CC BY
33
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2008. - Вип. 16, т. 1. - С. 3-7. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2008. - Vol. 16, N 1. - P. 3-7.
УДК 581.151
В. П. Бессонова, О. Є. Іванченко
Дніпропетровський державний аграрний університет
ЗМІНА АКТИВНОСТІ ГЛУТАМАТДЕГІДРОГЕНАЗИ В ОРГАНАХ ДЕКОРАТИВНИХ КВІТКОВИХ РОСЛИН ЗА ДІЇ НАДЛИШКУ Fe2+ ТА Cr3+
Вивчено вплив надлишку Fe2+ та Cr3+ на активність глутаматдегідрогенази в органах декоративних квіткових рослин. Встановлено підвищення активності ферменту в листках і коренях Tagetes patula L. протягом усього експерименту, а у Lathyrus odoratus L. цей показник збільшувався до 30-ї доби, після чого знижувався щодо контролю.
V. P. Bessonova, O. Y. Ivanchenko
Dnipropetrovsk State Agricultural University
CHANGE OF GLUTAMATE DEHYDROGENASE ACTIVITY IN THE ORGANS OF ORNAMENTAL FLOWERING PLANTS UNDER THE INFLUENCE OF Fe2+ AND Cr3+ EXCESS
The influence of Fe2+ and Cr3+ excess on glutamate dehydrogenase activity in the organs of ornamental flowering plants has been studied. The increase of enzymatic activity in leaves and roots of Tagetes patula L. was ascertained during all experiment. This index in Lathyrus odoratus L. had enlarged to the 30th day, whereupon went down in relation to a control.
Вступ
Аміак, що утворився в рослинах при відновленні нітратів, надалі засвоюється шляхом синтезу первинних амінокислот і амідів. Одним із можливих способів асиміляції амонію є відновне амінування а-кетоглутарату, внаслідок чого утворюється глутамат. Ця реакція каталізується ферментом глутаматдегідрогеназою (ГДГ) (К.Ф. 1.4.1.3). Певний час було прийнято вважати ГДГ головним ензимом, який забезпечує процес асиміляції аміачного азоту [8]. Із часом було відкрито ефективніший шлях здійснення цього процесу - за участю глутамінсинтетази та глутаматсинтази (ГС і ГТС), а ГДГ відводилася роль участі в асиміляції азоту тільки у виняткових випадках [3]. Проте про її значення в асиміляції NH4 у вищих рослин свідчать результати ряду досліджень [8]. Деякі автори вважають, що виділити серед механізмів асиміляції амонійного азоту основний важко, оскільки всі вони необхідні для забезпечення нормальної життєдіяльності рослин [13; 14]. На їх думку, роль ГДГ у процесі асиміляції амонію у тканинах рослин не можна вважати обмеженою. Мета роботи - встановити характер впливу надлишку Fe2+ і C/+ на активність ГДГ у листках і коренях декоративних квіткових рослин.
Матеріал і методи досліджень
Рослини чини запашної (Lathyrus odoratus L.) та чорнобривців розлогих (Tagetes patula L.) вирощували у гравійній культурі протягом 30 діб. Як джерело по-
© В. П. Бессонова, О. Є. Іванченко, 2008
живних елементів використовували розчин Кнопа, розведений дистильованою водою у співвідношенні І:4 із додаванням мікроелементів за Хогландом [7]. Поступово його розбавлення зменшували до І:3, І:2, І:І і не розводили. Рослини місячного віку розділяли на чотири варіанти: І) контроль - розчин Кнопа; 2) розчин Кнопа + Fe2+
І,0 мМ; 3) розчин Кнопа + Cr3+ 0,4 мМ; 4) розчин Кнопа + Fe2+ 0,І мМ + Cr3+ 0,4 мМ. Як джерело Cr3+ використовували CrCl36H2O, Fe2+ - FeSO4 7H2O. Для підтримання необхідної концентрації мінеральних речовин і фітотоксикантів у живильному розчині останній замінювали кожні 5 діб. Активність ГДГ визначали за прописом Т. Г. Ткемаладзе [ІІ], концентрацію білка - за Лоурі [9].
Результати та їх обговорення
У листках рослин T. patula та L. odoratus, які зростали у живильному середовищі з додаванням надлишку Cr3+, змін активності ГДГ щодо контролю на 2-у добу експерименту не відбувалося (табл.). На 7-у добу активність ферменту збільшувалася відносно контролю. Рівень зростання цього показника в листках обох видів близький за значеннями.
Таблиця
Вплив надлишку Fe2+ та Cr3+ на активність глутаматдегідрогенази в органах Tagetes patula та Lathyrus odoratus (нмоль НАДН окиснем. • мг білка-1 • 10 хв._1)
Доба Контроль 1 Cr3+ 0,4 мМ t Fe2+ І,0 мМ t Fe2+ + Cr3+ t
Tagetes patula
Листки
2 0Дб±0,02 0,27±0,03 0,27* 0,28±0,0І 0,90* 0Д5±0,02 0,35*
7 0Д4±0,0І 0,30±0,0І 4,28 0,32±0,02 3,б3 0,3І±0,0І 5,00
І2 0Д8±0,03 0,50±0,02 б,ІІ 0,бІ±0,03 7,85 0,4І±0,03 3,09
І7 0,33±0,02 0,53±0,03 5,55 0,5б±0,02 8ДІ 0,45±0,02 4,28
30 0Д2±0,0І 0,29±0,0І 5,00 0,32±0,00б 9,09 0Д5±0,08 0,37*
Корені
2 0,б4±0,02 0,75±0,02 3,92 0,72±0,0І 3,б3 0,7б±0,02 4,28
7 0,б0±0,02 0,80±0,02 7,І4 0,84±0,02 8,57 0,73±0,02 4,б4
І2 0,б2±0,0І 0,84±0,03 7,09 І,03±0,03 І 3,22 0,75±0,03 4,І9
І7 0,55±0,02 0,70±0,0І б,8І 0,72±0,03 4,72 0,б5±0,0І 4,54
30 0,4б±0,0І 0,39±0,0І 5,00 0,38±0,02 3,б3 0,34±0,02 5,45
Lathyrus odoratus
Листки
2 0,29±0,0І 0,3 І±0,02 0,90* 0,30±0,03 0,32* 0,32±0,02 І,3б*
7 0,3 І ±0,02 0,38±0,0І 3,І8 0,39±0,0І 3,б3 0,37±0,0І 2,72
І2 0,34±0,0І 0,48±0,02 б,3б 0,55±0,03 б,77 0,44±0,02 4,54
І7 0,3б±0,02 0,48±0,03 3,33 0,53±0,02 б,07 0Д8±0,0І 4,00
30 0,2б±0,0І 0Д2±0,0І 2,85 0,2І±0,0І 3,57 0,І8±0,0І 5,7І
Кої зені
2 0,82±0,02 І,0І±0,02 б,78 0,98±0,02 5,7І 0,99±0,03 4,72
7 0,8б±0,03 І,09±0,02 б,38 І,2І±0,03 8,33 І,08±0,02 б,ІІ
І2 0,93±0,0І І,03±0,0І 7,І4 І,І3±0,02 9,09 1,00±0,02 3,І8
І7 0,74±0,02 0,б4±0,02 3,57 0,б0±0,0І б,3б 0,5б±0,0І 8,І8
30 0,б2±0,0І 0,45±0,02 7,72 0,43±0,0І І3,57 0,35±0,0І І 9,28
Примітка: * - різниця між контролем і дослідом недостовірна на 5 % рівні значущості.
У наступні періоди росту дія Cr3+ викликала подальше підвищення активності ензиму, але ступінь змін цього показника відрізнялася у L. odoratus і T. patula. В останнього активація ферменту виражена суттєвіше і на І2-у та І 7-у добу експерименту перевищувала контрольні значення на 78,5 і б0,б %, а у L. odoratus - на 4І,І та 33,3 % відповідно. На 30-у добу у листках T. patula за дії Cr3+ також встановлено зро-4
стання активності ГДГ щодо контролю, але менше, ніж на 17-у добу. У листках Ь. одотаШз через 30 діб дії на рослини надлишку Ст3+ відбувалося гальмування активності ГДГ відносно норми.
При вивченні впливу надлишку Гє2+ на активність ГДГ у листках рослин спостерігалася така ж закономірність, як і за дії Ст3+ (див. табл.), проте підвищення активності ферменту відносно контролю відбувалося суттєвіше. Найістотніше збільшення активності ГДГ у дослідних видів відносно контролю спостерігалося на 12-у добу експерименту: у Т. раґиіа - 217,8 %, а у Ь. осотаґш - 161,7 % до контролю. На 30-у добу стимуляція активності ензиму у листках Т. раґиіа була меншою, ніж у попередні строки досліду. У Ь. осіотаґш у цей період ферментативна активність пригнічувалася відносно контролю. Співставлення одержаних результатів свідчить, що величини гальмування активності ГДГ у листках обох видів у досліді, де на рослини діє надлишок або Еє2+ або тільки Ст3+, близькі.
За спільної дії важкі метали спричиняли підвищення активності ензиму у листках Т. раґиіа, за винятком 2-ї та 30-ї доби експерименту, коли різниця між контролем і дослідом не суттєва. У Ь. осіотаґш цей показник достовірно зростав лише на 7-у та 12-у добу, після чого знижувався відносно контролю. Спільне внесення важких металів не викликало суттєвих змін активності ГДГ у листках Т. раґиіа на 2-у і 7-у добу експерименту порівняно з варіантами, де на рослини впливає будь-який із фітотоксикантів. Проте на наступних етапах експерименту при спільній дії надлишку металів встановлена значно менший ступінь активації ферменту, ніж за їх окремого впливу. Це ж стосується і напрямку зміни ензиматичної активності у листках Ь. осіотаґш до 12-ї доби включно. На 17-у добу вирощування цих рослин у розчині з присутністю обох забруднювачів виявлено пригнічення активності ГДГ щодо контролю, у той час як будь-який із них активує її.
Слід відзначити, що ферментативна активність у коренях рослин контрольного варіанта вища, ніж у листках. За дії на рослини важких металів підвищення активності ГДГ відносно контролю спостерігалося вже на 2-у добу досліду. На 7-у добу експерименту цей показник у коренях Т. раґиіа за дії надлишку Еє2+ дорівнював 140,0 %, Ст3+ - 133,3 %; Ь. оСотаґш - 140,6 і 126,7 %, відповідно. У коренях Т. раґиіа на 12-у добу перевищення активності ГДГ над контрольними значеннями у варіанті з Ст3+ залишалося таким самим, як і на 7-у, а у досліді з Еє2+ - зростало. На 17-у добу рівень активації ферменту важкими металами у цього виду знижувався порівняно з попереднім строком, а у Ь. осіотаґш падав щодо норми. За тривалого впливу на корені або Еє2+ або Ст3+ (30-а доба) спостерігалося інгібування активності ГДГ у коренях рослинних об’єктів порівняно з контролем.
За умов одночасного впливу фітотоксикантів у коренях Т. раґиіа підвищення активності ГДГ відбувалося вже на 2-у добу досліду і тривало до 17-ї доби включно. Активація ензиму виражена менш суттєво, ніж у варіантах, де у живильне середовище вносили будь-який з металів. На 30-у добу експерименту спостерігалося зниження показника на 26,1 %. У коренях Ь. о^таґш активність ГДГ зростала з 2-ї по 12-у добу (на 120,7, 125,6 і 107,5 %, відповідно), після чого спостерігалося паслаблення активності ферменту відносно контролю. Одночасна дія металів у коренях Ь. осіотаґш викликала практично такі ж зміни активності ГДГ, як і під впливом Ст3+.
Аналіз отриманих результатів свідчить про те, що у коренях за нетривалої дії нефізіологічних концентрацій Еє2+ і С/+ відбувається підвищення активності ферменту, хоча збільшення терміну росту рослин на живильному середовищі з важкими металами веде до інгібування його активності, причому у Ь. осіотаґш раніше - з 17-ї доби, а у Т. раґиіа - на 30-у добу.
Розглянемо можливі причини зміни активності ГДГ у вегетативних органах декоративних квіткових рослин за дії важких металів. У літературі є відомості, що за дії несприятливих чинників відбувається індукція і/або посилення синтезу ГДГ під впливом ендогенного амонію, відповідального за збільшення активності ензиму. Це спостерігається в процесі старіння і темнового стресу у зрізаних листках паростків гарбуза (Cucurbitapepo L.) [І7], за дії гербіциду 2,4-Д у гороху посівного (Pisum sativum L.) і кукурудзи (Zea mays L.) [І І]. Показано значну стимуляцію ГДГ активності у листках озимої пшениці іп vitro при додаванні Cu2+ і Cd2+ [б]. Проте у сім’ядолях гарбуза показано інгібуючу дію на активність ГДГ [І2]. Але слід відзначити, що у цьому випадку Zn2+ додавався безпосередньо до інкубаційного середовища з ферментом, а не надходив до клітин інтактної рослини при її вирощуванні у середовищі з надлишком металу. В. І. Бабенко і Ф. Д. Нарійчук [І] також вказують на зниження активності ГДГ у ізольованих хлоропластах пшениці за дії негативних температур при загартовуванні. В. Пахліч [І 5] спостерігав підвищення активності ГДГ рослин після їх окурювання SO2. Таким чином, ряд стресових чинників викликає підвищення активності ГДГ.
В. Л. Кретович із співавторами [8] вважає, що ГДГ рослин може ефективно брати участь в асиміляції амонію тільки за умов високої його концентрації, коли синтез глутамату та активність ГС пригнічені. За результатами наших експериментів надлишкові концентрації Fe2+ та Cr3+ у середовищі призводять до збільшення вмісту NH4+ у тканинах вегетативних органів [4]. Це супроводжується інгібуванням активності ГС - ферменту, який поряд з ГТС є провідним у первинній асиміляції амонію [5]. Отже, активізація ГДГ у листках і коренях квіткових рослин за дії на них фітотоксичних концентрацій Fe2+ і Cr3+, можливо, пов’язана зі збільшенням кількості амонію у тканинах.
Важкі метали інгібують активність ферментів завдяки заміні ними первинного металу, що зменшує або зовсім пригнічує їх каталітичну активність [І б]. Метал у складі ГДГ не виявлено [8]. Можливою причиною пригнічення активності ферментів є коагуляція білків [Іб] або окиснення SH-груп унаслідок ініціації вільнорадикальних процесів важкими металами [2]. Проте у літературі є відомості про велику стійкість деяких ГДГ до денатуруючих чинників. Л. П. Лосєва та ін. [І0] пояснює стійкість ГДГ до концентрованого розчину сечовини наявністю великого гідрофобного ядра, що стабілізує її олігомерну структуру.
Отже, на активність ГДГ діють два різноспрямованих чинники: опосередковано - підвищення вмісту амонійного азоту у вегетативних органах рослин за умов дії на них надлишку Fe2+ і Cr3+, у той час як безпосередньо важкі метали на фермент впливають негативно. Ступінь зміни активності ферменту залежить від співвідношення сили дії цих чинників та стійкості ензиму. Зростання активності ГДГ за умов дії на рослини надлишку заліза та хрому має суттєве позитивне значення з погляду адаптаціогенезу рослин. Підвищення активності цього ферменту якоюсь мірою компенсує зниження активності інших ферментів асиміляції амонію.
Висновки
Надлишок Fe2+ та C/+ спричиняв піднесення активності ГДГ в органах декоративних квіткових рослин. У листках відносно стійкого за морфологічними ознаками виду T. patula вища ферментативна активність зберігалася протягом усього експерименту, а у L. odoratus вона знижувалася щодо контролю на 30-у добу експерименту.
б
У коренях T. patula перевищення активності ГДГ над контролем визначено протягом усього досліду (за винятком 30-ї доби), у L. odoratus - протягом І2 діб, після чого активність ферменту знижувалася.
У зв’язку зі значною та однотипною реакцією ГДГ на надлишкові концентрації Fe2+ та Cr3+ у листках T. patula динаміку змін активності ензиму можна використовувати у моніторингових дослідженнях як маркер стану довкілля, забрудненого металами. Для з’ясування повнішої картини доцільності застосування активності ГДГ у фітоіндикації важливо вивчити характер змін цього показника в органах рослин у польових умовах за градієнтом концентрації важких металів.
Бібліографічні посилання
1. Бабенко В. И. Влияние пониженной температуры на малат- и глутаматдегидрогеназу хлоропластов озимой пшеницы / В. И. Бабенко, Ф. Д. Нарийчук // Доклады АН СССР. -І97б. - Т. 228, № 5. - С. І252-І255.
2. Бессонова В. П. Цитофизиологические эффекты воздействия тяжелых металлов на рост и развитие растений. - Запорожье: ЗДУ, І999. - 208 с.
3. Измайлов С. Ф. Азотный обмен в растениях. - М.: Наука, І98б. - 320 с.
4. Іванченко О. Є. Вплив надлишку заліза та хрому на накопичення аміачного азоту в вегетативних органах Lathyrus odoratus // Питання біоіндикації та екології. - 2002. - Вип. 7, № 2-3. - С. б3-7І.
5. Іванченко О. Є. Зміна активності глутамінсинтетази в листках і коренях Lathyrus odoratus при дії надлишку заліза (ІІ) та хрому (ІІІ) у живильному середовищі // Питання біоіндикації та екології. - 2004. - Вип. 9, № І. - С. 89-95.
6. Іванюк Г. В. Вплив фітохрому, двовалентних катіонів і регуляторів їх мембранної проникності на активність НАДН-глутаматдегідрогенази озимої пшениці // Физиология и биохимия культурных растений. - І997. - Т. 29, № 5. - С. 333-337.
7. Клейн Р. М. Методы исследования растений / Р. М. Клейн, Д. Т. Клейн. - М.: Колос, І974. - 52б с.
8. Кретович В. Л. Обмен азота в растениях. - М.: Наука, І972. - 527 с.
9. Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений. - М.: Колос, І97б. - 225 с.
10. Структурные особенности конститивной ГАД(Ф)-глутаматдегидрогеназы Chlorella pyrenoidosa 82 T // Л. П. Лосева, В. Р. Шатилов, Т. А. Валуева, В. Л. Кретович // Доклады АН СССР. - І98І. - Т. 257, № б. - С. І483-І487.
11. Ткемаладзе Г. Ш. Влияние 2,4-Д на активность глутамат- и малатдегидрогеназы в проростках гороха и кукурузы // Физиология растений. - І98І. - Т. 28, № 5. - С. І0І3-І02І.
12. Chou K. H. Glutamate dehydrogenase from pumpkin cotyledons: characterization and isoenzymes / K. H. Chou, W. E. Splittstoesser // Plant Physiol. - І972. - Vol. 49, N 4. - P. 550-554.
13. Dark starvation and plant metabolism. IV. The alteration of enzyme activities // G. Jacobi, B. Klemme, G. Krapf, C. Postius // Biochem. und Physiol. Pflanz. - І975. - Bd. Іб8, N i/4. -S. 247-25б.
14. Loyola Vargas V. M. Differrential roles of glutamate dehydrogenase in nitrogen metabolism of maize-tissue / V. M. Loyola Vargas, E. S. Jimenes // Plant Physiol. - І984. - Vol. 7б, N 5. -P. 53б-540.
15. Pachlich E. Effect of SO2 on activites of glutamatdehydrogenase and glutaminesyntetase from pea seedlings / E. Pachlich, H. J. Jager, L. Steubing // Gegev. Bot. - І972. - Vol. 4б, N 4. -P. І83-І97.
16. Williams J. P. Heavy metals in biological systems // Endeavour. - І9б7. - Vol. 2б. - P. 9б-І00.
Надійшла до редколегії 22.03.2007
