CC BY
34
Original data
УДК 575.174.015.3:616.61-053.4/.66
ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА В РАЗВИТИИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
Ж. B. Шуцкая
ГОУ ДПО Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава, Городской диабетологический центр для детей и подростков СПб ГУЗ ДГП № 44, Россия
PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF GENETICS POLYMORPHISM IN THE DEVELOPMENT OF DIABETIC NEPHROPATHY IN CHILDREN AND ADOLESCENTS
Zh. V. Shuckaya
St-Petersburg Medical Academy of Postgraduate Studies;
City Diabetes Center for Children and Adolescents, City Children's Polyclinic № 44, Russia
© Ж. B. Шуцкая, 2011 г.
Представлены результаты исследования С677Т-полиморфизма гена МТГФР, уровня гомоцистеина в плазме крови у детей и подростков с сахарным диабетом (СД) 1-го типа для изучения целесообразности использования данных диагностических показателей в прогнозировании диабетической нефропатии (ДН). Проведено генотипирование С677Т-полиморфизма гена МТГФР у 141 пациента с СД 1-го типа. Установлена более высокая частота встречаемости ТТ генотипа у больных с ДН в сравнении с пациентами без нефропатии: 21,6 и 5,6% соответственно (р < 0,004). При проспективном исследовании 98 детей и подростков с СД 1-го типа c различными генотипами МТГФР обнаружено, что частота развития ДН выше у пациентов с ТТ-генотипом (33,3%) по сравнению с пациентами, имеющими генотип СС и СТ (10,5%) (р < 0,01). Обследование 29 детей и подростков с СД 1-го типа показало, что уровни гомоцистеина в плазме крови более высокие у больных с нефропатией (6,45 ± 1,88 мкмоль/л) по сравнению с уровнями у пациентов без ДН (5,55 ± 1,23) (р < 0,05). Гомозиготное носительство С677Т-полиморфизма гена МТГФР и гипергомоцистеинемия являются факторами риска развития ДН при СД 1-го типа у детей и подростков. Применение витаминов группы В приводит к снижению уровня гомоцистеинемии у больных с СД первого типа подростков.
Ключевые слова: диабетическая нефропатия, дети, подростки, С677Т полиморфизм МТГФР, гомо-цистеинемия.
The MTHFR T677T genotype was found significantly more frequently in 1 diabetes mellitus patients with diabetic nephropathy 21,6% compared with the patients without nephropathy 5,6% (р < 0,004). Thus, we suggest that T677T genotype of MTHFR gene is an independent risk factor for diabetic nephropathy. The supervision in dynamics of 98 patients with type one diabetes mellitus with different genotypes of MTHFR was done. The data obtained have shown higher frequency of diabetic nephropathy (DN) in individuals with TT genotype (33,3%) as compared with CC and TT genotype (10,5%) and CT (11,4%) genotypes (р < 0,01). The results of the study confirm that the detection of TT genotype may be used as one of prognostic criteria of prediction the development DN in clinical practice. The homocystein blood level was higher in adolescents with DN (6,45 ± 1,88) compared patients without nephropathy (5,55 ± 1,23) (р < 0,05). Results have demonstrated ability of B vitamins to reduce plasma concentrations of homocysteine in adolescents.
Keywords: diabetic nephropathy, children, adolescents, C677T polymorphism MTHFR, homo-cysteinemia.
Введение. Диабетическая нефропатия (ДН), являясь одним из специфических осложнений сахарного диабета 1-го типа (СД 1), рассматривается как полигенная мультифакторная патология [1]. Многофакторный генез нефропатии при СД 1 определяет необходимость изучения роли генетически детерминированных факторов
в развитии осложнения заболевания. До настоящего времени не обнаружен «главный» ген предрасположенности к нефропатии при СД [2]. С позиций клинической медицины наибольший интерес для изучения представляют полиморфизмы генов, являющиеся, с одной стороны, диагностическими маркерами предрасположенности к ДН,
Оригинальное научное исследование
с другой — фенотипическая экспрессия которых доступна фармакологической коррекции. Достаточно эффективно этим требованиям отвечает С677Т-полиморфизм гена метилентетра-гидрофолатредуктазы (МТГФР), гомозиготное носительство которого ассоциировано с повышением гомоцистеина в плазме крови. При этом существенной является возможность коррекции гомоцистеинемии [3].
Целью настоящего исследования являлось изучение роли С677Т полиморфизма гена МТГФР, определение значения повышенной концентрации гомоцистеина в плазме как факторов риска ДН, изучение эффективности коррекции гомо-цистеинемии.
Материалы и методы. Идентификация С677Т-полиморфизма гена МТГФР проведена у 203 больных с СД 1-го типа с дебютом основного заболевания в детском возрасте. Пациенты, включенные в исследование, являлись жителями Санкт-Петербурга и не были связаны узами родства.
ДНК обследованных больных выделена фенол-хлороформным методом. С677Т-полимор-физм гена МТГФР определяли методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Исследования проведены на базе лаборатории молекулярной генетики СПбГПМА (руководитель лаборатории — профессор Е. И. Шварц).
В проспективное исследование были включены 98 детей и подростков с СД 1-го типа (50 лиц мужского и 48 женского пола) без признаков ДН в начале наблюдения. Возраст пациентов в начальной точке динамического наблюдения составлял от 11 до 17 лет, длительность заболевания от 1 до 8 лет.
Исследование уровня гомоцистеина в плазме крови проведено у 29 подростков с СД 1-го типа длительностью от 2 до 9 лет в возрасте от 11 до 16 лет. Контрольную группу составили 10 здоровых подростков в возрасте от 12 до 17 лет. Содер-
жание гомоцистеина в плазме крови определяли методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА) с использованием реактивов Axis-Shields (Норвегия). Эффективность коррекции гомоцистеинемии оценена у 8 пациентов в возрасте 13—16 лет с длительностью СД 1-го типа от 2 до 9 лет. Использован курс терапии лечебными дозами витаминов группы В (фолиевая кислота, В6, В12). Определение уровня HbA1c проведено методом латекс-агглютинации автоматизированным методом на приборе DCA 2000. Микроальбуминурию (МА) в суточной моче определяли методом конкурентного связывания ELISA. Скрининг МА у пациентов с СД 1-го типа проведен с использованием тест-полосок «micral-test-2» («Roche», Германия).
Статистическая обработка результатов проведена с использованием прикладной программы Statistica 5.0 в среде Windows. Данные представлены как М ± SD. Различия всех показателей обследованных пациентов статистически оценивались по тесту ANOVA и t-критерию Стъюдента. В малых выборках для статистической обработки результатов был использован метод невариационной статистики — критерий %2 по Пирсону. Различие p < 05 рассматривалось как статистически значимое.
Результаты и их обсуждение. На 1-м этапе проведено исследование ассоциации С677Т-по-лиморфизма гена МТГФР с развитием ДН при СД. Генотипирование проведено у 141 пациента с различными стадиями ДН с дебютом основного заболевания в детском возрасте. Изучена частота генотипов в группах пациентов с ДН (n = 51) и без ДН (n = 90) (табл. 1). Сравниваемые группы достоверно не различались по возрасту, полу (соотношение лиц мужского и женского пола 23/28 и 41/49 соответственно), длительности диабета (9,9 ± 3,28, 9 ± 3,7 года) и уровню HbA1c 10,2 ± 0,21, 9,8 ± 0,19% на момент обследования.
Таблица 1
Распределение генотипов С677Т-полиморфизма гена МТГФР у больных с диабетической нефропатией и без диабетического поражения почек
Группы пациентов
Распределение генотипов*
n, %
СС СТ ТТ
С диабетической нефропатией (n = 51) 19 21 11
(37,2) (41,2) (21,6)
Без диабетической нефропатии (n = 90) 56 29 5
(62,2) (32,2) (5,6)
*р < 0,004
Original data
При обследовании пациентов с СД1 была выявлена достоверно более высокая частота встречаемости ТТ-генотипа (р < 0,004) у больных с ДН. Распределение генотипов соответствовало равновесию Харди—Вайнберга. Полученные данные позволили предположить существование ассоциации гомозиготного носительства С677Т-по-лиморфизма гена МТГФР (ТТ генотип) с ДН [4]. Это послужило основой дальнейшего изучения роли данного генетического полиморфизма в развитии ДН, целесообразности использования его определения в клинической практике.
На 2-м этапе исследования проведено 7-летнее проспективное наблюдение детей и подростков с СД 1-го типа с различными аллельными вариантами С677Т-полиморфизма гена МТГФР. В начале изучения 98 детям и подросткам с СД 1-о типа без проявлений ДН было проведено ге-нотипирование, по результатам которого боль-
ные были разделены на 3 группы — гомозиготные носители нормального аллеля — СС генотип (п = 36), гетерозиготы СТ-генотип (п = 41) и гомозиготные носители полиморфного аллеля (п = 21). Больные с ТТ-генотипом представляли «группу наследственного риска» развития ДН.
Частота выявления новых случаев нефропатии в обследуемых группах увеличивалась с каждым годом наблюдения. Этот факт являлся ожидаемым, учитывая, что длительность хронической гипергликемии представляет основной фактор развития сосудистых осложнений при СД, в частности ДН [2]. Однако распространенность неф-ропатии оказалась различной в группах с различными аллельными вариантами С677Т-поли-морфизма гена МТГФР.
Результаты 7-летнего динамического наблюдения пациентов с СД 1-го типа представлены в табл. 2.
Таблица 2
Частота встречаемости диабетической нефропатии у больных с различными генотипами МТГФР
(результаты 7-летнего наблюдения)
Генотипы Пациенты Пациенты
с диабетической нефропатией, п, % без диабетической нефропатии, п, %
СС (п)+СТ (n) 8 (10,5) 69 (89,5)
ТТ (n) 7 (33,3) 14 (66,7)
Примечание: р < 0,01 (использован %2 по Пирсону); СС, СТ, ТТ — различные генотипы МТГФР; п — число пациентов в группе.
Обнаружена более высокая частота ДН у лиц из группы «наследственного риска» по сравнению с больными, имеющими СС- и СТ-генотип (р < 0,05). Полученные данные показали значение гомозиготного носительства С677Т-полимор-физма гена МТГФР (ТТ-генотип) в формировании предрасположенности к ДН при СД 1-го типа. Результаты исследования указывали на целесообразность определения данного генетического маркера в клинической практике у пациентов с СД 1-го типа как одного из критериев прогноза развития ДН.
Многочисленные данные исследований убедительно показывают, что наличие ТТ-генотипа сопряжено с повышением уровня гомоцистеина в плазме крови примерно в 2 раза по сравнению с СС-субъектами [5]. Данные литературы о влиянии гомоцистеинемии на развитие диабетических осложнений (в том числе ДН) в различных исследованиях весьма противоречивы [6, 7]. Возможным объяснением таких расхождений могут быть различия в методологических подходах,
клиническая гетерогенность обследованных, этнические различия наследственных факторов, особенности характера питания в различных популяциях.
На 3-м этапе были обследованы 39 детей и подростков в возрасте от 12 до 17 лет. Были сформированы 3 группы: 1-я группа — пациенты с ДН — 10 человек (4 мальчика и 6 девочек); 2-я группа — 19 пациентов без диабетического поражения почек (10 мальчиков и 9 девочек); 3-я группа — 10 практически здоровых детей.
В ходе проведенного исследования было выявлено, что значения гомоцистеина были выше у больных с ДН (6,25 ± 1,68 мкмоль/л) по сравнению с пациентами без ДН (5,65 ± 1,39) и группой контроля (5,40 ± 0,59) (р < 0,05). Уровень го-моцистеина в плазме крови у пациентов с СД без нефропатии статистически значимо не отличался от аналогичного показателя у здоровых детей (р > 0,05). Однако следует отметить, что во всех группах наблюдения были выявлены пациенты с показателями уровня гомоцистеина в плазме
Оригинальное научное исследование
крови, превышающими средневозрастную норму (5 мкмоль/л) [8]. Этот факт определяет необходимость динамического наблюдения за больными с повышенными показателями гомоцистеинемии, составляющими «группу риска» по развитию ДН, вне зависимости от возраста и длительности заболевания, пичем особое внимание уделяется метаболическому контролю, а также коррекции гомоцистеинемии.
На основании полученных данных на 4-м этапе была оценена эффективность снижения уровня го-моцистеина в плазме у 8 подростков СД 1-го типа с наиболее высокими значениями данного показателя. Известно, что превращение субстрата гена (в данном случае гомоцистеина) в процессе обмена осуществляется с помощью соответствующего фермента (МТГФР). Коррекция на уровне энзима осуществляется с помощью введения кофакторов [9]. Для этого были использованы фо-лиевая кислота (5 мг), витамин В6 (4 мг) и витамин В12 (0,006 мг) [10]. Курс лечения подростков с СД 1-го типа составил 2 месяца. Составляя 7,9 ± ± 1,1 мкмоль/л в начале терапии, после курса лечения нормализация уровня гомоцистеина достигала 5,1 ± 0,3 мкмоль/л в исследуемой группе (р < 0,01). Переносимость терапии была удовлетворительной. Однако для подтверждения эф-
фективности лечения требуется большая выборка пациентов с СД 1-го типа, в том числе осложненным ДН, наблюдение больных в динамике.
Выводы
1. Гомозиготное носительство С677Т-поли-морфизма гена МТГФР ассоциировано с развитием диабетической нефропатии у пациентов с дебютом сахарного диабета 1-го типа в детском возрасте.
2. Наблюдение в динамике детей и подростков с СД 1-го типа показало более высокую частоту развития диабетической нефропатии у лиц с ТТ-генотипом по сравнению с пациентами, имеющими СТ- и СС-генотипы МТГФР.
3. Выявлен достоверно более высокий уровень гомоцистеина в плазме крови у подростков с диабетической нефропатией по сравнению с пациентами без нефропатии и контрольной группой.
4. Применение курса лечебных доз витаминов группы В приводит к нормализации повышенного уровня гомоцистеина в плазме крови у подростков с сахарным диабетом 1-го типа.
5. При выявлении предрасположенности к диабетической нефропатии в детском возрасте обосновано проведение типирования С677Т-поли-морфизма гена МТГФР, определение уровня го-моцистеина в плазме крови.
Литература
1. Doria A., Warram J. H., Krolewski A. S. Genetic susceptibility to nephropathy in IDDM: from epidemiology to molecular genetics // Diabetes. — 1995. — Vol. 11. — P. 287-314.
2. Дедов И. И., Шестакова М. В. Диабетическая нефропатия. — М., 2000. — C. 57-59.
3. Сарерa А., Саrrea А., Саridi G. Homocystein, folate, vitamin В12 levels and C677T MTHFR mutation in children with renal failure // Ped. nephr. — 2003. — Vol. 18. — P. 114-118.
4. Schwartz E. I., Shcherbak N. S., Shutskaya Z. V. et al. Methylentetrahydrofolate reductase gene polymorphism as a risk factor for diabetic nephropathy in IDDM patients // Molecular genetic and metabolism. — 1999. — Vol. 68. — P. 375-378.
5. Fodinger M., Wagner O. F., Horl W. H. et al. Recent insights into the molecular genetics of the homocysteine metabolism // Kidney Int. — 2001. — Vol. 59. — P. 238-242.
6. Wotherspoon F, Laight D. V. Homocysteine, endothelial dysfunction and oxidative stress in type diabetes mellitus // Diabetes Vas Dis. — 2003. — Vol. 3. — P. 334-340.
7. Becker A., Smulders Y. M., van Guldener C. et al. Epidemiology of homocysteine as a risk factor in diabetes // Metab. Syndr. Relat. Disord. — 2003. — Vol. 7. — P. 105-120.
8. Warren C. Emergem cardiovascular risk factor: homocystein // Prog. Cardiovasc. Nurs. — 2002. — Vol. 17. — P. 35-41.
9. Бочков H. П. Клиническая генетика. — М., 1997. — 118 с.
10. Костюченко C. И., Баркаган З. С. Диагностика и методы коррекции гипергомоцистеинемии в кардиологической практике: Пособие для врачей. — М., 2003.
Автор:
Шуцкая Жанна Владимировна — к. м. н., врач-нефролог Городского диабетологического центра для детей и подростков СПб ГУЗ ДГП № 44
Адрес для контакта: [email protected]
