resistance profile as a basis for choosing an effective antibiotic for staphylococcal infections of prosthetic joints]. Klin mikrobiol antimikrob himioter. [Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy]. 2013; 15(2): 115-120. (in Russian) Tepljakova OV, Rudnov VA, Shlykova GI, Docenko TG. Septicheskij artrit u vzroslyh [Septic arthritis in adults]. Klin mikrobiol antimikrob himioter. [Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy]. 2015; 17(3): 187-206. (in Russian) Slater R, Lazarovitch I, Boldur I. Swab cultures accurate ly identify bacterial pathogens in diabetic foot wounds not involving bone. Diabet Med. 2004; 21: 705-9. Ong KL, Kurtz SM, Lau E, Bozic KJ, Berry DJ, Parvizi J. Prosthetic joint infection risk after total hip arthroplasty in the medicare population. J Artrhroplasty. 2009; 24 (6) Suppl: S105-109. Gostev VV, Goncharov AE, Gracheva MA, Sidorenko SV. Rasprostranenie ge-nov kompleksa Immune evasion claster i drugih faktorov virulentnosti u Staphy-lococcus aureus [Dissemination of Immune evasion claster genes and other virulence factors in Staphylococcus aureus]. Klin mikrobiol antimikrob himioter. [Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy]. 2013; 15(4): 270-279. (in Russian) Lie SA, Havelin LI, Furnes ON, Engesae-ter LB, Vollset SE. Failure rates for 4762 revision total hip arthroplasties in the Norwegian Arthroplasties Register. J. Bone Joint Surg. 2004; 86-B (4): 504-509. Metodicheskie ukazanija MUK 4.2.1890-04 «Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroor-ganizmov k antibakterial'nym prepara-tam» [Guidelines «Susceptibility Testing of Microoganisms to Antibacterial Agents»]. Moscow; 2004. (in Russian)
Митрофанов В.Н. - к.м.н., ведущий научный сотрудник группы гнойной остеологии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, г. Нижний Новгород.
Гординская Н.А. - д.м.н., руководитель отделения лабораторной диагностики ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, г. Нижний Новгород. E-mail: info@nniito.ru
Сабирова Е.В. - биолог лаборатории бактериологии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, г. Нижний Новгород.
Абрамова Н.В. - биолог лаборатории бактериологии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, г. Нижний Новгород.
Карасева Г.Н. - к.м.н., врач-бактериолог ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, г. Нижний Новгород.
