CC BY
20
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИЙ
УДК: 616.314.17-008.1-022.7-036.66-06:612.017.1]-092.9 А. €. Демкович, Ю. I. Бондарен ко, М. М. Якимчук
ЗМ1НИ КЛ1ТИННОГО 1МУННОГО ЗАХИСТУ ОРГАН1ЗМУ В ПРОЦЕС1 ХРОН1ЗАЩ1 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БАКТЕР1АЛЬНО-1МУННОГО ПАРОДОНТИТУ
ДВНЗ «Терноптьський державний медичний уыверситет iменi I. Я. Горбачевського МОЗ Украни»
Актуальнiсть дослiдження
Запальн1 захворювання тканин пародонта в наш час набули широкого розповсюдження в усьому свт, а Укра'на належить до краТн 1з високою частотою за-хворювань на хрон1чний генерал1зований пародонтит. За даними р1зних автор1в, вщбуваеться подальше зростання р1вня пародонтолог1чних захворювань у наш1й краТн1 за останн роки, що мае I загальномедич-не, I соц1альне значення [1].
Ниш розвиток I прогресування запальних захворювань пародонта розглядають не сттьки як локальне запалення навколозубних тканин, а як реакцю всього оргаызму на бактер1альну 1нваз1ю тканин пародонта. Вщомо, що розвиток пародонтиту стае наслщком дисбалансу м1ж м1крофлорою порожнини рота й 1мунним захистом орган1зму [2]. Сл1д при цьому також урахо-вувати активнють кл1тин-ефектор1в запалення I доста-тнють механ1зм1в резистентност1. Для розвитку запалення одного бактер1ального чинника недостатньо, мае бути сукупнють ц1лого ряду патогенетичних фак-тор1в. При цьому мае значення закр1плення Тх не тть-ки в тканинах пародонта, а I в орган1зм1 як цтому, в1д чого залежить ефективнють стандартно' терапи. За-пальн1 захворювання пародонта зазвичай мають хро-шчний переб1г 1з пер1одичними загостреннями, а тому вимагають своечасного I неодноразового проходжен-ня курс1в л1кування [3].
Дослщження мембранних рецептор1в л1мфоцит1в на р1зних етапах Тхнього розвитку, диференц1юван-ня, активаци, кл1тинноТ прол1ферац1Т, апоптозу е су-часним 1нформативним, об'ективним I доступним методом, що використовуеться з науковою, д1агнос-тичною, лкувальною I прогностичною метою. Тому вивчення ц1еТ проблеми мае ^рунтуватися на комплексному дослщженш базових механ1зм1в, що при-зводять до переходу запалення в хрошчну форму з подальшим визначенням патогенетично об^рунто-ваного комплексу терапевтичних заход1в, здатних ефективно впливати на процеси санаци та повноТ регенерац1Т пародонта. На цьому етат досл1дження вважали за доцтьне проанал1зувати особливост1 зм1н кштинноТ ланки адаптивного 1мун1тету при екс-периментальному бактер1альночмунному пародонтит!, що сприятиме поглибленню розумшня сут1
цього запального процесу I вщкрие шляхи патоге-нетичного об^рунтування Тх корекц1Т.
З'ясування характеру порушень 1мунолог1чних процес1в дозволить установити роль одн1еТ з важли-вих ланок, що призводить до ушкодження структур пародонтального комплексу I формування запального процесу р1зних ступешв I характеру переб1гу [4]. Кль тинний 1мун1тет становить собою тип 1мунноТ в1дпов1д1 орган1зму, за якого в1дсутня участь системи комплементу й антитт. До кгмтинних неспециф1чних фактор1в захисту належать два типи кл1тин: фагоцити I природ-н1 к1лери. Кл1тинн1 специф1чн1 фактори захисту вклю-чають Т-л1мфоцити I В-л1мфоцити [5].
Метою нашого досл1дження було з'ясування пато-генетичноТ рол1 кл1тинного адаптивного 1мун1тету в процес1 формування хрон1чноТ запальноТ реакц1Т в п1з-н1й перюд переб1гу експериментального бактер1ально-1мунного пародонтиту
Матерiали i методи дослiдження
Дослщження було проведено на б1лих безпород-них кл1н1чно здорових самцях-щурах масою 150-200 г в умовах в1вар1ю. Тварини перебували на стандартному рацюы, збалансованому за основними елемен-тами харчування, з втьним доступом до води. Експе-рименти проводили з дотриманням загальних правил I положень СвропейськоТ Конвенцп 1з захисту хребет-них тварин, як1 використовуються для дослщницьких та 1нших наукових цтей (Страсбург, 1986), загальних етичних принцитв експеримент1в на тваринах (КиТв, 2001). П1ддосл1дн1 тварини були розподтеш на дв1 групи: перша група - штактш тварини (п=10); друга група - тварини з експериментальним пародонтитом на 30 добу дослщження (п=8). Експериментальний бактер1альночмунний пародонтит у дослщних тварин викликали шляхом уведення в тканини пародонталь-ного комплексу сум1ш1 м1кроорган1зм1в, розбавленоТ яечним протеТном [6]. З метою посилення 1мунноТ в1д-пов1д1 одночасно вводили в лапку щура повний ад'ювант Фрейнда. Для подальших дослщжень в1дби-рали кров пщдослщних тварин. Показники кл1тинного 1мун1тету визначали методом, який ^рунтуеться на взаемод1Т моноклональних антит1л (МКАт), м1чених флюоресцентою м1ткою, з поверхневими антигенами л1мфоцит1в [7]. Показниками кл1тинного 1мунного захи-
сту слугували вщносна к1льк1сть л1мфоцит1в i3 маркерами CD3+ (загальн Т-лiмфоцити), CD4+ (Т-хелпери), CD8+ (цитотоксичн клiтини, Т-кiлери), CD19+ (B-лiмфоцити), CD16+ (натуральнi галери, NK-клiтини) та iмунорегуляторний iндекс (CD4+/CD8+). Отриман цифровi данi статистично опрацьовували i3 застосу-ванням параметричних i непараметричних методiв статистики за допомогою програмного забезпечення «Excel» («Microsoft», США) та «STATISTICA 10.0» («Statsoft», США) [8]. Достг^рнють рiзницi значень мiж незалежними кiлькiсними величинами визначали при нормальному розподл за критерieм U-критерieм Манна-Уiтнi [9].
Результати дослiдження та Тх обговорення
Вiдомо, що однieю iз ключових патогенетичних ланок розвитку запального процесу в пародонтальному комплексу вiд якоТ залежать тяжкють i характер пе-ребiгу, формування i завершенiсть регенерацiйних процесiв у пародонД е стан клiтинноТ неспецифiчноТ та специфiчноТ резистентностi [10]. Ктьгасы та якiснi змiни характеристик лiмфоцитiв i моноцитiв вщбува-ються в певних межах, що дозволяе пщтримувати «кглтинний гомеостаз», але разом iз тим гостро реагу-вати на будь-як несприятливi впливи середовища. Тому визначення галькост та якостi популяцш i субпо-пуляцiй лiмфоцитiв i моноцитiв дае важливу шформа-цю, яка може вiдображати активнiсть i тяжкiсть пере-бiгу захворювання [11 ].
Спектр субпопуляцш лiмфоцитiв у дослiджуванiй групi тварин iз експериментальним бактерiально-iмунним пародонтитом на 30 добу дослщження по-
рiвняно з iнтактними тваринами вiдображено в таб-лицi.
Таблиця
Показники клтинного адаптивного iмун1тету кровi блих щур1в з експериментальним бактерiально-iмунним пародонтитом у перiод хронiзацi'í запального процесу (М±т)
Показники 1нтакты тварини. Контроль Тварини з експериментальним пародонтитом на 30 добу дослщження
К-ють тварин 10 8
CD3+(%) 45,94±0,73 34,39±0,90 (p<0,01)
CD4+(%) 33,32±0,56 22,61 ±0,41 (p<0,01)
CD8+(%) 15,70±0,74 23,30±0,48 (p<0,01)
CD19+ (%) 11,65±0,39 9,41 ±0,19 (p<0,01)
CD16+ (%) 9,63±0,40 12,31 ±0,36 (p<0,01)
CD4+/CD8+ 2,17±0,11 0,97±0,02 (p<0,01)
Примiтка: p - достовiрнiсть вiдмiнностей в'дносно iнтактних тварин.
Загальна оцшка iмунного статусу щурiв з експериментальним бактерiально-iмунним запаленням у тканинах пародонтального комплексу показала, що сту-пшь i спрямованiсть змiн усiх його ланок були рiзнi. Так, при детальному аналiзi отриманих результатiв дослщження к^тинноТ ланки адаптивного iмунiтету виявили, що вмют загальних Т-лiмфоцитiв (CD3+) у кровi тварин iз експериментальним бактерiально-iмунним пародонтитом на 30 добу дослщження знизи-вся в 1,34 раза порiвняно з групою iнтактних тварин (p<0,01). Поряд з тим у процес розвитку експеримен-тального бактерiально-iмунного пародонтиту вщбуло-ся зниження в кровi тварин на 30 добу дослщження вмюту Т-хелперiв (CD4+) в 1,47 раза (p<0,01) (рис.1).
160 140 120 100 80 60 40 20 0
CD3+
CD4+
CD8+
Рис. 1. Змни в'дносноТ клькост'1 CD3+, CD4+, бактерiально-iмунному пародонтитi на
Примiтки: * - достовiрнiсть вiдмiнностей вiдносно iнтактних
Умют Т-ефекторiв (CD8+), яга виконують функцп й супресорiв, i кiлерiв, при експериментальному запалены тканин пародонта, навпаки, пщвищився в порiв-няннi з показниками штактних тварин у 1,48 раза (p<0,01). Саме цi дослiджуванi штини пригнiчують ак-тивнiсть клiтинного i гуморального адаптивного iмунi-тету, впливаючи на механiзми мiжклiтинноТ взаемодiТ. Наявнють Тх у кровi в гострш фазi запального процесу свiдчить про активацю iмунологiчноТ реактивностi у вщповщь на антигенну стимуляцiю продуктами тка-нинного розпаду. 1мунорегуляторний iндекс ^D4+ / СD8+) при цьому зменшився в порiвняннi з цим пока-зником групи iнтактних тварин у 2,24 раза (p<0,01). Отриманi дан свiдчать про появу iмуносупресивного стану в щурiв за умови бактерiально-iмунного паро-
CD8+ у кровi щурв при експериментальному 30 добу дослiдження (у % вiд контролю).
тварин (p<0,01) донтиту, що розвинувся в тзнш перюд переб^у запа-льноТ реакцiТ за рахунок i Т-хелперiв, i цитотоксичних Т-супресорiв / кiлерiв (рис. 2).
Щодо характеру змш умiсту натуральних кiлерiв ^К-к^тин, CD16+) у сироватцi кровi експерименталь-них тварин iз пародонтитом на тзнш стадп перебiгу запалення, то слщ зазначити, що на 30 добу дослщу Тхнiй умiст перевищував (у 1,28 раза; р<0,01) показники у тварин штактноТ групи. При визначенн загальних В-лiмфоцитiв кровi (CD19+) також виявилися вiрогiднi вiдмiнностi в експериментальноТ групи тварин. Так, у тварин iз пародонтитом на 30 добу цей показник був нижчим у 1,24 раза (p<0,01) вщносно штактних щурiв (рис. 2).
*
А *
□ Контроль □ Пародонтит 30 доба
1 1 V 11 *
/ 1 0 / I
1 1 Ш А
J
CD16+
CD19+
CD4+/CD8+
Рис. 2. Змни в'дносноТклькост1 CD16+, CD19+ та ¡мунорегуляторного Ндексу (CD4+/CD8+) у кровi щур1в при експериментальному бактер/альночмунному пародонтит1 на 30 добу досл/дження (у % eid контролю).
Прим/тки: * - достов/рнсть в/дмнностей в/дносно iнтактних тварин (p<0,01)
Висновки
1. nepe6ir експериментального пародонтиту в тз-нш перюд супроводжуеться функцюнальним пору-шенням Т- i В-кгмтинноТ ланок iмунноí системи щурiв, свiдченням чого е зниження вщсоткового вмiсту Т-лiмфоцитiв за рахунок Т-активних клiтин, T-xernepiB, В-лiмфоцитiв та збiльшення Т-кiлерiв i NK-клiтин. Цi змiни можуть розглядатися як ознаки формування хрошчного переб^ запального процесу в тканинах пародонтального комплексу.
2. Змши кiлькiсного складу Т-штин i стввщношен-ня Т'хшх популяцiй при експериментальному бактерiа-льночмунному пародонтитi дають пiдставу розглядати Тх як важливу патогенетичну ланку ^е'Т хвороби, що мае безпосередне вщношення до механiзмiв iмунного захисту i толерантностi, а також може бути розцшено як новий пiдхiд до дiагностики i терапiТ генералiзова-ного пародонтиту.
Перспективи подальших дослiджень. Плану-еться продовжити дослщження клiтинного iмунного захисту за умови експериментального бактерiально-iмунного пародонтиту за умови корекци його флаво-нолом.
Лiтература
1. Димитрова А. Г. Оценка эффективности различных иммуномодуляторов в комплексном лечении генерализованного пародонтита у лиц молодого возраста (18-25 лет) / А.Г. Димитрова, Ю.Г. Коленко // Современная стоматология. - 2013. - № 2. - С. 38-39. Periodontal disease as a risk factor for bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw / V. Thumbigere-Math, B. S. Michalowicz, J. S. Hodges [et al.] // J. Periodontol. -2014. - Vol. 85, № 2. - P. 226-233.
3.
9.
10.
11.
2.
Алгоритм виникнення й розвитку генералiзованого пародонтиту та пародонтозу схема комплексного лку-вання генералiзованого пародонтиту / Г. М. Мельничук, А. М. Ползун, Л. е. Ковальчук [та Ы.] // Современная стоматология. - 2013. - № 1. - С. 35-40. Long-term clinical and hematologic effects of non-surgical treatment on aggressive periodontitis / X. E. Wang, L. Xu, H. X. Meng [et al.] // Zhonghua Kou Qiang. - 2013. -Vol. 48, № 8. - P. 467-471.
Induction of immune response and prevention of alveolar bone loss with recombinant Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase / C. Zhu, J. Yang, J. Sun [et al.] // Arch. Oral Biol. - 2013. - Vol. 58, №12. - P. 1777-1783. Демкович А. е. Патогенетичн основи моделювання пародонтиту у тварин / А. е. Демкович, Ю. I. Бондарен-ко // Здобутки шычно!' i експериментально!' медицини. - 2015. - № 1 (22). - С. 54-57.
Bunders M. Аge-related standards for total lymphocyte, CD4+ and CD8+ T cell counts in children born in Europe / M. Bunders, M. Cortina-Borja, M. L. Newell // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2005. - Vol. 24, № 7. - Р. 595-600. Орлов А. И. Математика случая: Вероятность и статистика - основные факты: учебное пособие / А. И. Орлов. - М.: МЗ-Пресс, 2004. - 100 с. Berger R. L., Casella G. Statistical Inference 2nd ed. - Florida: Duxbury Press. - 2001. - 374 p. Demkovych A. Oxidative modification of proteins in the process of experimental periodontitis development / A. Demkovych, Yu. Bondarenko, P. A. Hasiuk // Interventional Medicine and Applied Science. - 2017. - № 9 (4). - P. 218-221.
Proteomics for the discovery of biomarkers and diagnosis of periodontitis: a critical review / Y. A. Guzman, D. Sakellari, M. Arsenakis [et al.] // Expert Rev. Proteomics. -2014. - Vol. 11, № 1. - P. 31-41.
Стаття надшшла 26.02.2018 р.
Резюме
Одыею з важливих ланок, що призводить до ушкодження структур пародонтального комплексу i формування запального процесу рiзних ступешв, е порушення iмунологiчних процеав. Мета дослщження полягала у з'ясуванн патогенетичноТ ролi штинного адаптивного iмунiтету в процес формування хрошчноТ запальноТ реакцп в тзнш перюд переб^ експериментального бактерiально-iмунного пародонтиту. Дослщження було проведено на бтих безпородних шычно здорових самцях-щурах. Експериментальний бактерiально-iмунний пародонтит у дослщних тварин викликали шляхом уведення в тканини пародонтального комплексу сумш мiкроорганiзмiв, розбавленоТ яечним протешом. Отриман цифровi дан статистично опрацьовували iз застосуванням параметричних i непара-метричних методiв статистики. У статт наведено результати дослщжень показниюв к^тинного iмунного захисту, що визначали за вщносною ктькютю лiмфоцитiв iз маркерами CD3+ (загальн Т^мфоцити), CD4+ (Т-хелпери), CD8+ (цитотоксичн штини, Т-ктери), CD19+ ^^мфоцити), CD16+ (натуральн ктери, NK-клiтини) та iмунорегу-ляторним Ыдексом (CD4+/CD8+) в штактних тварин i на 30 добу розвитку експериментального бактерiально-iмунного пародонтиту. Установлено, що характер переб^ експериментального запалення в тканинах пародонтального комплексу залежав вщ змЫ штинного iмунного статусу, що супроводжувався зниженням умюту загальних
0
4
5
6
7
8
зртих Т-лiмфоцитiв (СD3+) у кровi тварин iз експериментальним бактерiально-iмунним пародонтитом на 30 добу дослщження; разом з тим у процес розвитку експериментального бактерiально-iмунного пародонтиту вщбулося зниження в кровi тварин на 30 добу вмiсту Т- лiмфоцитiв-хелперiв (СD4+), пiдвищення Т-супресорiв (CD8+), пщ-вищення вмiсту натуральних кiлерiв (CD16+) i зниження вiдносного вмюту В-лiмфоцитiв (СD19+). 1мунорегулятор-ний Ыдекс (СD4+ / СD8+) при цьому зменшився в порiвняннi з цим показником групи iнтактних тварин. У щурiв за умови бактерiально-iмунного пародонтиту розвинувся iмуносупресивний стан у шзнш перiод перебiгу запальноТ реакцií за рахунок i Т-хелперiв, i цитотоксичних Т-супрес^в / кiлерiв. Цi змши можна розглядати як ознаки фор-мування хронiчного перебiгу запального процесу в тканинах пародонтального комплексу.
Ключовi слова: бактерiально-iмунний пародонтит, iмунна система, Т^мфоцити, В-лiмфоцити, запалення.
Резюме
Одним из важных звеньев, приводящих к повреждению структур пародонтального комплекса и формированию воспалительного процесса различной степени, является нарушение иммунологических процессов. Цель исследования заключалась в выяснении патогенетической роли клеточного адаптивного иммунитета в процессе формирования хронической воспалительной реакции в поздний период течения экспериментального бактериально-иммунного пародонтита. Исследование было проведено на белых беспородных клинически здоровых самцах-крысах. Экспериментальный бактериально-иммунный пародонтит у опытных животных вызвали путем введения в ткани пародонтального комплекса смеси микроорганизмов, разбавленной яичным протеином. Полученные цифровые данные статистически обрабатывали с применением параметрических и непараметрических методов статистики. В статье приведены результаты исследований показателей клеточной иммунной защиты, которые определяли по относительному количеству лимфоцитов с маркерами CD3+ (общие Т-лимфоциты), CD4+ (Т-хелперы), CD8+ (цитотоксические клетки, Т-киллеры), CD19+ (В-лимфоциты), CD16+ (натуральные киллеры, и иммунорегуляторного индекса (CD4+ / cD8+) в интактных животных и на 30 сутки развития экспериментального бактериально-иммунного пародонтита. Установлено, что характер течения экспериментального воспаления в тканях пародонтального комплекса зависел от изменений клеточного иммунного статуса, сопровождался снижением содержания общих зрелых Т-лимфоцитов (СD3+) в крови животных с экспериментальным бактериально-иммунным пародонтитом на 30 сутки исследования; вместе с тем в процессе развития экспериментального бактериально-иммунного пародонтита произошло снижение в крови животных на 30 сутки исследования содержания Т-лимфоцитов-хелперов (СD4+), повышение Т-супрессоров (CD8+), повышение содержания натуральных киллеров (CD16+) и снижение относительного содержания В-лимфоцитов (СD19+). Иммунорегуля-торный индекс (СD4+ / СD8+) при этом уменьшился по сравнению с данным показателем группы интактных животных. У крыс при бактериально-иммунном пародонтите развивалось иммуносупрессивное состояние в поздний период течения воспалительной реакции за счет как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-супрессоров / киллеров. Эти изменения можно рассматривать как признаки формирования хронического течения воспалительного процесса в тканях пародонтального комплекса.
Ключевые слова: бактериально-иммунный пародонтит, иммунная система, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, воспаление.
UDC: 616.314.17-008.1-022.7-036.66-06:612.017.1]-092.9
CHANGES IN THE CELLULAR IMMUNE PROTECTION OF ORGANISM IN THE PROCESS OF CHRONIZATION OF EXPERIMENTAL BACTERIAL-IMMUNE PERIODONTITIS
A.Ye. Demkovych, Yu.I. Bondarenko, M.M. Yakymchuk
I. Horbachevsky Ternopil State Medical University
Summary
One of the important factors that leads to damage of structures of the periodontal complex and leads to the formation of inflammatory process of varying degrees is the disruption of immunological processes.
The aim of the study was to clarify the pathogenetic role of cellular adaptive immunity in the process of formation of chronic inflammatory reaction in the late period of the experimental bacterial-immune periodontitis. The study was conducted on white, non-breeding, clinically healthy male rats. Experimental bacterial-immune periodontitis in experimental animals was caused by insertion into the tissues of the periodontal complex a mixture of microorganisms diluted with egg protein. The obtained digital data was statistically processed using parametric and nonparametric statistical methods.
The article represents the results of research on the parameters of cellular immune defense, determined by the relative number of CD3+ (common T-lymphocytes), CD4+ (T-helpers), CD8+ (cytotoxic cells, T-killers), CD19+ (B-lymphocytes), CD16+ (natural killers, NK-cell) and immunoregulatory index (CD4+ / CD8+) in intact animals and on the 30th day of experimental bacterial-immune periodontitis development. It was established that the nature of the course of experimental inflammation in the tissues of the periodontal complex depended on changes in the cellular immune status, accompanied by a decrease of the content of common mature T-lymphocytes (CD3+) in the blood of animals with experimental bacterial-immune periodontitis on the 30th day of the study. In the process of the development of the experimental bacterial-immune periodontitis there was a decrease of the content of T-lymphocytes-helper (CD4+) in the blood of animals and on the 30h day of the study an increase in T-suppressors (CD8+), an increase in the content of natural killers (CD16+) and a decrease in the relative content of B-lymphocytes (CD19+). The immunoregulatory index (CD4+ / CD8+) decreased in comparison with this indicator of a group of intact animals. In rats with bacterial-immune periodontitis, an immunosuppressive state developed in the late period of the inflammatory reaction due to both T-helper cells and cytotoxic T-suppressors / killers. These changes can be considered as signs of formation of the chronic course of the inflammatory process in the tissues of periodontal complex.
Key words: bacterial-immune periodontitis, immune system, T-lymphocytes, B-lymphocytes, inflammation.
