Значение иммуногенетических факторов в развитии глютенчувствительной целиакии у взрослого населения Московского региона Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Б >

сг

So L 2

о i

Я--

Щ а

^ Г х с mt:

о а

ЗНАЧЕНИЕ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ £

ГЛЮТЕНЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЦЕЛИАКИИ У ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ *

МОСКОВСКОГО РЕГИОНА

ш т

Пухликова Т.В.1, ЛебедеваЛ.Л.1, Сабельникова Е.А.2, Астрелина Т.А.1, Яковлева М.В.1 |

1 Государственное учреждение здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток ^

Департамента здравоохранения Москвы»

2 ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы

Сабельникова Елена Анатольевна 111123, Москва, шоссе Энтузиастов, д. 86 E-mail: gastroen [email protected]

РЕЗЮМЕ

В исследовании изучалась генетическая предрасположенность к развитию глютенчувствительной целиакии (ГЦ). Проанализированы образцы периферической крови 17 взрослых пациентов с диагнозом ГЦ, а также образцы пуповинной крови 1700 новорожденных, условно здоровых детей. HLA-типирование проводилось с помощью двух основных методов молекулярного типирования — SSO и SSP.

В результате проведенных исследований были выявлены специфичности HLA-B*08; HLA-DRB1*03; HLA-DRB1*07 и HLA-DQB1*02, являющиеся генетическими маркерами ГЦ. Выявлены сочетания HLA-маркеров ГЦ, каждое из которых является генетическим маркером ГЦ: HLA^*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02 и HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02/HLADQB1*03. Кроме того, были выявлены отрицательные ассоциации с ГЦ по специфичности HLA-DQB1*05. Таким образом, результаты работы свидетельствуют о возможности прогнозирования индивидуального риска развития ГЦ у здорового населения и в семьях больных ГЦ.

Ключевые слова: глютенчувствительная целиакия; HLA-ассоциированные заболевания; HLA-типирование; генетическая предрасположенность; диагностика.

SUMMARY

The study examined the genetic predisposition to the development of glutensensitive celiac disease (CD). Were analyzed samples of peripheral blood of 17 adult patients diagnosed with CD, as well as samples of umbilical cord blood of 1700 newborns of healthy children. HLA-typing was performed using two basic methods of molecular typing — SSO and SSP. The studies revealed the specificity of HLA-B*08; HLA-DRB1*2003; HLA-DRB1*07 and HLA-DQB1*02, which are the genetic markers of CD. Was identified a combination of HLA-markers of CD, each of which is a genetic marker for CD: HLA-B*08; HLA-DRB1*2003; HLA-DQB1*02 and HLA-DRB1*2007; HLA-DQB1*02/HLADQB1*03. In addition, negative associations were identified with CD specificity of HLA-DQB1*05. Thus, the results indicate the possibility of individual risk predicting of CD developing in a healthy population and in families of patients with CD.

Keywords: glutensensitive celiac disease; HLA-associated diseases; HLA-typing, genetic predisposition, diagnosis.

В настоящее время роль генетической предрасположенности в развитии ГЦ не вызывает сомнения. Существует большая группа HLA-ассоциированных заболеваний. Для части из них ассоциации с ЫХА-антигенами являются слабыми или случайными, для других — настолько выражены, что нет сомнения, что один или более генов вовлечены в патогенез заболевания. В настоящее время достигнуты значительные успехи в установлении причин и механизмов развития

ГЦ. В связи с этим возрос интерес к разработке и использованию скрининговых программ для ранней диагностики ГЦ и выявления групп риска среди родственников пациентов с подтвержденным диагнозом. Доказана ассоциация заболевания с антигенами главного комплекса гистосовместимости человека HLA-DQ2 (DQA1*0501, DQB1*0201) и ША^8 ДОА1*0301, DQB1*0302) [1 -3]. Указанные гликопротеиды расположены на поверхности макрофагов, Т- и В-лимфоцитов

О

№03/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ

CD

CN

и выполняют рецепторные функции. Есть основание предполагать, что именно они ответственны за распознавание «токсичных» фракций глиадина и последующего запуска комплекса иммунопатологических процессов [3-16]. Гетеродимер DQ2 обнаруживается приблизительно у 90-95% больных целиакией [3; 7]. Он сформирован альфа-цепочкой, кодируемой аллелями DQA1*05, и бета-цепочкой, кодируемой аллелями DQB1*0201 или DQB1*0202. Однако аллель HLA-DQ2 является распространенным в популяции, он определяется приблизительно у 30% белых европейцев без всяких признаков заболевания ГЦ [1; 3; 9]. Гетеродимер DQ8, связанный с целиакией, присутствует у 5 - 10% больных. Он также сформирован альфа- и бета-цепочками, кодируемыми DQA1*03 и DQB1*0302 соответственно [3; 8]. Некоторые исследователи отмечают ассоциацию ГЦ с антигенами В8 и DR3 [2]. Накоплено значительное количество данных о том, что в возникновении ГЦ важную роль играет не просто наличие определенных антигенов, а комбинация антигенов гистосовместимости I и II классов [10; 12]. Во многих исследованиях отмечается, что в возникновении ГЦ важную роль играют как отдельные гены HLA I и II классов, так и их комбинация [14].

Выявление иммуногенетических маркеров глютенчувствительной целиакии является в настоящее время крайне актуальной проблемой. Актуальность проблемы определяется повышенным интересом врачей-гастроэнтерологов всего мира к ГЦ и потребностью в дополнительных методах диагностики данного заболевания. Широкое внедрение в медицинскую практику новых молекулярно-генетических диагностических методов исследования определяет необходимость их использования в качестве дополнительных методик диагностики ГЦ.

Целью данного исследования явилось определение генетической предрасположенности к развитию ГЦ и риска возникновения заболевания с учетом иммуногенетических характеристик у взрослого населения Москвы, а также выявление связи с клиническими формами заболевания.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено две группы: группу больных составили 17 взрослых пациентов в возрасте от 19 лет до 81 года (средний возраст — 48,4 ± 17,3) с диагнозом ГЦ, установленным в ЦНИИ гастроэнтерологии; контрольная группа была представлена 1700 образцами пуповинной крови новорожденных, условно здоровых детей, родившихся на 37-41-й неделе гестации в Москве, прошедшие тестирование на вирусную и микробную контаминацию и внесенные в реестр неродственных доноров в Москве за период с 2004 по 2009 год.

Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов крови методом сепарации

на магнитных частицах с использованием сертифицированных коммерческих наборов BioSprint 15 DNA Blood kit фирмы Qiagen (США). HLA-типирование проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух методов молекулярного генетического типирования: генотипирование методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов (SSO) и генотипирование методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров (SSP). Молекулярное типирование проводилось на уровне групп аллелей (специфичностей). Основным методом для выявления HLA-специфичностей, характерных для больных ГЦ, был метод SSO. Для проведения амплификации готовили рабочую смесь следующего состава: 7,5 мкл 0,6-мМ MgCl2; 15 мкл Маз1егш1х (включающий 30%-ный глицерол, 100-мМ KCl, нуклеотиды, биотинили-рованные праймеры и 100 ед /мл Taq polymerase); 7,5 мкл ДНК (концентр. 13- 15 нг/мкл). Режим амплификации представлен в табл. 1. Общая продолжительность амплификации составляла 1,5 часа. Искомые специфичности улавливались с помощью метода блот-гибридизации, представляющего собой процесс конъюгации специфических участков ДНК с олигонуклеотидными зондами (Sequence Specific Oligonucleotides), фиксированными на специальных полосках-стрипах. Конъюгированные фрагменты окрашивались пероксидазой (Invitrogen, USA). Полученные результаты со стрипа считывались с помощью сканера AutoCam. Интерпретацию результатов проводили в автоматическом режиме с помощью программы Dynal PMP.

Метод SSP (Sequence Specific Primer), основанный на улавливании в прцессе амплификации искомых участков ДНК аллель-специфическими праймерами, использовался для исключения двойных интерпретаций и выявления специфических аллелей DQB1*.

Были протипированы все HLA — локусы I класса: А*, В*, Cw* и II класса: DRB1* и DQB1* среди здоровых доноров московской популяции и взрослых пациентов с установленным диагнозом ГЦ. Для изучения генетической предрасположенности к ГЦ был проведен сравнительный анализ как отдельных аллельных вариантов всех генов HLA, так и их межлокусных сочетаний в генотипе больных и в контрольной группе.

Статистический анализ исследования ассоциаций проводился с использованием современных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные частот встречаемости специфичностей, выявленных как статистически значимые положительные ассоциации с ГЦ, представлены на рис. 1. Установлено, что специфичность HLA-A*01 встречалась у взрослых пациентов с ГЦ в 2,3 раза

чаще, чем в контрольной группе; специфичность HLA-B*08 — в 6,5 раза чаще; специфичнорсть HLA-Cw*07 — в 2 раза чаще; специфичность HLA-DRB1*03 — в 7,2 раза чаще; специфичность HLA-DRB1*07 — в 1,8 раза чаще и HLA-DQB1*02 у взрослых пациентов с ГЦ встречалась в 3,6 раза чаще, чем в контрольной группе. Достоверного отличия, позволяющего исключить «нулевую гипотезу» по специфичности HLA-DQB1*03, некоторые аллели которой экспрессируют гетеродимер DQ8, ассоциированный с ГЦ, выявлено не было. У взрослых пациентов специфичность DQB1*03 выявлялась реже, чем в контрольной группе. Возможно, такой результат связан с немногочисленностью группы пациентов. Этот факт, несомненно, требует дальнейшего изучения.

По частоте встречаемости других специфичностей всех исследуемых локусов группа пациентов и контрольная группа не различались.

Помимо групп аллелей (специфичностей), выявленных как положительные статистически значимые ассоциации с ГЦ, была выявлена статистически значимая ассоциация с ГЦ по группе аллелей HLA-DQB1*05 (группа больных — 2,94% (/ = 0,0294); контрольная группа — 19,94% (/ = 0,1994); р = 0,0045).

Для дальнейшего анализа связи выявленных статистически значимых групп аллелей (специфичностей) с ГЦ, был произведен подсчет показателей RR (относительный риск развития

заболевания), OR (отношение шансов возникновения заболевания), EF (этиологическая фракция), PF (превентивная фракция). Для всех величин вычислялся доверительный интервал, р < 0,05.

Из табл. 2 видно, что высокие значения показателей относительного риска развития заболевания, отношение шансов, этиологическая фракция для групп аллелей (специфичностей) с положительной ассоциацией в группе больных отмечены для всех специфичностей, выявленных у пациентов, как положительные статистически значимые ассоциации с ГЦ. Для всех специфичностей (кроме HLA-А*01) эти показатели достоверны (р < 0,05) и доверительные интервалы не проходят через единицу. Следует отметить высокое значение ЯЯ и ОЯ для специфичностей HLA-В*08, HLA-DRB1*03 и HLA-DQB1*02 и значительное превышение единицы величин доверительных интервалов, что говорит о значительной выраженности ассоциации с ГЦ. Все величины отношения шансов превышают величины относительного риска, что способствует развитию заболевания.

В табл. 3 представлены величины рисков и превентивной фракции для специфичностей, выявленных как статистически значимые отрицательные ассоциации в группе сравнения. Если

Б >

а

5 О

I- 2

О і

£

Щ а

Н £ X с Шт:

О

а

н

и

га

і.

Б

га

й

<и

т

X

5

<

Таблица 1

РАБОЧИЙ ТЕМПЕРАТУРНЫЙ РЕЖИМ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ 880

Шаг Температура (°С) Время (с) Процесс

95 15 Денатурация

35 циклов 60 45 Отжиг

72 15 Элонгация

1 цикл 72 5 мин. Удержание

15 Постоянно Удержание

Таблица 2

ГРУППЫ АЛЛЕЛЕЙ (СПЕЦИФИЧНОСТИ) С ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ АССОЦИАЦИЕЙ: ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ РИСК РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ОТНОШЕНИЕ ШАНСОВ, ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ФРАКЦИЯ

ША- специфичности RR СІ* 0R СІ* EF (%) СІ*

А*01 2,733 1,286- 5,809 2,776 1,286- 5,994 16,94 0,151- 33,72

В*08 10,28 5,291-19,96 10,91 5,468 -21,76 40,07 22,17- 57,98

Сш*07 3,198 1,639-6,242 3,247 1,648 -6,398 36,64 14,01 - 59,26

DRB1*03 11,94 6,176 -23,09 12,82 6,432 -25,46 43,38 25,43 -61,33

DRB1*07 2,081 1,091- 7,238 2,846 1,091- 7,424 34,34 1,177-67,51

DQB1*02 11,69 5,317 - 25,69 12,12 5,463 -26,91 70,16 52,08 - 88,25

Примечание: ОК — величина отношения шансов; КК — величина относительного риска; БГ — величина этиологической фракции; С1 — доверительный интервал; #— р < 0,05.

№03/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ

ГРУППЫ АЛЛЕЛЕЙ (СПЕЦИФИЧНОСТИ) С ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ АССОЦИАЦИЕЙ: ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ

РИСК РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ОТНОШЕНИЕ ШАНСОВ, ПРЕВЕНТИВНАЯ ФРАКЦИЯ

ЖА- специфичности RR СІ* 0R СІ* РF (%) СІ*

А*24 0,000 1,000-1,290 0,000 0,989-1,294 100 —

В*44 0,000 1,000-1,236 0,000 0,990-1,239 100 —

о о DRB1*13 0,000 1,000-0,815 0,000 0,989-0,813 100 —

о DRB1*15 0,000 1,000-0,884 0,000 0,989-0,883 100 —

1 DQB1*03 0,438 0,182 -1,054 0,435 0,179-1,053 56,54 5,302 - 82,06

DQB1*05 0,110 0,015 - 0,806 0,109 0,015 - 0,799 89,09 20,09-98,51

1 DQB1*06 0,000 1,000-0,432 0,000 0,989-0,428 100 —

Примечание: ОК — величина отношения шансов; КК — величина относительного риска; БГ — величина этиологической фракции; С1 — доверительный интервал; #— р < 0,05.

Таблица 4

ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ РИСК РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ОТНОШЕНИЕ ШАНСОВ И ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ФРАКЦИЯ ДЛЯ ГРУПП СОВМЕСТНО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ СПЕЦИФИЧНОСТЕЙ В ГРУППЕ БОЛЬНЫХ ГЦ И КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ

Совместно встречающиеся HLA-специфичности RR СІ* 0R СІ* EF (%) СІ*

ША-В*08; ША^В1*03; ША^В1*02 26,42 9,44 - 73,93 28,75 9,976-105,2 68,13 44,66-91,6

ША^В1*07; ША-DQB1*02/HLA-DQB1*03 4,883 1,746 -13,65 5,032 1,746 -14,52 23,57 1,0919 -47,04

Примечание: ОК — величина отношения шансов; КК — величина относительного риска; БГ — величина этиологической фракции; РГ — величина превентивной фракции; С1 — доверительный интервал, *— р < 0,05.

Рис. 1. Сравнение частоты встречаемости статистически значимых специфичностей в группе больных с ГЦ и контрольной группе (в %)

Б >

а

5 О

І. 2

о і

Я--

Щ а

х с

Шт:

О

а

і-

и

га

ь

Б

га

ч/

й

<и

т

X

5

<

Рис. 2. Частота встречаемости групп специфичностей

специфичность в данной группе не встречалась (HLA-А*24; HLA-В*44; HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*15, HLA-DQB1*06), величины относительного риска и отношения шансов равнялись нулю, а доверительные интервалы стремились к нулю, р < 0,05. Доверительный интервал РБ специфичности HLA-DQB1*05 не проходил через единицу, что позволяет говорить об устойчивости к развитию целиакии при наличии специфичностей, доверительный интервал РБ специфичности HLA-DQB1*03 проходил через единицу и не позволял учитывать данную специфичность как отрицательный маркер. Следовательно, достоверно значимой можно считать только специфичность HLA-DQB1*05.

При исследовании HLА-генотипов пациентов с ГЦ было обнаружено, что некоторые специфичности, определяющиеся как статистически значимые положительные ассоциации, встречаются в определенных сочетаниях. Был произведен подсчет частот встречаемости подобных сочетаний, а также величин относительного риска и отношения шансов возникновения ГЦ при выявлении в генотипе следующих совместно встречающихся специфичностей:

Первая комбинация — HLA-В*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02.

Вторая комбинация — HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02 / HLA-DQB1*03.

Как видно из рис. 2, первая комбинация совместно встречающихся специфичностей выявлялась у пациентов с ГЦ в 9,2 раза чаще, чем в контрольной группе. Вторая комбинация — в 2,4 раза чаще. Величины относительного риска, отношения шансов и этиологической фракции в группе пациентов с ГЦ, как видно из табл. 4, подтверждали связь двух комбинаций совместно встречающихся специфичностей с возможностью развития ГЦ.

В результате анализа клинических проявлений целиакии в группе больных ГЦ не было выялено разницы между клиническими проявлениями в зависимости от варианта совместно встречающихся HLA-специфичностей в генотипе пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования было выявлено, что значимыми факторами генетической предрасположенности к развитию ГЦ являются отдельные специфичности (HLA-B*08, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*07 и HLA-DQB1*02) и сочетания специфичностей в генотипе пациентов (HLA-В*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1*02 и HLA-DRB1*07; HLA-DQB1*02 / HLA-DQB1*03), каждое из которых является самостоятельным генетическим маркером ГЦ. Данные специфичности и их сочетания в генотипах являются общими для взрослых пациентов и детей с ГЦ. Выявлена отрицательная ассоциация с ГЦ по группе аллелей HLA-DQB1*05. Полученные результаты имеют прогностическое значение, позволяя выявлять индивидуальный риск развития заболевания и проводить генетическое прогнозирование среди здорового населения и в семьях больных ГЦ. Выявление у новорожденных детей специфических маркеров системы HLA молекулярным методом ПЦР рекомендуется учитывать как фактор риска развития заболевания. Полученные молекулярным методом ПЦР данные распределения генов HLA-системы у пациентов с ГЦ, характерные для московской популяции, рекомендуется использовать для проведения подобных исследований в медицинских учреждениях аналогичного профиля других регионов России для выявления групп риска и создания регистра больных ГЦ.

№03/2011 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ

ЛИТЕРАТУРА

1. Коровина Н. А., Захарова И. Н., Лысиков Ю. А. и др. Клинические аспекты целиакии у детей: пособие для практикующих врачей — педиатров. — М.: МедЭкспертПресс, 2007. — С. 8-25, 45-47.

2. Зарецкая Ю.М., Леднев Ю.А. HLA 50 лет: 1958-2008. — Тверь: Триада, 2008. — С. 24-53.

3. Парфенов А. И. Целиакия. Эволюция представлений о распространенности, клинических проявлениях и значимости этиотропной терапии. А. И. Парфенов. — М.: Анахарсис, 2007. — С. 14-50, 126-148.

4. Бельмер С. В. Целиакия. Иммунологическая теория патогенеза целиакии // РМЖ. — С. 1996. — Т. 4, № 3. — С. 15.

5. Green P. H. The many faces of celiac disease: clinical presentation of celiac disease in the adult population // Gastroenterology. — 2005; — 128. — S. 74-78.

6. Green P. H., Cellier C. Celiac disease // N. Engl J. Med. — 2007. — Vol. 357. — P. 1731-1743.

7. Kim C. Y., Quarsten H., Bergseng E. et al. Structural basis for HLA-DQ2-mediated presentation of gluten epitopes in celiac disease // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 2004. — Vol. 101. — P. 4175-4179.

8. Agostoni C., Breagger C., Decsi T. et al. Breast-feeding: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2009. — Vol. 49, № 16. — P. 112-125.

9. Sollid L. M. Institute of Immunology, Rikshospitalet, University of Oslo, N-0027 Oslo, Norway/Molecular Basis of Celiac Disease // Ann. Reviev of Immunol. — 2000. — Vol. 18. — P. 53-81.

10. Вохмянина Н. В. Генетические маркеры целиакии // Мат. 10-го Славяно-Балтийского научного форума «Гастроэнтерология Санкт-Петербурга». — 2008, № 2-3. — С. М23.

11. Louka A. S., Sollid L.M. HLA in celiac disease: unraveling the complex genetics of a complex disorder // Tissue Antigens. — 2003. — Vol. 61. — P. 105-117.

12. Kati K. Dissecting genetic susceptibility to gluten sensitivity: HLA-linked risk factors in coeliac disease and dermatitis herpetiformis:

Academic dissertation. — Helsinki, 2003. — P. 28-29.

13. Arentz-Hansen H., McAdam S. N., Molberg O. et al. Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadins rich in proline residues // Gastroent. — 2002. — Vol. 123. — P. 803-809.

14. Lopez-Vazquez A., Fuentes D., Rodrigo L. et al. MHC class I region plays a role in the development of diverse clinical forms of celiac disease in a Saharawi population // Am. J. Gastroenterol. — 2004. — Vol. 99, № 4. — P. Р 662-667.

15. Rashtak S., Murray J.A. Tailored testing for celiac disease // Ann. Intern. Med. — 2007. — Vol. 147, № 5. — P. 339-341.

16. Megiorni F., Mora B., Bonamico M. et al. HLA-DQ and susceptibility to celiac disease: evidence for gender differences and parent-of-origin effects // Am. J. Gastroenterol. — 2008. — Vol. 103. — P. 997 - 1003.