CC BY
23
Вопросы диагностики
Значение эндогенного пути инфицирования при посттравматических гонартритах у детей с применением масс-спектрометрии микробных маркеров
Е. С. Прохорова1, Д. Ю. Выворнов1, Н. Б. Бойко2, Н. Ф. Федосова2, К. В. Лядов2, Г. А. Осипов2
ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова МЗ СР РФ, КАФЕДРА ДЕТСКОЙ хирургии1, ФГУ «ЛЕЧЕБНО-РЕАБилиТАЦиОННЫЙ ЦЕНТР РОСЗДРАВА»2
В статье представлены результаты исследования по оценке внутрисуставного микробиологического статуса у 79 детей с посттравматическими гонартритами при помощи химического анализа методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии венозной крови и пунктата коленного сустава. Данные исследования позволили определить относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе — диспропорция в сравнении с их профилем в общем микроэкологическом статусе. Что свидетельствует о транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы, в связи с нарушением локального кровообращения и, как следствие снижением способности сустава к самоочищению. Что приводит к развитию субклинического воспалительного процесса в коленном суставе и манифестации посттравматического артрита на субклиническом уровне в первые часы и дни после любой травмы. Ключевые слова: коленный сустав, синовиальная жидкость, посттравматический артрит, эндогенный путь инфицирования, теория транслокации микрофлоры, микробные маркеры, метод газовой хроматографии — масс-спектрометрии в режиме масс-фрагментографии (ГХ-МС-МФ)
Significance of Endogenous Routes of Infection Transmissio in Post-Traumatic Gonarthritis In Children with Mass Spectrometry of Microbial Markers
E. S. Prokhorova1, D. Yu. Vybornov1, N. B. Boyko2, N. F. Fedosova2, K. V. Lyadov2, G. A. Osipov2
Russian National. Research MedicaL University named after N.I. Pirogov1, MedicaL TreaTMenT and RenabiUTaTion Centre2
The article presents the results of our research of intra-articular microbiological status in 79 children with posttraumatic gonartritises and their knee joint puncture samples and cubital vien blood samples analyzed by gas chromatography-mass spectromerty. Data received allowed us to identify relative changes in numbers of certain microorganisms of a joint - a disproportion compared to their normal profile of regular microecological status. This proves that a translocation of microorganisms into a knee joint is present as a result of trauma and local blood circulation infringement, which leads to a decrease in a joint self-purification function. Further, a subclinical inflammatory process in a knee joint takes place with the onset of posttraumatic arthritis at subclinical level in the first hours and days after any trauma. Key words: knee joint, synovia, posttraumatic arthritis, endogenic infection, bacterial translocation theory, microbial markers, gas chromatography, mass spectrometry, mass fragmentography (GC-MS-MF)
Контактная информация: Прохорова Елена Сергеевна — аспирант 3-го года каф. детской хирургии РНИМУ; Москва, ул. Садовая-Кудринская, 15-3, ДГКБ № 13; (499) 254-11-92; dgkb13@gmail.ru
УДК 616.72-07
Разнообразие видов травм коленного сустава, особенности клинических проявлений в детском возрасте, требуют тщательного дифференцированного подхода к диагностике и лечению закрытых повреждений коленного сустава, особенно, когда речь идет о внутрисуставных повреждениях, в противном случае, возникают осложнения, приводящие к нарушению функций коленного сустава [1—8].
Наличие пространственного фактора, образующего определенную отграниченную зону коленного сустава в период как повреждения, так и репарации, является одной из принципиальных характеристик внутрисуставного посттравматического воспалительного процесса. Этот фактор предрасполагает к переходу воспалительного процесса в хроническую форму; также как и наличие в полости сустава оторванного костно-хрящевого фрагмента, постоянно ущемляющейся жировой подвески и других патологически измененных структур способствуют формированию рецидивирующих и хронических посттравматических синовитов [9—16].
Бактериологическое исследование при синовитах обычно проводят с использованием посева пунктата из коленного сустава на питательные среды для выявления роста микроорганизмов с последующей идентификацией в чистой культуре (в аэробных, анаэробных условиях). Основным недостатком этого метода является невысокая частота вы-
деления культуры, т. е. его низкая чувствительность. Даже при использовании последних достижений биотехнологии (высокочувствительных анализаторов гемокультур и многокомпонентных питательных сред) рост культуры можно получить лишь при наличии в исследуемом материале жизнеспособных бактерий. Кроме того, длительные сроки исполнения отдаляют начало адекватной терапии.
Применяемый в последние годы способ ДНК-гибридизации обладает высокой чувствительностью, но является узко специфичным и может лишь подтвердить или исключить одну из предполагаемых версий об этиологии инфекции, но не позволяет идентифицировать микроорганизмы при неизвестном возбудителе инфекционного процесса [1 7, 1 8].
Для диагностики аналога синовиальной жидкости (СЖ) — асцитической жидкости, применен метод, основанный на определении содержания короткоцепочечных жирных кислот — метаболитов анаэробных микроорганизмов. Его достоинством является высокая точность диагностики инфицированнос-ти содержимого анаэробными микроорганизмами, а недостатком низкая специфичность, невозможность количественной оценки содержания отдельных видов микроорганизмов.
Перспективным выглядит метод газовой хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС), который позволяют получить информацию о наличии в биологическом
Таблица 1. Усредненное микробное сообщество сустава при го-нартрите, реконструированное по микробным маркерам в синовиальной жидкости (в качестве нормы приняты данные двух анализов, в которых концентрация всех маркеров микроорганизмов в отдельности и в сумме минимальна)
материале мономерных химических компонентов микробной клетки и ее метаболитов [19—21]. Выявление широкого спектра возбудителей инфекции осуществляется без предварительного посева исследуемого биологического материала [22, 23]. В частности в упоминавшейся асцити-ческой жидкости при спонтанном бактериальном перитоните, где была экспериментально подтверждена транслокация в брюшину большого числа микроорганизмов, в том числе специфичных для кишечной микробиоты [24, 25].
Целью настоящей работы является попытка выявления этим методом микробных агентов посттравматических артритов у детей посредством параллельного измерения концентрации их маркеров в синовиальной жидкости и крови.
Материалы и методы исследования
За 2008 г. через отделение травматологии и ортопедии ДГКБ № 13 и м. Н. Ф. Филатова прошло 79 больных
(100 %) с посттравматическими артритами коленных суставов и их последствиями, среди которых острая патология составила 45 детей (55,7 %), из них 5 случаев с неустановленной этиологией заболевания, хроническая — 39 детей (44,3%), из них 13 случаев с неустановленной этиологией заболевания. В структуре патологии преобладали мальчики — 42 ребенка (53%), с одинаковой частотой поражения обоих коленных суставов, в то время как у девочек — 37 детей (47%), патология правого коленного сустава встречалась в 2 раза чаще. Возрастная группа составила 5—16 лет, с наибольшей частотой встречаемости в 14 лет у обоих полов. По симптомам проявления посттравматического артрита у больных были выделены следующие группы детей: с гемартрозом — 31, с синовитом — 32, с симптомом артрита и преходящих блоков коленного сустава — 16.
Всем детям было проведено комплексное обследование, включавшее в себя общеклиническое, лабораторные и инструментальные (R-графия, МРТ, КТ) методы, завершавшееся артроскопией. На доартроскопическом этапе диагностики данные обследований порой имели значительные расхождения, а проведение артроскопии позволило выявить патологический субстрат только у 77,2% пациентов, в то время как у 22,8% пациентов макроскопической причины синовита выявлено не было. Посевы синовиальной жидкости на среды давали отрицательный результат, а гистологическое исследование биоптатов синовиальной оболочки выявило только общие признаки, характерные для воспалительного процесса (клеточная пролиферация, лимфогисти-оцитарная инфильтрация, гиперплазия ворсин синовиальной оболочки). Забор гистологического материала производился из разных областей сустава вне зависимости от локализации травмы, в то время как проявления воспалительного процесса были обнаружены во всех областях.
Детям с различными симптомами проявления посттравматического артрита (n = 20, случайная выборка) с целью обнаружения химических компонентов — маркеров потенциальных возбудителей, содержащихся в данном биологическом субстрате было произведено исследование пунктата коленного сустава и крови из локтевой вены при помощи химического анализа методом газовой хроматографии — масс-спектро-метрии в режиме масс-фрагментографии (ГХ-МС-МФ) системы AT-5973 (Agilent Technologies, США).
Маркерами являются высшие жирные кислоты, альдегиды и стеролы — продукты распада микробных клеток вследствие их фагоцитоза, собственного автолиза отживших клеток и естественного лизиса микробных клеток ферментами. Универсальность метода ГХ-МС в отношении вида биологической пробы, возможность количественной оценки содержания маркера (а, следовательно, и микроба) и экспрессность анализа являются отличительными признаками метода. Методика разработана в расчете на определение широкого круга микробных маркеров (более 200 веществ) а, следовательно, и возбудителей воспалительных процессов и инфекций. Идентификация микроорганизмов производится по наличию единичных маркеров, специфичных для данного таксона (рода, вида, группы), а также по их комбинации, количественному соотношению и материальному балансу отдельных химических веществ по специальной программе в таблицах EXCEL. Метод зарегистрирован Росздравнадзором за № 2010/038 от 24.02.2010.
Результаты измерений микробных маркеров в крови соответствуют гомеостатической колонизации кишечника и слизистых оболочек других органов, из которых микробные
№ Микроорганизмы Ср., пациенты Ср., норма
клеток/мл х 105
1. Streptococcus 195 /5
2. Eubacterium lentum (группа А) 112 34
3. Bacillus cereus 3 0
4. Peptostreptococcus anaerobius 7 0
5. Clostridium hystolyticum 23 9
6. Nocardia, I4:ldll 706 44
7. Moraxella 17
8. Pseudomonas aeruginosa 7 5
9. Streptomyces 70 14
10. Clostridium ramosum 1879 731
11. Fusobacterium/Haemophylus 10 2
12. Alcaligenes 29 8
13. Rhodococcus 161 57
14. Corineform CDC-group XX 85 21
15. Lactobacillus 1904 458
16. Mycobacterium/Candida 213 52
17. E.coli 0 0
18. Cl.difficile 88 24
19. Prevotella 37 9
20. E. moniliforme, E.nodatum, E.sal 1223 330
21. Bacteroides fragilis 0 0
22. Staphylococcus 83 16
23. Bifidobacterium 713 248
24. Helicobacter pylori, hl8 23 5
25. Clostridium perfringens 16 3
26. Enterococcus 94 22
27. Eubacterium 36 0
28. Propionibacterium spp (P.freude 1188 334
29. Streptococcus mutans 126 17
30. Микр грибы, кампестерол 75 44
31. Nocardia asteroides 241 54
32. Ruminicoccus 345 54
33. Actinomycetes I0Mel4 36 19
34. Actinomyces viscosus 367 77
35. Aspergillus 3 0
Сумма 10428 2915
маркеры физиологическим путем способны попадать в кровь. Они соответствуют динамическому равновесию между живыми и мертвыми микроорганизмами в момент отбора пробы. Микробиота организма человека гомеостатична [26], цикл деления микробной клетки в среднем 20 минут. То есть каждые 20 мин численность микробов удваивается. По закону гомеостаза столько же микробов должно отмирать и выдавать свои фрагменты в окружающую среду — в том числе в кровь. Концентрация микробных маркеров в крови в 60 раз меньше, чем на кишечной стенке, как показано при прямом сопоставлении [27].
При идентификации составляющих микст-инфекции и определении их концентрации используют математический алгоритм анализа суперпозиций части липидных профилей (по данным состава липидных компонентов чистых культур микроорганизмов) с учетом их доли в микробной клетке, наложения вкладов от разных микроорганизмов и фона биологической жидкости. Основой расчетов служат формулы баланса жирных кислот и банк химического состава микроорганизмов, колонизирующих организм человека или являющихся возбудителями инфекционных заболеваний. Банк данных создается однократно при построении алгоритма исследования, не требует повторных референтных тестов при последующих анализах, но допускает введение дополнительных параметров при обнаружении новых микроорганизмов. Выбор групп селективных ионов, детектируемых при ГХ-МС-ис-следовании и временную последовательность измерений осуществляют таким образом, чтобы учесть определенные маркеры и избежать измерения интенсивных фоновых веществ.
Результаты и их обсуждение
В синовиальной жидкости больных обнаружены разветвленные жирные кислоты, гидрокси-кислоты, специфические ненасыщенные и циклопропановые кислоты, жирные альдегиды, характерные для клеточных стенок и мембран микроорганизмов. На рис. 1 показан участок масс-фрагментог-раммы синовиальной жидкости по иону 87, специфичному для большей части жирных кислот. На этом участке визуально можно видеть, что в синовиальной жидкости (по сравнению с кровью) выше концентрация маркера общей микробной нагрузки — пальмитолеиновой кислоты, маркеров клостридий, родококков, дрожжей кандида. Пик репера — маргариновой кислоты — при этом одинаков.
Расчетные данные состава микробиоты биопленки сустава, реконструированные по концентрации микробных маркеров в синовиальной жидкости, приведены в усредненном виде в табл. 1, где показано в численном виде изменение микробной колонизации сустава по сравнению с СЖ пациентов без признаков инфекции. Эти изменения носят регулярный характер избыточного роста бактерий (инфекции) более чем в 60% случаев, поэтому мы ограничиваемся рассмотрением усредненных данных, не перегружая объем изложения конкретными измерениями 62 маркеров в СЖ и крови 21 ребенка и расчетными данными реконструкции микробиоты.
Общим признаком большей части пациентов является более чем двукратное (до двух порядков в отдельных случаях) превышение концентраций маркеров кишечных анаэробов: клостридий группы Clostridium ramosum, лактобацилл, эубак-терий (род Eubacterium) и пропионобактерий, а также актино-бактерий Nocardia и дрожжей кандида. Менее выражено участие в инфекционном процессе других анаэробов: Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans, C. perfringens, Peptostrep-tococcus anaerobius, Prevotella. Несколько меньше аэробов —
стафилококков, стрептококков, энтерококков, руминококков. В смешанной инфекции принимают участие также грамотри-цательные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Klebsiella) и другие — у них общие маркеры в ранге семейства), бактерии родов Moraxella/Acinetobacter, Fuso-bacterium/Haemophylus, Helicobacter. Однако их численность на два порядка ниже, чем у доминирующей группы. Другие грамотрицательные бактерии, такие как представители родов Stenotrophomonas, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, не превышали уровня клинической значимости или предела детектирования. Клинически значимый уровень превышают маркеры известных патогенов — Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus, Enterococcusи другие (табл. 1).
Параллельный с СЖ анализ крови детей из основной группы обследованных (n = 14) на микробные маркеры показал во всех случаях, кроме одного, дефицит колонизации организма (что относится в основном к кишечной мик-робиоте) при регулярном избыточном росте маркеров Eubacterium lentum и в большинстве случаев группы Moraxella/Acinetobacter и энтерококков. Прямой корреляции изменения концентрации маркеров в крови с маркерами в СЖ не обнаружено. Состав и расчетная численность микроорганизмов индивидуальны для каждого обследованного и по-разному соотносятся в СЖ и крови одного и того же ребенка. Поэтому статистический анализ по этим параметрам не уместен. В некоторых случаях суммарная концентрация маркеров микроорганизмов в СЖ меньше, чем в крови, что не дает основания говорить об их источнике в области сустава. Однако при сравнении численности отдельных микроорганизмов можно видеть, что некоторых из них больше в СЖ по абсолютной величине; численность же других неадекватно выше, чем в крови. В табл. 2 приведен пример сопоставления относительного количества микроорганизмов (в процентах от суммы), рассчитанных по концентрации микробных маркеров в СЖ и крови. Сопоставление относительного содержания микроорганизмов в суставе и кишечнике (реконструкция по синовиальной жидкости и крови соответственно) показывает, что в суставе относительно больше клостридий (Clostridium ramosum), нокардий и стрептококков, дрожжей кандида, актинобактерий Streptomyces и цитомегаловируса — они являются главными агентами воспаления сустава (численность 106—108 клеток/мл). Минорную группу (численность 105—106 клеток/мл) составляют бакте-
11,80 12,00 12,20 12,40 12,60 12,80 13,00 13,20 13,40 13,60 13,
Рисунок 1. В синовиальной жидкости (верхняя хроматограмма) по сравнению в кровью (нижняя хроматограмма) выше концентрация маркера общей микробной нагрузки — пальмитолеиновой кислоты (пик 12.18), маркеров клостридий (пик 12.10), родококков (13.20), дрожжей кандида (13.50). Пик репера — маргариновой кислоты (13.80) — при этом одинаков
Таблица 2. Микробные маркеры в синовиальной жидкости и крови в % (сопоставление относительного содержания микроорганизмов в суставе и кишечнике (реконструкция по синовиальной жидкости и крови соответственно) показывает, что в суставе относительно больше клостридий (Clostridium ramosum), нокардий и стрептококков, дрожжей кандида, актинобактерий Streptomyces и цитомега-ловируса — они являются главными агентами инфекции сустава (численность 106—108 клеток/мл). Минорную группу (численность 105—1 06 клеток/мл) составляют бактерии, которые обычно выявляют посевом на искусственные среды — Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus и другие)
рии, которые обычно выявляют посевом на искусственные среды — Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes, Staphylococcus и другие. Это означает, что в зоне синовиальной жидкости имеется источник маркеров этих бактерий, то есть сустав ими колонизован.
С другой стороны, в двух пробах концентрация маркеров микроорганизмов оказалась на порядок ниже, чем в крови при отсутствии ассиметрии маркеров. Эти данные были приняты в качестве нормы.
Как показывает предварительный анализ экспериментальных измерений — выявлять агент воспаления при синови-тах следует по абсолютному превышению расчетной численности микроорганизмов в суставе (по маркерам в СЖ) по сравнению с фоном микроэкологического статуса (по маркерам в крови), но и по соответствующим относительным изменениям. Относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе — диспропорция в сравнении с их профилем в общем микроэкологическом статусе достигает сотен раз для стрептококков, десятки раз для клостридий и нокардий. В несколько раз выше, в СЖ по сравнению с кровью относительная концентрация маркеров бактерий родов Moraxella/Acinetobacter, Fusobacterium/Haemophylus и Clostridium perfringens. Такие изменения характерны для большинства обследованных пациентов. У некоторых детей при гонартритах наблюдается увеличение концентрации до десяти и более раз маркеров Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cere us, Eubacterium lentum, Campylobacter mucosal is, хели-кобактера, превотелл, и дрожжей кандида (табл. 2).
Случаев относительного увеличения численности бактерий сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella и другие) и золотистого стафилококка не обнаружено. Кратность увеличения численности клостридий группы Clostridium ramosum составляет два-четыре раза. Это не много, по сравнению с другими потенциальными возбудителями инфекции сустава, но их абсолютная численность в среднем на порядок выше, чем стрептококков. Такой избыточный рост отдельных микроорганизмов чреват образованием вирулентных штаммов. По той же причине инфекционную угрозу могут представлять также эубактерии, лактобациллы, бифидо-бактерии и пропионобактерии, поскольку концентрация их маркеров в СЖ при повреждении в несколько раз превышает фоновую (табл. 1).
Обсуждая пути инфицирования сустава при закрытой травме, в качестве эндогенного источника следует рассматривать, прежде всего, кишечный биоценоз. Полученные в результате исследования данные свидетельствуют о транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы. Именно микроорганизмов, а не только их клеточных компонентов, по которым ведется исследование синовиальной жидкости методом масс-спектрометрии микробных маркеров при воспалении. Об этом свидетельствует либо превышение концентрации в ней липидных мономеров — жирных кислот, альдегидов, стеринов — маркеров, специфичных для клеточных стенок микроорганизмов, по сравнению с кровью, либо диспропорция в сторону увеличения отдельных маркеров. И то, и другое свидетельствует о наличии источника этих веществ в зоне воспаления, а значит и самих микробов. Инфицирование внутренних органов за счет транслокации бактерий из кишечника или ротовой полости известно давно и признается большинством клиницистов. Считается, что транслокация кишечной микробиоты является основным механизмом эндогенного инфицирования [28]. Это означает, что и в нашем случае при синовите следует ожидать появление в зоне воспаления любых обитателей кишечника — к настоящему времени известно 1800 фенотипов на уровне рода по данным анализа 16Б-рРНК [29,30]. А почему не всех сразу? Это
№ Микроорганизмы Сустав Кишечник
% от суммы
1. Streptococcus (группа А) 4,7 1,3
2. Eubacterium lentum 1,2 1,7
3. Nocardia 5,5 0,9
4. Peptostr. anaerobius 0,0 0,0
5. Acinetobacter 0,1 0,0
6. Pseudomonas aeruginosa 0,1 0,0
7. Pseudonocardia 0,1 0,0
8. Streptomyces 0,8 0,3
9. Clostridium ramosum 27,8 8,6
10. Fusobacterium/Haemophylus 0,1 0,0
11. Alcaligenes 0,3 0,1
12. Rhodococcus 1,0 0,9
13. Staphylococcus intermedius 0,2 0,0
14. Porphyromonas 0,0 0,0
15. Corinebacterium 0,8 0,5
16. Lactobacillus 11,1 7,6
17. Candida 1,9 0,7
18. Enterobacteraceae 0,0 0,0
19. Cl.difficile 0,8 0,6
20. Prevotella 0,3 0,1
21. Eubacterium 6,0 31,3
22. Staphylococcus 0,6 0,3
23. Bifidobacterium 6,5 23,4
24. Helicobacter pylori 0,2 0,1
25. Clostridium periringens 0,1 0,1
26. Enterococcus 0,8 0,5
27. Propionibacterium spp 15,3 11,5
28. Streptococcus mutans 0,5 0,5
29. Herpes 0,3 0,1
30. Микр грибы, кампестерол 2,3 1,4
31. Nocardia asteroides 3,1 1,0
32. Цитомегаловирус 1,0 0,1
33. Микр грибы, ситостерол 1,0 0,6
34. Butyrivibrio/Cl. fímetarum 0,0 0,5
35. Ruminicoccus 2,4 1,5
36. Enterococcus iaecalis 0,0 0,5
37. Actinomyces viscosus 2,9 1,9
38. Eubacterium/Butyrivibrio sp. 0,0 0,6
Сумма 100,0 100,0
вопрос чувствительности и информативности метода. Метод, примененный в настоящем исследовании, позволил сканировать одновременно 170 маркеров микроорганизмов разного таксономического уровня и их групп. Выявлено превышения уровня детектирования 47 из них, которые в разной комбинации и количественном выражении присутствуют у всех обследованных. Уровень смешанной инфекции и ее состав отражают специфику микробной этиологии синовита отдельных пациентов и дает дополнительную информацию для ан-тибиотикотерапии и других лечебных действий по восстановлению микроэкологического статуса больного.
Подтверждение такой массовой транслокации можно найти в литературе. Еще в 1902 г (Askoli, 1902 цитируется по [28]) обсуждается понятие транслокации всех представителей условно-патогенной микробиоты кишечника в лимфоузлы, печень, селезенку и другие органы. Сейчас становится известным, что не только грамотрицательные микроорганизмы или их эндотоксины, но и грамположительные бактерии и грибы могут преодолевать кишечный барьер
[31]. И это экспериментально подтверждено в одной из последних масштабных работ по анализу микробиоты суставов при сопоставлении данных культурального и генетического методов. Получено 475 изолятов бактерий (в том числе 1 76 из коленного сустава) культуральным методом, идентификация которых совпала с данными гомологии 16s рРНК. Показано, что колонизация носит полимикробный харатер
[32]. Считается, что стимулом транслокации является избыточный рост кишечной микробиоты или стресс [28]. В нашем случае стрессом является травма сустава. В современной литературе есть данные по инфекции синовиальной жидкости отдельными микроорганизмами сем. Enterobacteriaceae, гипотезы об участии анаэробов кишечника, связи артритов с их избыточным ростом [33, 34]. Бактериальные изоляты были получены из синовиальной жидкости при септическом артрите. Выделены ампликоны ДНК различных микроорганизмов, а также их пептидогликан-полисахаридные комп-лекы [35]. В том числе выделены культуры анаэробов [36]. Причем, как показано в работе I. Brook, анаэробы доминируют среди изолятов [37]. От 77 больных из суставов выделено 122 изолята анаэробов при 35 аэробах и факультативных анаэробах. Среди них бактероиды, анаэробные кокки, фузобактерии и клостридии в порядке частоты обнаружения. В настоящей работе в синовиальной жидкости обнаружены маркеры почти всех кишечных микробов, определяемых по маркерам в крови. Почему они приходят в сустав при воспалении? Причем приблизительно в том списочном составе, в котором они работают в кишечной биопленке. Может, для того, чтобы в очаге воспаления создать сбалансированную лечебную биопленку и тем самым препятствовать одностороннему развитию бактерий в состоянии экспрессии факторов патогенности? Действительно, эксперименты с безмикробными и конвенциальными крысами позволяют сделать такое предположение [29, 38]. Отмечается также, что микробная популяция полости рта выполняет двоякое значение: с одной стороны — роль биологического барьера, с другой потенциального резервуара аутоинфекции [39, 40]. Тогда роль агентов воспаления можно приписать тем микроорганизмам, которые проявляют диспропорциональный кишечнику рост в его очаге — суставе.
Заключение
Анализ полученных данных при исследовании синовиальной жидкости и венозной крови детей с различными симптомами проявления посттравматического артрита коленного сустава при помощи метода газовой хроматографии — масс-спектрометрии в режиме масс-фрагментографии, показал наличие транслокации микроорганизмов в коленный сустав в результате его травмы. При этом все кишечные микробы приходят в сустав при воспалении приблизительно в той пропорции, в которой они пребывают в кишечной биопленке, которая является основным источником эндогенной микрофлоры и теоретически любой ее микроорганизм может участвовать в реакции воспаления. Предполагается, что это происходит с целью создания в месте воспаления сбалансированной лечебной биопленки, тем самым препятствуя одностороннему развитию бактерий в состоянии экспрессии факторов патогенности. С другой стороны, относительные изменения численности отдельных микроорганизмов в суставе — диспропорция в сравнении с их профилем в общем микроэкологическом статусе (кишечнике, маркеры в крови) достигает десятков и сотен раз, что позволяет предполагать их в качестве потенциальных агентов воспаления.
Нарушение локальной микроциркуляции в коленном суставе со снижением его способности к самоочищению, выявленное нами наличие маркеров возбудителей инфекционных процессов в 1-е дни после травмы коленного сустава, позволяют говорить о развитии субклинического бактериального процесса в нем. Наличие травмы, результат гистологических исследований с выявлением признаков синовиальной реакции и выявленное в ходе представленного исследования увеличение концентрации бактериальных маркеров в пунктате коленного сустава, позволяет нам утверждать, что инфицирование коленного сустава (попадание в него микроорганизмов) происходит в первые часы и дни после травмы, т. е. можно говорить о потенциальном воспалении — артрите, что требует комплексного подхода к диагностике и лечению данной патологии у детей.
Литература:
1. Богатов В.Б. Артроскопическая диагностика и лечение внутрисуставных повреждений коленного сустава у детей: Автореф. дис. ... к.м.н. — Самара, 2002. — 22 с.
2. Дорохин А.И. Комплексное лечение переломов костей у детей, осложненных нарушением консолидации: Автореф. дисс. ... д.м.н. — М., 2005.
3. Артроскопическая диагностика и лечение повреждений хряща коленного сустава у детей / В.Н. Меркулов, Е.А. Карам, О.Г. Соколов, А.Г. Ельцин // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Пирогова. — 2003. — № 2. — С. 74—79.
4. Тимофеев И.В. Роль артроскопии в диагностике острого травматического вывиха надколенника у детей / И.В. Тимофеев, С.В. Рассовский // Детская хирургия. — № 3. — 2006. — С. 12—14.
5. Тимофеев И.В. Клиника, диагностика и эндоскопические методы лечения острого вывиха надколенника у детей: Автореф. дис. ... к.м.н. — М., 2004. — 18 с.
6. Ушакова С.А. Роль артроскопии в диагностике и лечении повреждений и заболеваний суставов // Ортопедия, травматология и протезирование. — 1978. — № 10. — С. 74—78.
7. Dandy DJ. Artroscopy in the treatment of young patients with anterior knee pain // Ortop. Clin. No rth America. — 1986. — № 17. — Р. 221—229.
8. Kao S.C. Skeletal injuries in the pediatric patient // S.C. Kao, W.L. Smith / Radiol. Clin. North Am. — 1997. — № 35. — Р. 727—746.
9. Крестьяшин В.М. Повреждения и заболевания коленного сустава у детей (Клиника, диагностика, лечение): Автореф. дисс. ... д.м.н. — М., 1999.
10. Анселл Б.М. Ревматические болезни у детей, пер. с англ. — М., 1983. — 80 с.
11. Клиническая ревматология, под ред. X. Каррея, пер. с англ. — М., 1990.
12. Клиническая рентгенорадиология, под ред. Г.А. Зедгенидзе. — Т. 3. — М., 1983.
13. Насонова В.А., Астапенко М.Г. Клиническая ревматология. — М., 1989.
14. Рейнберг С.А. Рентгенодиагностика заболеваний костей и суставов. — Т. 2. — М., 1964. — С. 535.
15. Руководство по детской артрологии, под ред. М.Я. Студеникина и А.А. Яковлевой. — Л., 1987.
16. Выборнов Д.Ю. Нерентгеноконтрастные внутрисуставные переломы у детей // Актуальные вопросы детской хирургии, ортопедии, травматологии, анастезиологии и реанимации. — 1994. — С. 167—168.
17. Clinical and microbiological characteristics of spontaneous bacterial peritonitis (SPB) in a resent five year period / H.G. Song et al. // Taehan Kan Hakhoe Chi. — 2002. — V. 8. — Р. 61—67.
18. Amplification of bacterial DNA does not disringuish patients with ascitic fluid infection from those colonized by bacteria / S.M. Viera et al. // J Pediatr Gastroenterol Nutr. — 2007. — 44 (5) . — Р. 603—607.
19. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином // Вестник РАМН. — 1999. — 16 (7) . — Р. 25—31.
20. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. — М.:Медицина, 1978.
21. Осипов Г.А. Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии — масс-спектрометрии / Г.А. Осипов, Н.Ф. Федосова, К.В. Лядов // Здравоохранение и медицинские технологии. — № 5. — 2007. — С. 20—23.
22. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангреноз-но-перфоративном аппендиците / Н.Б. Бойко, Г.А. Осипов, Н.В. Белобородова, В.А. Курчавов // Инфекции в хирургии. — 2009. — Т. 7. — № 2. — С. 58.
23. Хабиб О.Н. Детектирование молекулярных маркеров бактерий в ткани клапанов сердца в норме и при патологии с применением метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии / О.Н. Хабиб, Н.В. Белобородова, Г.А. Осипов // Ж. Микроб. Эпидем. Иммун. — 2004. — Т. 7. — № 3. — С. 62—68.
24. Винницкая Е.В. Спонтанный бактериальный перитонит у больных циррозом печени: Автореф. дисс. ... д.м.н. — М., 2009.
25. Диагностика спонтанного бактериального перитонита при циррозе печени / Е.В. Винницкая и др. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — № 3. — 2008. — С. 18—24.
26. Beloborodova N.V., Osipov G.A. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship // Microb. Ecol. Heal. Dis., SCUP. - 2000. - 12. - Р. 12-21.
27. Осипов Г.А. Определение состава и количества микроорганизмов кишечной стенки методом хромато-масс-спектрометрии по клеточным жирным кислотам / В кн. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. — М.: КМК Scientific Press., 2003. - С. 89-98.
28. Бокерия Л.А. Белобородова Н.В. Инфекция в кардиохирургии. -М.: НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, 2007. - 582 с.
29. Hattori M., Taylor T.D. The Human Intestinal Microbiome: A New Frontier of Human Biology // DNA RESEARCH. - 2009. - 16. -Р. 1-12.
30. High-Throughput Quantitative Analysis of the Human Intestinal Micro-biota with a Phylogenetic Microarray / О. Paliy, Н. Kenche, F. Aber-nathy, S. Michail // Appl. Environ. Microbiol. - June, 2009. -75 (11) . - Р. 3572-3579.
31. MacFie J. Current status of bacterial translocation as a cause of surgical sepsis // British Medical Bulletin. - 2004. - 71. - Р. 1-11.
32. Analysis of 525 samples to determine the usefulness of PCR amplification and sequencing of the 16S rRNA gene for diagnosis of bone and joint infections / F. Fenollar et al. // J. Clin. Microbiol. - 2006. - V. 44, № 3. - Р. 1018-1028.
33. Are intestinal bacteria involved in the etiology of rheumatoid arthritis? / М.Р. Hazenberg et al. // Review article. APMIS. - January 1, 1992. - 100 (1) . - Р. 1-9.
34. Fecal Microbiota in Early Rheumatoid Arthritis / J. Vaahtovuo et al. // J. Rheumatol. - Aug, 2008. - 35. - Р. 1500 - 1505.
35. Presence of bacterial DNA and bacterial peptidoglycans in joints of patients with rheumatoid arthritis and other arthritides / I.M. van der Heijden et al. // Arthritis Rheum. - March 1, 2000. - 43 (3). -Р. 593-598.
36. Clarke HJ. Anaerobic septic arthritis due to bacteroides: brief report / H.J. Clarke, R. Allum // J Bone Joint Surg Br. - Nov, 1988. -70-B. - Р. 847-848.
37. Brook I. Anaerobic osteomyelitis and arthritis in a military hospital: a 10-year experience / I. Brook, E.H. Frazier // Am J Med. -January 1, 1993. - 94 (1). - Р. 21-28.
38. Gut flora induces and maintains resistance against streptococcal cell wall-induced arthritis in F344 rats / M.F. van den Broek et al. // Clin Exp Immunol. - May 1, 1992. - 88 (2). - Р. 313-317.
39. Распространение возбудителей соматических заболеваний в нормальной микрофлоре ротовой полости / В.В. Тец и др. // Пародонтология. - 2007. - № 4. - С. 9-12.
40. Хуснутдинова Л.М. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в норме при патологии // Ж. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 1. - С. 60-63.
Актуальность диагностики инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6-го типа
М. Ю. Калугина, Н. В. Каражас, Т. Н. Рыбалкина, Р Е. Бошьян, Т. М. Ермакова, А. В. Тебеньков
ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздрдвсоирдзвития России, Тушинская детская городская больница, Москва
Под наблюдением находилось 88 детей от 8 месяцев до 14 лет с диагнозом «внезапная экзантема» в остром периоде лихорадочного заболевания, как с признаками сыпи, так и без нее. Установлено, что наиболее часто — у 47,5% детей были выявлены признаки острой ЦМВИ и в 45,0% — острой ВЭБИ. Признаки острой ВПГИ и острой ВГЧ-6-инфекции определялись приблизительно у одинакового количества больных детей (28,75 и 31,25%). Вирус герпеса человека 6 типа исследуется сравнительно недавно, и эпидемиология этой инфекции изучена недостаточно. Разработка высокоспецифичной диагностики чрезвычайно актуальна ввиду широкой распространенности и недостаточной изученности данной инфекции. Ключевые слова: вирус герпеса человека 6 типа, диагностика
