CC BY
93
i в мире науки |
жизнеспособность бактерий рода Bifidobacterium в зависимости от условий криоконсервации
УДК 579.2+579.6;573.6
Бактерии рода Bifidobacterium являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и теплокровных животных и играют важную роль в поддержании кишечного микробиоценоза, обеспечении колонизационной резистентности кишечника, стимуляции иммунной системы и нормализации обмена веществ организма хозяина, что обусловило их широкое использование в медицинской и ветеринарной практике, пищевой промышленности, а также привело к интенсификации научных исследований данной группы микроорганизмов [1-3]. Сохранение культур Bifidobacterium, выделенных из природных источников, в жизнеспособном состоянии с исходными свойствами, необходимо для изучения физиологии и генетики данных бактерий, а также механизмов их позитивного действия.
Анастасия Сидоренко,
младший научный сотрудник лаборатории «Коллекция микроорганизмов» Института микробиологии НАН Беларуси
Галина Новик,
завлабораторией «Коллекция микроорганизмов» Института микробиологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
Использование при производстве бифи-досодержащих пробиотиков и продуктов питания физиологически активных стартовых культур бифидобактерий позволяет снизить экономические затраты и повысить качество выпускаемой продукции. В связи с этим разработка эффективных методов хранения коллекционных и производственных культур бифидобактерий имеет большое практическое значение.
Надежным методом длительного хранения микроорганизмов различных таксономических групп является криоконсервация при
температуре жидкого азота (-196 0С) [4-6]. Экономичность, низкая трудоемкость, возможность практически неограниченного хранения культур без существенной потери жизнеспособности, отсутствие необходимости длительной реактивации клеток позволяют считать этот способ особенно перспективным.
Особое внимание при разработке технологических приемов криоконсервации уделяют подбору оптимального режима охлаждения, так как большинство повреждений в клетках микроорганизмов развивается на этапе замораживания и зависит от скорости подвода и отвода тепла [4-6]. При низких скоростях охлаждения кристаллизация воды происходит главным образом во внеклеточной среде, приводя к концентрированию внеклеточного раствора и частичной дегидратации клеток. В этом случае факторами, повреждающими мембраны, могут быть концентрированные растворы солей, большие осмотические потоки воды, изменение формы изгиба
мембран при осмотическом сжатии клеток. При высоких скоростях охлаждения происходит внутриклеточная кристаллизация воды, а образовавшиеся внутриклеточные кристаллы льда механически повреждают мембраны. Полагают, что для каждого биологического объекта существует оптимальная скорость замораживания, которая находится на границе двух диапазонов скоростей охлаждения - скоростей, приводящих к обезвоживанию клетки, и скоростей, вызывающих появление внутриклеточного льда.
При криоконсервации клетки микроорганизмов должны быть суспендированы в подходящих защитных средах, использование которых позволяет значительно расширить диапазон скоростей охлаждения без существенного снижения жизнеспособности. Выбор защитных сред и криопротекторов в значительной степени зависит от индивидуальных особенностей микроорганизмов и условий криоконсервации. В практике низкотемпературной консервации биологических объектов применяют как отдельные низкомолекулярные вещества (такие как глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), сахароза, глюкоза, лактоза), так и высокомолекулярные соединения (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленоксид (ПЭО), декстран, крахмал), а также некоторые компоненты растительного и животного происхождения (желатин, обезжиренное молоко, сыворотка крови, яичный желток). Механизмы защитного действия криопро-текторов разнообразны и в полной мере еще не изучены [4, 5]. Полагают, что добавление криопротекторов к суспензии клеток
способствует снижению температуры кристаллизации, а также может приводить к снижению концентрации внеклеточных и внутриклеточных электролитов. Отмечена способность криопротекторов вступать в контакт с молекулами белков путем гидрофильных и гидрофобных взаимодействий, образуя сольватную оболочку вокруг макромолекул и мембран, и таким образом снижать степень дегидратации клетки и препятствовать стерическому сближению макромолекул в мембране. Имеются данные о том, что предварительный контакт клеток с криопротектором приводит к торможению активности ряда ферментов и подготавливает биологические объекты к действию низких температур, предотвращая повреждения, связанные с температурным и осмотическим шоком.
Цель работы - изучение жизнеспособности бифидобактерий после криоконсерва-ции в зависимости от режима охлаждения и защитной среды.
Объектами исследований служили штаммы бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791, B. longum В379М, предоставленные сотрудниками Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, и B. adolescentis БИМ В-87 из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Бактерии выращивали при 37 0C в среде МРС [7] с добавлением 0,05% L-цистеина (МРС-Б). Криоконсерва-ции подвергали 18-20-часовые физиологически активные культуры 3-й генерации.
Перед замораживанием клетки бифидо-бактерий осаждали центрифугированием (10 мин., 8000 об/мин.), дважды отмывали от ростовой среды, суспендировали в равном объеме физиологического раствора (ФР). При изучении влияния криозащитной среды на выживаемость бифидобактерий клетки суспендировали в ФР, 1%-ной пептонной воде (ПВ) и стерильной среде МРС-Б. 1 мл полученной суспензии вносили в стерильные криопробирки (Nunc, Дания) объемом 1,8 мл, инкубировали 30 мин при +4 0С для эквилибрации клеток с защитной средой. Программное охлаждение образцов осуществляли на программном замораживателе биообъектов Crioson BV-6 (Crioson technisch laboratorium, Германия), используя следующие режимы охлаждения:
№1: охлаждение от 20 0С до -40 0С со скоростью 28—29 0С/мин. с последующим погружением образцов в жидкий азот; №2: охлаждение от 20 0С до -40 0С со скоростью 1 0С/мин. с последующим погружением образцов в жидкий азот; №3: охлаждение от 20 0С до -40 0С со скоростью 2 0С/мин. с автоматическим температурным снятием переохлаждения с последующим погружением образцов в жидкий азот;
№4: быстрое охлаждение от 20 0С до -196 0С путем непосредственного погружения в жидкий азот.
Отогрев культур осуществляли на водяной бане при 37 0С в течение 5 мин.
Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/ мл) определяли методом предельных разведений [8] с последующим посевом в полужидкую (0,2% агара) тиогликолевую (ТГ) среду (ОАО «Биомед», Россия). Развитие в
питательных средах оценивали по показателям накопления биомассы и активности кислотообразования через 24 часа культивирования в среде МРС-Б. Накопление биомассы определяли нефелометрически, путем измерения оптической плотности бактериальной культуры относительно стерильной среды культивирования при А=600 нм (ОП), используя фотоколориметр КФК-3 (Россия). Активность кислотообразования - изменение активной кислотности (рН) среды в процессе развития популяции бифидобактерий - определяли потенцио-метрически, используя рН-метр Piccolo plus (HANNA Instruments, Польша). Развитие в молоке оценивали по времени образования и показателю активной кислотности (рН) сгустка. Наличие в криоконсервиро-ванных клетках нелетальных повреждений оценивали по изменению способности би-фидобактерий развиваться в среде МРС-Б при неоптимальном значении рН (рН 5,0). Морфологию клеток бифидобактерий
Таблица 1. Влияние режима охлаждения на жизнеспособность бифидобактерий
Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл
Режим B. adolescentis БИМ В-87 B. bifidum 791 B. longum B379M
контроль 2,4±1,2х107 2,7±1,3х107 2,6±1,5х107
№1 1,4±1,3х107 2,2±1,2х106 6,8±1,3х106
№2 1,8±1,4х107 4,2±1,8х106 1,8±1,1х107
№3 1,2±1,1х107 2,3±1,4х106 7,6±2,0х106
№4 2,1±1,3х106 7,3±1,9х105 1,7±1,3х106
Таблица 2. Развитие бифидобактерий в среде МРС-Б после криоконсервации с использованием разных режимов охлаждения
B. adolescentis БИМ В-87 B. bifidum 791 B. longum B379M
Режим Биомасса, ОП600 Кислотность, рН Биомасса, ОП600 Кислотность, рН Биомасса, ОП600 Кислотность, рН
контроль 2,348-2,452 4,0-4,2 2,094-2,136 4,0-4,2 2,529-2,673 3,7-3,9
№1 2,234-2,347 4,1-4,3 2,058-2,097 4,1-4,4 2,448-2,569 3,8-4,1
№2 2,352-2,418 4,1-4,3 2,086-2,121 4,1-4,4 2,496-2,544 3,8-4,1
№3 2,271-2,334 4,1-4,3 2,005-2,089 4,1-4,4 2,266-2,338 3,8-4,1
№4 1,987-2,029 4,1-4,3 1,599-1,798 4,2-4,5 2,083-2,167 3,9-4,3
Таблица 3. Развитие бифидобактерий в молоке после криоконсервации с использованием разных режимов охлаждения
B. adolescentis БИМ В-87 B. bifidum 791 B. longum B379M
Режим Время, ч Кислотность, рН Время, ч Кислотность, рН Время, ч Кислотность, рН
контроль 12-14 4,0-4,3 16-20 4,2-4,5 14-16 4,1-4,3
№1 24-28 4,2-4,6 28-32 4,4-4,6 24-28 4,3-4,5
№2 20-24 4,1-4,4 28-32 4,4-4,6 20-24 4,3-4,5
№3 24-28 4,2-4,6 28-32 4,4-4,6 24-28 4,3-3,5
№4 - 5,7-5,9 - 5,9-6,3 - 5,8-6,1
Примечание. -* - без образования сгустка
i в мире науки |
изучали методом световой микроскопии препаратов, окрашенных по методу Грама, используя микроскоп Nicon Eclipse E2000 (Nicon Corporation, Япония), и электронной микроскопии препаратов, фиксированных 4%-ным глутаральдегидом, с помощью микроскопа JEM-100CX-II.
При изучении влияния режима охлаждения на жизнеспособность бифидобактерий минимальное количество жизнеспособных клеток в образцах независимо от штамма регистрировалось после замораживания с быстрым охлаждением путем непосредственного погружения в жидкий азот (табл.1). С уменьшением скорости охлаждения выживаемость бифидобактерий увеличивалась, достигая максимума при медленном замораживании со скоростью 1 0С/мин. Следует отметить, что при всех исследуемых режимах охлаждения выживаемость B. adolescentis БИМ В-87 и B. longum В379М после замораживания была существенно выше по сравнению с B. bifidum 791. При сравнении показателей накопления биомассы и активной кислотности (рН), полученных через 24 часа культивирования в среде МРС-Б, достоверных раз-
личий между культурами, замороженными с использованием как медленного, так и быстрого режима охлаждения, и интактными культурами выявлено не было (табл. 2). При внесении в качестве инокулята интактных клеток бифидобактерий (5 об%) сквашивание стерильного обезжиренного молока происходило через 12-20 часов культивирования в зависимости от штамма (табл. 3). При инокуляции клеток, замороженных с использованием медленного режима охлаждения, отмечалось увеличение продолжительности сквашивания молока и повышение значения рН. Замороженные с применением быстрого охлаждения культуры бифидобактерий медленно развивались в молоке, так как регистрировалось снижение активной кислотности с рН 6,8 до рН 5,7-6,2 (в зависимости от штамма), однако образования сгустка не происходило. Замедление развития бифидобактерий в молоке носило обратимый характер. При инокуляции криоконсервированных клеток бифидобактерий, предварительно выращенных в среде МРС-Б, показатели продолжительности сквашивания молока, титра клеток и рН на момент образования сгустка
Таблица 4. Жизнеспособность бифидобактерий после криоконсервации в разных защитных средах
Защитная Скорость Титр жизнеспособных клеток, КОЕ/мл
среда охлаждения в. adolescentis БИМ Е 7 -8 B. bifidum 791 B. longum B379M
контроль 2,3±1,7х108 2,6±1,5х108 2,2±1,6х108
ФР 10 С/мин. 7,6±1,9х107 9,3±2,1х106 6,1±1,6х107
400 0С/мин. 2,1±1,3х107 2,3±1,1х106 8,7±1,4х106
контроль 2,4±1,6х108 2,6±1,3х108 2,9±1,7х108
ПВ 1 0С/мин. 9,2±1,7х107 6,3±1,3х107 8,7±1,6х107
400 0С/мин. 4,2±1,4х107 1,3±1,1х106 2,3±1,5х107
контроль 2,2±1,5х108 2,4±1,3х108 2,2±1,7х108
МРС-Б 1 0С/мин. 2,0±1,3х108 1,4±1,2х108 1,8±1,3х108
400 0С/мин. 2,1±1,1х108 9,3±1,6х107 1,2±1,0х108
Таблица 5. Развитие бифидобактерий в молоке после криоконсервации в разных защитных средах
Защитная среда / скорость B. adolescentis БИМ В-87 B. bifidum 791 B. longum B379M
Время, Кислотность, Время, Кислотность, Время, Кислотность,
ч рН ч рН ч рН
контроль 12-14 4,0-4,3 18-20 4,2-4,5 14-16 4,1-4,3
rîiD 1 0С/мин. 20-24 4,1-4,4 28-32 4,4-4,6 24-28 4,3-4,5
ФР 400 0С/мин. - 5,7-5,9 - 5,9-6,3 - 5,8-6,1
по 1 0С/мин. 18-20 4,1-4,4 24-28 4,3-4,6 20-24 4,1-4,4
ПВ 400 0С/мин. 20-24 4,1-4,4 28-32 4,4-4,6 24-28 4,2-4,5
1 0С/мин. 12-14 4,0-4,3 18-20 4,2-4,5 14-16 4,1-4,4
МРС-Б 400 0С/мин. 12-14 4,1-4,3 18-20 4,2-4,5 14-16 4,1-4,4
Примечание. -* - без образования сгустка
не отличались от величин, характерных для интактных культур. Обобщение полученных данных позволило сделать вывод, что оптимальным режимом замораживания для всех исследуемых культур бифидобактерий оказалось медленное охлаждение со скоростью 1 0С, наиболее повреждающим -быстрое охлаждение путем непосредственного погружения в жидкий азот.
Изучение жизнеспособности бифидобактерий после криоконсервации в разных защитных средах проводили с помощью двух режимов охлаждения: медленного - со скоростью 1 0С/мин. и быстрого - путем непосредственного погружения в жидкий азот. В качестве защитных сред были испытаны физиологический раствор, пептонная вода и среда МРС-Б, традиционно используемая для культивирования бактерий рода Bifidobacterium. После замораживания с быстрым охлаждением отмечалось снижение титра жизнеспособных клеток, суспендированных в ФР и ПВ, а титр клеток, суспендированных в среде МРС-Б, существенно не изменялся (табл. 4). Следует отметить, что выживаемость бифидобактерий, замороженных в ФР, была ниже по сравнению с клетками, замороженными в ПВ. При медленном замораживании со скоростью 1 0С/мин. выживаемость бифидобактерий в меньшей степени зависела от защитной среды. Количество жизнеспособных клеток, криоконсервированных в среде МРС-Б и ПВ, значимо не изменялось, а замороженных в ФР - незначительно снижалось. При инокуляции обезжиренного молока клетками бифидобактерий, замороженными в ФР и ПВ, отмечалось снижение активности кислотообразования и увеличение продолжительности сквашивания молока (табл.5). При внесении в качестве инокулята клеток, замороженных в среде МРС-Б, замедления развития бифидобактерий в молоке не наблюдалось. Культивирование бифидобактерий в среде МРС-Б с неоптимальным значением кислотности (рН 5,0) приводило к снижению активности развития клеток, замороженных в ФР и ПВ (рис. 1). Пролиферативная и кислотообразующая активность клеток, криоконсервированных в среде МРС-Б, не отличались от величин, характерных для интактных культур. Таким образом, наиболее эффективной защитной средой для бифидобактерий являлась среда МРС-Б, которая обеспечивала сохранение исходной жизнеспособности и физиологической активности культур, неза-
1,6 1,4
1,2
0,8 0,6
0,4 0,2
ФР
а)
ПВ
Среда суспендирования
МРС-Б
1,6 1,4
1,2
0,8 0,6
0,4 0,2
ФР
б)
ПВ
Среда суспендирования
МРС-Б
1,6 1,4
1,2
0,8 0,6
0,4 0,2
ФР
в)
ПВ
Среда суспендирования
МРС-Б
Рис. 1. Показатели накопления биомассы бифидобактерий через 24 ч выращивания в среде МРС-Б, рН 5,0 а - В. adolescentis БИМ В-87, б - В. ЫАа™ 791, в - В. 1опдит В379М 1-й столбец - контроль, 2-й столбец - 1 0С/мин., 3-й столбец - 400 0С/мин.
2
0
2
0
2
0
Рис. 2. Морфология Bifidobacterium adolescent's БИМ В-87 (электронная микроскопия, 1x8000-10000): а, в, д - интактные клетки, б, г, е - клетки, замороженные в ФР при быстром охлаждении
висимо от скорости охлаждения. Защитное действие пептонной воды проявлялось при замораживании с медленной скоростью охлаждения, и в значительно меньшей степени - при быстром охлаждении.
Изучение морфологических свойств бифидобактерий на светооптическом и электронно-микроскопическом уровне показало, что после криоконсервации морфология данных микроорганизмов существенных изменений не претерпевала. Бифидобак-терии представляли собой грамположи-тельные неспорообразующие неподвижные прямые или слегка изогнутые палочки с булавовидными утолщениями на концах, расположенные в мазке одиночно, V- или Y-образно, иногда в скоплениях (рис. 2). Размеры клеток бифидобактерий после замораживания существенно не изменились. При высеве последовательных разведений в полужидкую среду ТГ бифидобактерии образовывали характерные белые колонии диаметром 1-3 мм в форме гвоздиков, гречишных зерен или комет. Следовательно, криоконсервация обеспечивала сохранность основных морфологических характеристик бактерий рода Bifidobacterium.
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что большинство повреждений микроорганизмов при криоконсервации возникает на этапе замораживания. Согласно современным представлениям, объясняющим повреждения биологических объектов при замораживании, существуют два основных повреждающих фактора: повышение концентрации внеклеточных растворов и, как следствие, постепенное обезвоживание клеток при медленной скорости охлаждения и внутриклеточное образование кристаллов льда при быстром охлаждении [4, 5, 9-11]. Для каждого типа клеток микроорганизмов существует оптимальная скорость охлаждения, при которой сумма повреждений, вызываемых повышением концентрации внеклеточных электролитов и образованием внутриклеточных кристаллов льда, будет минимальна [12]. Оптимальная скорость замораживания зависит от проницаемости клеточной мембраны для воды, размеров клетки, строения клеточной стенки, природы внутри- и внеклеточных растворов [4, 11]. Согласно полученным данным, для всех исследуемых культур бифидобактерий оптимальным оказалось
1 в мире науки 1
медленное охлаждение со скоростью 1 0С/ мин., при котором реализуется постепенное изменение концентрации солей и рН среды. Увеличение выживаемости бифидобактерий при замораживании с медленным охлаждением, видимо, обусловлено особенностями морфологии, ультраструктурной организации и физико-химических свойств клеточных мембран данных микроорганизмов, в частности, их низкой проницаемостью для молекул воды и невысокой скоростью активного и пассивного транспорта ионов. Вероятно, при постепенном обезвоживании клеток в гипертонических растворах постепенно нарастающих концентраций достигается оптимальная скорость диффузии ионов через мембраны, при которой не происходят грубые нарушения их целостности благодаря плавному изменению объема клеток.
Полученные данные свидетельствуют о высокой устойчивости бактерий рода Bifidobacterium к повреждающим факторам, действующим на этапах замораживания. Высокая криоустойчивость бифидобактерий, по крайней мере частично, обусловлена морфофункциональными особенностями данных микроорганизмов, в частности наличием пептидогликана и высоким содержанием фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот в составе клеточных мембран [13]. Согласно имеющимся данным, высокое содержание фосфолипидов, а также сдвиг соотношения между насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами в сторону ненасыщенных, повышает криорезистент-ность бактерий [14, 15]. Наличие индивидуальной устойчивости бифидобактерий к замораживанию, вероятно, связано с морфофункциональными особенностями штаммов, в частности, фосфолипидным составом мембран, который значительно варьирует и является классифицирующим признаком в родовой и видовой диагностике Bifidobacterium [13]. Более высокая криоре-зистентность B. adolescentis БИМ В-87 и B. longum В379М по сравнению с B. bifidum 791 обусловлена также наличием у клеток этих микроорганизмов полисахаридной капсулы [16], выполняющей дополнительную защитную функцию.
Большое внимание при криоконсервации микроорганизмов уделяется подбору эффективных защитных сред. Изучение жизнеспособности бифидобактерий после криоконсервации выявило хорошее протекторное действие среды МРС-Б,
обеспечивающей сохранность исходной жизнеспособности и физиологической активности культур независимо от скорости охлаждения. Криозащитный эффект среды МРС-Б, вероятно, обусловлен протекторными свойствами отдельных компонентов (пептон, глюкоза, агар-агар, твин-80), входящих в ее состав, однако в полной мере объяснить механизм наблюдаемого защитного действия сложно.
При изучении физиологической активности криоконсервированных бифидобактерий наблюдалось некоторое несоответствие между сохранностью исходной жизнеспособности и снижением активности развития в молоке и питательной среде с неоптимальным значением рН. Однако отмеченные изменения свойств носили обратимый характер. Можно предположить, что у части клеток бифидобактерий в процессе замораживания развивались нелетальные повреждения, приводящие к обратимым изменениям свойств. Увеличение чувствительности бифидобактерий к неоптимальной кислотности среды, вероятно, было обусловлено нарушением избирательной проницаемости клеточных мембран при замораживании, в результате чего ионы водорода легче проникали в цитоплазму и оказывали токсическое действие. Снижение активности развития в молоке, видимо, было связано со снижением активности ферментов, участвующих в протеолизе белков молока. При помещении клеток бифидобактерий после отогрева в оптимальные условия нелетальные повреждения восстанавливались, а наблюдаемое удлинение лаг-фазы и снижение скорости роста криоконсервированных культур на начальных этапах развития популяции, скорее всего, было обусловлено активным протеканием в клетках процессов репарации.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что оптимальным режимом замораживания бифидобактерий является медленное охлаждение со скоростью 1 0С/ мин., эффективной защитной средой - среда МРС-Б, обеспечивающая сохранность исходной жизнеспособности и физиологической активности культур независимо от скорости охлаждения. Полученные результаты имеют практическое значение и могут применяться для хранения производственных и коллекционных штаммов рода Bifidobacterium, а также оптимизации биотехнологических процессов с использованием данных микроорганизмов.
Работа выполнена при финансовой поддержке БРФФИ и УРФФИ, грант № Б07К-024.
Дата поступления статьи: 14.02.2011 г.
Литература
1. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М., 1975.
2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Т. 3: Пробиотики и функциональное питание. - М., 2001.
3. Getting better with bifidobacteria / S.C. Leahy [et al.] // J. Appl. Microbiol. V. 98, 2005. P. 1303-1315.
4. Т.М. Сидякина. Консервация микроорганизмов. - Пущино, 1985.
5. Криобиология и биотехнология / Под ред. А.А. Цуцаевой. - Киев, 1987.
6. Опыт многолетнего хранения промышленных штаммов микроорганизмов и высших грибов в жидком азоте / А.Е. Ананьина [и др.] // Проблемы криобиологии. №3, 2005. С.290-291.
7. A medium for the cultivation of lactobacilli / J.C. deMan [et al.] // J. Appl. Bacteriol. V. 23, 1960. P. 130-135.
8. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. - Пущино, 1990.
9. Актуальные проблемы криобиологии / Под ред. Н.С. Пушкаря, А.М. Белоуса.- Киев, 1981.
10. Farrant J. General observations on cell preservation // Low temperature preservation in medicine and biology / eds. M.J. Ashwood-Smith, J. Farrant. - Pitman Medical Limited, Kent, England, 1980.
11. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates / F. Dumont [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. V. 70, 2004. P. 268-272.
12. Mazur P. Physical and chemical basis of injury in single-celled microorganisms subjected to freezing and thawing // Cryobiology / ed. H.T. Meryman. - New-York, 1966.
13. Veerkamp J.H. Fatty acid composition of Bifidobacterium and Lactobacillus strains // J. Bacteriol. V. 108, 1971. P. 861-867.
14. Relationship of cellular fatty acid composition to survival of Lactobacillus bulgaricus in liquid nitrogen / R.B. Smittle [et al.] // J. Appl. Microbiol. V. 27, 1974. P. 738-743.
15. Influence of growth temperature on cryotolerance and lipid composition of Lactobacillus acidophilus / M.L. Fernandez Murga [et al.] // J. Appl. Microbiol. V. 88, 2000. P. 342-348.
16. Характеристика полисахаридов, секретируемых Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ / Г.И. Новик [и др.] // Микробиология. №2, 2002. С.205-210.
Summary
The effect of freezing rate and protective media on viability of bifidobacteria after cryopreservation was studied. Slow cooling kinetics (10C/min) proved to be optimal for cryopreservation of bifidobacteria, providing high survival ability and physiological activity of preserved cultures. The survival of bifidobacteria during freezing was shown to be dependent on the protective medium. Medium MRS-B appeared to be the best cryoprotective medium, providing high viability, morphological and functional stability of bifidobacteria after freezing irrespective of cooling rate. Pepton water appeared to have good cryoprotective properties during cryopreservation with slow cooling speed, and was less effective at rapid cooling. Bifidobacteria proved to be cryoresistant microorganisms due to some structural characteristics of their cells, and the degree of their resistant to freezing depends on individual strain.
