CC BY
95
11. Чупрова, В.В. Первичная продукция и запасы почвенного органического вещества в агроценозах Тувы / В.В. Чупрова, В.Н. Жуланова // Плодородие. - 2008. - №4. - С.27-29.
12. Чупрова, В.В. Чистая первичная продукция агроценозов в Центральной Сибири / В.В. Чупрова // Экосистемы Центральной Азии: исследования, проблемы охраны и природопользования: мат-лы IX Убсунур-ского Междунар. симпозиума (16-20 сент. 2008 г., Кызыл). - Кызыл: ТЫВАполиграф, 2008. - С.63-66.
'--------♦------------
УДК 582.572.2 И.Н. Крестова
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ПЫЛЬЦЫ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА HEMEROCALLIS L.
ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ
Определена относительная жизнеспособность пыльцы дальневосточных представителей рода Hemerocallis L. методом проращивания на искусственных средах, выявлены оптимальные условия для ее сбора, а также концентрации растворов питательных сред и катализаторы для проращивания пыльцы разных видов. Проверена эффективность метода криоконсервации для долговременного хранения пыльцевых зерен и дальнейшего использования в гибридизационных опытах.
Ключевые слова: жизнеспособность пыльцы, криоконсервация, род Hemerocallis L.
I.N. Krestova
VIABILITY OF POLLEN OF THE HEMEROCALLIS L. SORT OF THE FAR EAST REPRESENTATIVES IN VARIOUS STORAGE CONDITIONS
Relative viability of pollen of Hemerocallis L. sort of the Far East representatives is determined by the technique of sprouting on artificial environments, optimum conditions for its gathering, and also nutrient environments solutions concentration and catalysts for different kinds of pollen sprouting are revealed. Efficiency of the cryopre-servation technique for long-term pollen grains storage and further use in the hybridization experiments is checked.
Key words: pollen viability, cryopreservation, Hemerocallsi L. sort.
Введение. Лилейники занимают особое положение в декоративном садоводстве среди травянистых многолетников. Высокие декоративность, экологическая пластичность, иммунность, показатели вегетативного размножения, относительно низкая экономическая затратность культивирования всегда привлекали специалистов, работающих в области декоративного садоводства. Изучение биологических особенностей видов и сортов рода Hemerocallis L. проводилось в различных регионах России и за рубежом [3; 8; 5; 6; 13; 9; и др.]. В климатических условиях российских регионов работа ведется с видами и сортами, относящимися к группе летнезеленых, составляющей чуть более половины мирового сортимента этой культуры. Дальневосточные виды рода Hemerocallis L., приспособленные к условиям морозных бесснежных зим, более длинного дня, короткого вегетационного периода, получили в ходе эволюции определенный запас адаптивных признаков и свойств, которые могут быть переданы гибридам. Богатый природный генофонд заслуживает не только эффективного использования в качестве особо ценного исходного селекционного материала, но и надежного сохранения in situ [1].
На территории российского Дальнего Востока в естественных местообитаниях встречаются 6 видов рода Hemerocallis L. - H. coreana Nakai, H.esculenta Koidz., H. lilio-asphodelus L., H. middendorffii Trautv. et Mey., H. minor Mill. и H. yezoensis Hara [7]. Все они, а также более 20 внутривидовых форм и естественных гибридов и 82 сорта, представлены в коллекции Ботанического сада-института ДВО РАН (БСИ ДВО РАН). Сочетание разных видов и сортов лилейников позволяет получать композиции непрерывного цветения с конца мая до середины сентября, но фазы цветения раноцветущих видов и высокодекоративных сортов значительно различаются [11].
Целью работы было определение жизнеспособности пыльцы видов рода Hemerocallis L. при различных условиях ее сбора и хранения.
Материалы и методы исследований. Пыльца была собрана в июле-августе 2007 г. и в мае-июне 2008 г. с растений из коллекции БСИ ДВО РАН. Образцы пыльцы вместе с пыльниками после подсушивания в течение 1 часа при t 21-23^ и влажности 60-70% хранились в стерильных герметичных бюксах. Сбор пыльцы проводился в первой половине дня из нераскрытых цветков примерно за 1-1,5 часа до их открытия, в интервале с 8 до 11 часов утра. Время сбора менялось, так как раскрывание венчиков цветов зависело от погодных условий. Раскрытие пыльников происходило в лабораторных условиях после просушивания. Для опытов по срокам хранения брали пыльцу из одного цветка, смешивая ее из всех 6 пыльников, и разделив на необходимое число образцов.
Количество собранных образцов пыльцы
Вид Условия сбора Условия проращивания (наличие и вид катализатора)
Солнечно Пасмурно Без катал. H ct H es H la H md H mn Pt
H ct 0 5 - 5 - - - - -
H es 10 40 15 - 10 25 - - -
H la 45 30 45 - 15 15 - - 5
H md 40 10 25 - - 5 10 10 -
H_mn 10 10 10 - - 5 - 5 -
Примечание: H. citrina - H_ct; H. esculenta - H_es; H. lilioasphodelus - H_la; H. middendorfii - H_md; H. minor - H_mn.
Хранение образцов пыльцы осуществлялось при температурах +3°C, -18°C и -196°C. Принято различать жизнеспособность пыльцы и её оплодотворяющую способность (фертильность). Под жизнеспособностью обычно понимают способность пыльцевых зерен прорастать на рыльце пестика при наличии всех необходимых условий. Оплодотворяющая способность, или зиготический потенциал, пыльцевого зерна - это способность вызывать полное оплодотворение. В наших опытах мы определяли жизнеспособность пыльцы.
Методом проверки было выбрано проращивание пыльцы на искусственных средах [4], принималось во внимание, что этот метод дает заниженные результаты. Пыльца проращивалась в каплях дистиллированной воды и раствора глюкозы с концентрациями 5, 10 и 15% на предметном стекле. Предметное стекло хранилось на пластиковых подставках в чашке Петри с водой на дне. Под микроскопом пыльца просматривалась через 1, 5, 8, 24 часа. Подсчет проросших пыльцевых зерен проводился в пяти случайных полях зрения для каждой концентрации. На искусственных средах практически невозможно получить пыльцевые трубки, не только равные по длине расстоянию от поверхности рыльца до середины завязи, т.е. до семязачатков, но хотя бы приближающиеся к нему [2]. За проросшие зерна принимались те, у которых длина пыльцевой трубки превышала диаметр пыльцы. Для подсчета применялся микроскоп «Микмед-1» с фотонасадкой и системой документирования, работа с препаратами велась при увеличениях 4x15, 10x15 F 4,2.
Для опытов по влиянию на прорастание пыльцы частей пестика представителей рода Hemerocallis L. брали целое рыльце с частью столбика длиной 1-2 мм из только что раскрытого цветка с появившимися каплями стигматической жидкости. Дополнительно использовали верхние части пестиков Petunia hybrida, охарактеризованные И.Н. Голубинским [2] как «растение с исключительно энергичным действием секрета рыльцев».
Пыльца была проверена на всхожесть после хранения при различных условиях, на различных средах. Был рассчитан процент проросших пыльцевых зерен к их общему числу в поле зрения бинокуляра. Всхожесть пыльцы, отобранной с каждого индивидуума, была рассчитана как среднее из пятикратной повторности.
Для оценки зависимости всхожести пыльцы разных видов от погодных факторов при отборе материала, хранении и проращивании пыльцы, представленными категорийными переменными, был использован однонаправленный дисперсионный анализ [10] с последующим тестом Tukey [12]. Статистический анализ реализован с помощью пакета Statistica 8.0.
Результаты исследований и их обсуждение. Сбор пыльцы проводился при различных погодных условиях. Не для всех видов удалось собрать пыльцу в ясную и облачную погоду, так как период цветения некоторых образцов приходился только на облачную или только на ясную погоду. По этой причине данные для H. citrina, H. coreana оказались неполными и не были включены в анализ. Результат, полученный нами после определения фертильности пыльцы, собранной при относительной влажности воздуха выше 90%, позволяет говорить о метеозависимости оплодотворяющей способности пыльцы лилейников. У всех изучаемых видов пыльца, собранная при данных условиях, не прорастала совсем. При этом уровень всхожести пыльцы, собраной в облачную погоду, но при влажности воздуха ниже 89%, был в 1,5-2,0 раза ниже, чем при условиях сбора в ясную погоду и при влажности ниже 65%.
Относительная жизнеспособность свежесобранной пыльцы определялась в четырех средах, но в водном растворе глюкозы концентрацией 15 % для всех видов получен отрицательный результат, или пророс-
ших пыльцевых зерен были единицы. Для всех видов максимальное количество проросших пыльцевых зерен наблюдалось в растворе с концентрацией глюкозы 5 %, однако пыльца Н. е$ои!еп1а, Н. т1ССепСоШ в воде прорастала активнее, чем в растворах глюкозы.
100
80
60
40
20
О
100
100
80
А
т
1
^±0-
Г Д
Ж
г-Н
.
J±L
-it.
mn
H_es H_la H_md H_mn H_es H_la H_md H_mn H_es H_la H_md H_mn
Виды Виды Виды
Рис.1. Прорастание пыльцы видов НетегооаШэ, собранной в солнечную (столбцы без заливки) и пасмурную (столбцы с черной заливкой) погоду, в воде (А, Г, Ж, К) и в водном растворе глюкозы концентрацией 5 (Б, Д, З, Л) и 10 % (В, Е, И, М) при немедленном проращивании при комнатной температуре (А, Б, В); после кратковременного хранения при температуре +3°С (Г, Д, Е); после длительного хранения при температуре -18°С (Ж, З, И) и после длительного хранения в жидком азоте (К, Л, М). (Обозначение видов как в таблице. Здесь и далее: столбцы обозначают средние значения выборок, доверительный интервал - величину стандартного отклонения)
80
60
40
20
0
Е
З
И
80
60
40
20
о
К
Л
М
60
40
20
о
После хранения пыльцы при +3°C в течение месяца жизнеспособность ее значительно снижалась, а для H.esculenta терялась полностью (рис.1, Г, Д, Е). После трех месяцев хранения в таких условиях прорастания пыльцевых зерен не наблюдалось.
При хранении пыльцы в морозильном шкафу при -18°C жизнеспособность пыльцы определялась через 1,
3, 6, 12 месяцев. В результате было выявлено, что при этих условиях хранения жизнеспособность пыльцы теряется медленнее, чем при предыдущих и через один месяц остаётся все еще довольно высокой. Но через 3 месяца хранения жизнеспособной остается только пыльца H. middendorfii и H. minor (рис. 1, Ж, З, И). После полугода хранения проросших пыльцевых зерен отмечались единицы, а после года хранения - ни одного.
При хранении пыльцы в жидком азоте жизнеспособность пыльцы, собранной при влажности атмосферного воздуха ниже 65%, для всех видов оставалась практически такой же, как и у свежесобраной. Пыльца, взятая для хранения в пасмурную погоду с высокой влажностью воздуха, потеряла возможность прорастать на искусственной среде у всех видов, за исключением H. minor. Мы предполагаем, что это объ-
ясняется тем, что атмосферная влага увлажняет пыльцу и при погружении в жидкий азот происходит разрушение пыльцевых зерен. Вероятно, просушивание пыльников после сбора в течение 1-1,5 часов недостаточно для закладки пыльцы для криоконсервации. Положительный результат для H. minor, по нашему мнению, объясняется тем, что размеры и пыльников, и пыльцевых зерен у растений этого вида значительно меньше, чем у других видов, а значит пыльца высушивается быстрее.
Наличие энергетического компонента (в нашем случае это глюкоза) в искусственной среде позволяет проращивать пыльцевые зерна и сравнивать их относительную жизнеспособность для разных видов одного рода. Но в естественных условиях прорастающие пыльцевые зерна находятся в сложном многокомпонентном растворе различных по химической природе соединений, результат влияния которых на прорастание в искусственной среде изменяет соотношение процента проросших зерен в разных по концентрации растворах.
Для выяснения влияния стигматической жидкости лилейников мы использовали пестики того же вида красодневов, чью пыльцу проращивали. При добавлении сегмента рыльца в каплю питательной среды, кроме того, что в раствор поступали стимулирующие вещества из пестика, изменялась и концентрация сахаров в растворе, так как объем стигматической жидкости на рыльце пестика вполне сопоставим с объемом капли питательной среды. Причем более крупное рыльце H. middendorfii настолько насыщало раствор секреторной жидкостью, что максимальный процент прорастания пыльцевых зерен мы наблюдали в капле чистой воды, как для свежесобраной пыльцы, так и после хранения в жидком азоте. В то же время при концентрации глюкозы 5 % число проросших пыльцевых зерен уменьшалось, а в перенасыщенном 10%-м растворе было очень н изким (не более
с? 100
80
60
40
А Б
к 20
. 100
,Г~Ї—|
80
60
40
20
Г Д
cl cd
Условия хранения
cl cd
Условия хранения
cl cd
Условия хранения
Рис. 2. Прорастание пыльцы видов H. middendorfii (А, Б, В) и H. minor (Г, Д, Е), собранной в солнечную погоду, при отсутствии (столбцы без заливки) и присутствии (столбцы с черной заливкой) катализатора в воде (А, Г), в водном растворе глюкозы концентрацией 5 (Б, Д) и 10% (В, Е) при различных условиях хранения: n - немедленное проращивание при комнатной температуре; cl - после длительного хранения при температуре +3°C; cd - после длительного хранения при температуре -18°C; ec - длительное хранение в жидком азоте
В
0
Е
0
n
ec
n
ec
n
ec
Хранение пыльцы при +3 и -18°C, как мы уже указывали, значительно снижает жизнеспособность пыльцы, но присутствие сегментов рылец позволяет простимулировать прорастание единичных пыльцевых зерен.
На свежесобранную пыльцу H. minor добавление сегментов рылец положительно влияет только в воде, в растворах глюкозы их присутствие снижает процент проросших зерен, вероятно, из-за перенасыщения раствора сахарами. Тем не менее после хранения пыльцы в различных условиях, когда жизнеспособность пыльцы значительно снижается, и мы получаем отрицательный результат на чистых питательных средах, добавление катализаторов позволяет простимулировать прорастание пыльцы на всех концентрациях питательного раствора, хотя и с различными значениями процента прорастания.
В целом присутствие сегментов рылец стимулирует прорастание большего количества пыльцевых зерен на питательных средах, но требует корректировки оптимальной концентрации питательного раствора.
В опытах по изучению влияния стигматической жидкости на прорастание пыльцевых зерен мы использовали как сегменты рылец того же вида, что и пыльца, так и других видов этого рода, а также рыльца
Petunia hybrida. Во всех случаях в присутствии в капле искусственной среды катализатора процент проросших пыльцевых зерен был выше, чем при его отсутствии. Но если пыльца и рыльце принадлежали растениям одного вида, процент проросших зерен с катализатором был достоверно выше. Для H. minor он был больше на 6-8 % (минимальное значение для свежесобранной пыльцы среди исследуемых видов) и на 1722 % - для H. middendorfii (максимальное значение). Стимулирующее влияние рылец раноцветущих видов (H. coreana, H. middendorfii, H. minor) на пыльцу поздноцветущих (H. esculenta, H. lilio-asphodelus, H. yezoen-sis) и обратное нами не было изучено из-за значительного расхождения во времени периодов цветения, но влияние внутри этих групп было проверено. Присутствие рылец Petunia hybrida также оказывало на прорастание пыльцы стимулирующее влияние, но оптимальным стимулятором для всех видов были рыльца того же вида.
100
80
60 -
60
40
100
40
20
100
80
60-----
• tSF
*: JJfc*
C_0 C_5 C_10
Тип среды
0
00
Б
80
20
0
В
80
60
0
Г
Рис.3. Прорастание пыльцы Hemerocallis middendorfii при использовании в качестве катализатора рылец этого же вида (столбцы без заливки) и рылец H. minor (столбцы с черной заливкой) при немедленном проращивании при комнатной температуре (А); после кратковременного хранения при температуре +3°С (Б); после кратковременного хранения при температуре -18°C (В) и после длительного хранения в жидком азоте (Г), в воде (С_0) и в водном растворе глюкозы
концентрацией 5 (С_5) и 10% (С_10)
Выводы
1. Определение относительной жизнеспособности пыльцы представителей рода Hemerocallis методом проращивания на искусственных средах позволило выявить оптимальные условия сбора пыльцы для использования в дальнейшем селекционном процессе. Пыльцу необходимо брать в солнечную ясную погоду при относительной влажности атмосферного воздуха менее 65 %, в момент раскрытия цветка или за 0,5-1 ч до его раскрытия из нераспустившихся бутонов до растрескивания пыльников. Наименее метеозависимой оказалась жизнеспособность свежесобранной пыльцы H. esculenta, H. middendorfii и H. minor, наиболее ме-теозависима пыльца H. middendorfii.
2. Оптимальная для проращивания концентрация глюкозы в водном растворе 5 %. При проращивании пыльцы на искусственных средах добавление в питательный раствор секрета рылец оказывает стимулирующее действие на энергию прорастания и повышает процент проросших зерен на 6-22% для разных видов. Катализатором при проращивании пыльцевых зерен видов лилейников может выступать стигматическая жидкость рылец разных видов, но максимально повышение числа проросших зерен дает использование секрета рылец того же вида.
3. При хранении пыльцы исследуемых видов в различных температурных условиях долгосрочное сохранение жизнеспособности возможно только в жидком азоте. При деконсервации пыльцы проверка жизнеспособности всех исследуемых видов методом проращивания на искусственных средах показала, что после криоконсервации жизнеспособность пыльцевых зерен остается на том же уровне, что и у свежесобранной со средним отклонением в 2-4 %. Длительное хранение пыльцы методом криоконсервации позволяет более широко использовать генетический потенциал видовых лилейников для сохранения и обогащения генофонда.
Литература
1. Агеев, М.Г. Эволюционно-генетическая концепция диких родичей культурных растений / М.Г. Агеев // Ботанические исследования в Азиатской России: мат-лы XI съезда РБО. - Барнаул, 2003. - Т.3. - С. 68-69.
2. Голубинский, И.Н. Биология прорастания пыльцы / И.Н. Голубинский. - Киев: Наукова думка, 1974. -368 с.
3. Миронова, Л.Н. Итоги интродукции и селекции декоративных травянистых растений в Республике Башкортостан. Ч.2. Класс Однодольные / Л.Н. Миронова, А.А. Реут, И.Е. Анищенко. - М.: Наука, 2007.
4. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. - М.: Агропромиздат, 1988. - 148 с.
5. Пельтихина, Р.И. Интродукция видов и сортов р. Hemerocallis L. (Hemerocallidaceae R. Broun) в Донбасс и перспективы их использования в декоративном садоводстве / Р.И. Пельтихина, И.И. Крохмаль. - Донецк: Норд-Пресс, 2005. - 236 с.
6. Русинова, Т.С. Лилейники / Т.С. Русинова. - М.: АСТ; Астрель, 2005. - 175 с.
7. Сосудистые растения советского Дальнего Востока / под ред. С.С. Харкевич. - Л.: Наука, 1987. - Т. 2. - C. 393-397.
8. Турчинская, Т.Ю. Лилейники гибридные / Т.Ю. Турчинская. - Тбилиси: Мецниерба, 1973. - 89 с.
9. Ahn, Y-H. Palynotaxonomic study of the genus Hemerocallis L. in Korea / Y-H. Ahn, S-H. Kim, C. Lee // Journal of the Korean Society for Horticultural Science. - 1999. - Р. 505-510.
10. Hartley, H.O. Expectations, Variances and Covariances of ANOVA Mean Squares by "Synthesis” / H.O. Hartley // Biometrics, 1967. - Vol. 54. - P. 93-108.
11. Krestova, I.N. Daylilies in the Russian Far East flora as sours of new cultivars / I.N. Krestova // 3 Global Botanic Garden Congress. - China: Wuhan, 2007.
12. Winer, B.J. Statistical principals in experimental design. (3rd ed.) / B.J. Winer, D.R. Brown, K.M. Michels. -New York: McGraw-Hill, 1991.
13. Zomlefer, W.B. The genera of Hemerocallidaceae in the southeastern United States / W.B. Zomlefer// Harv Pap. - 1998. - Р.113-145.
