CC BY
7
DOI: 10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60
C«D]
о
4f
Жидкостная биопсия колоректального рака: новый подход к оценке аберрантного метилирования гена SEPT9
о о;
о
И.В. Ботезату, В.Н. Кондратова, А.М. Строганова, С.Л. Дранко, A^. Лихтенштейн
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 О
>-ч
Контакты: Анатолий Владимирович Лихтенштейн alicht@mail.ru
О
Введение. Гиперметилированные CpG-островки в промоторах генов-супрессоров (в частности, SEPT9) - клинически ^с значимые опухолевые маркеры, широко используемые в жидкостной биопсии. Для количественной оценки es гиперметилированных ДНК обычно используют полимеразную цепную реакцию в реальном времени с метилспеци-
фическими праймерами. Этот метод требует нормализации данных, зависит от степени вариабельности числа копий \
генов-калибраторов и весьма трудоемок. S Цель исследования - разработка альтернативного метода оценки аберрантного метилирования посредством ^
количественного анализа плавления ДНК (qDMA, quantitative DNA melting analysis). О Материалы и методы. Образцы ДНК, выделенные из плазмы крови здоровых доноров и больных колоректальным о раком, анализировали методом qDMA, включающим: 1) асимметричную полимеразную цепную реакцию с метил- ^ независимыми индивидуально подобранными праймерами к гену SEPT9; 2) использование зонда TaqMan, гибриди- о зующегося с 2 CpG-динуклеотидами ампликона; 3) постамплификационное плавление гибридов зонд/ампликон;
4) количественный анализ плавления ДНК. ^ Результаты. Метод испытан на гене SEPT9 (применялся в жидкостной биопсии колоректального рака). Различия в степени метилирования SEPT9 между группами здоровых (n = 41) и больных (n = 39) людей статистически значимы
ie
Uj
о
(p <0,0001). Определена диагностическая эффективность qDMA: AUC ROC (area under curve - площадь под ROC-кривой) - 0,812 (после перекрестной валидизации - 0,801), чувствительность - 90 %, специфичность - 66 %. Заключение. Предлагаемый метод количественной оценки аберрантно метилированных ДНК прост, реализуется в закрытом формате, не требует нормализации и построения стандартных кривых. Предполагается возможность его 5 оптимизации посредством применения мультиплексного варианта с одновременным анализом нескольких маркеров. S
Uj
Ключевые слова: жидкостная биопсия, колоректальный рак, ген SEPT9, анализ плавления ДНК с;
Для цитирования: Ботезату И.В., Кондратова В.Н., Строганова А.М. и др. Жидкостная биопсия колоректального ^ рака: новый подход к оценке аберрантного метилирования гена SEPT9. Успехи молекулярной онкологии 2021;8(4):53-60. DOI: 10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60.
Liquid biopsy of colorectal cancer: a new approach to evaluation of aberrant methylation of the SEPT9 gene
I.V. Botezatu, V.N. Kondratova, A.M. Stroganova, S.L. Dranko, A.V. Lichtenstein
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Contacts: Anatoly Vladimirovitch Lichtenstein alicht@mail.ru
Introduction. Hypermethylated CpG islands in the promoters of suppressor genes (in particular, SEPT9) are clinically significant markers of malignant growth that are widely used in liquid biopsy. Real-time polymerase chain reaction with methylation-specific primers is commonly used to quantify hypermethylated DNA. The method requires data normalization, depends on copy number variability of the calibrator genes, and is rather laborious. The study subject is to develop an alternative qDMA method (quantitative DNA Melting Analysis). Materials and methods. DNA samples isolated from blood plasma of healthy donors and colorectal cancer patients were analyzed by the method including: 1) asymmetric polymerase chain reaction with methylation-independent
О
УЗ
о ^
о
о ^
о о;
о
Uj
о
«•ч
S3 §
Q
£
О ^
О
äc *
о
о *
о. §
äe
Uj
о
^
is 1=
individually selected primers for the SEPT9 gene; 2) using the TaqMan probe hybridizing to two CpG dinucleotides in the amplicon; 3) post-amplification melting of probe/amplicon hybrids; 4) quantitative analysis of DNA melting. Results. The method was tested on the SEPT9 gene in liquid biopsy of colorectal cancer. Differences in SEPT9 methyla-tion in healthy donors (n = 41) and cancer patients (n = 39) were statistically significant (p <0.0001). Analytical sensitivity and diagnostic efficiency of qDMA were determined: AUC (area under curve) ROC- 0.812 (according to the result of 10-fold cross-validation AUC ROC - 0.801), sensitivity - 90%, specificity - 66%.
Conclusion. The proposed method for the quantitative assessment of aberrantly methylated DNA is simple, implemented in the closed-tube format, does not require normalization and usage of standard curves. The possibility of optimization through the use of a multiplex variant with simultaneous analysis of several markers is assumed.
Key words: liquid biopsy, colorectal cancer, SEPT9 gene, DNA melting analysis
For citation: Botezatu I.V., Kondratova V.N., Stroganova A.M. et al. Liquid biopsy of colorectal cancer: a new approach to evaluation of aberrant methylation of the SEPT9 gene. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2021;8(4):53-60. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2021-8-4-53-60.
ВВЕДЕНИЕ
Жидкостная биопсия основана на анализе циркулирующих в плазме крови нуклеиновых кислот (ДНК, мРНК (матричной РНК), микроРНК) и направлена на скрининг, раннюю диагностику и прогноз онкологического заболевания, выявление остаточной болезни, мониторинг эффективности терапии и эволюции опухолевых клонов [1, 2]. Одной из главных мишеней этой биопсии являются гиперметилированные СрО-остров-ки в промоторах генов-супрессоров, для выявления которых применяют, как правило, бисульфитную обработку ДНК и различные варианты анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3—6].
При использовании наиболее широко применяемой в клинической практике ПЦР в реальном времени с ме-тилспецифическими праймерами (МС-ПЦР — MS-PCR) возникает ряд проблем. Во-первых, необходимо учитывать непредсказуемую гетерогенность СрО-островков (имеется в виду разнообразие паттернов их метилирования) [7]. В связи с этим использование метилспеци-фических праймеров (т. е. праймеров, содержащих СрО-динуклеотиды) может искажать общую картину: избирательно амплифицировать лишь какую-то субпопуляцию метилированных последовательностей. Во-вторых, в дополнение к построению стандартной кривой для анализируемого гена (в данном случае SEPT9) для нормализации количественных показателей необходимо построение стандартной кривой также для гена-калибратора (обычно АСТШВ), не содержащего СрО-динук-леотиды и не подверженного изменению числа копий [8—11]. Показаны, однако, значительная вариабельность результатов при использовании одного калибратора [12] и необходимость использования нескольких из них [13], что усложняет анализ. В-третьих, принято считать, что гены-калибраторы во всех отношениях подобны исследуемому гену, но это всего лишь более или менее вероятное предположение. Степень деградации ДНК и скорость ее поступления в кровоток могут быть неодинаковыми для разных генов, что в ряде случаев приводит к различиям в числе копий и длине соответствующих фрагментов и, соответственно, к разной кинетике их амплификации. В-четвертых, для обработанной бисульфитом ДНК
известен феномен предпочтительной амплификации неметилированных последовательностей [14], который может привести к неверным результатам.
Некоторые из этих проблем могут быть устранены, во-первых, использованием метилнезависимых праймеров (т.е. праймеров, не содержащих CpG-динуклеотиды) и, во-вторых, отказом от применения ПЦР в реальном времени в пользу ПЦР с анализом результатов по конечной точке (end-point ПЦР), предполагающей анализ конечного продукта, а не кинетики его синтеза. Наиболее удобен при этом реализуемый «в закрытом формате» метод HRMA (high resolution melting analysis — анализ плавления ДНК с высоким разрешением) [15, 16]. Однако и он имеет ряд ограничений: появление неспецифических пиков плавления ДНК при использовании ин-теркалирующих красителей, сложность количественного анализа плавления длинных ампликонов, проблема предпочтительной амплификации неметилированных последовательностей.
В данной работе для оценки аберрантного метилирования ДНК применен метод qDMA, разработанный нами ранее для выявления генных мутаций [17, 18]. Испытание qDMA проводили на гене SEPT9 как маркере, наиболее востребованном в жидкостной биопсии разных форм рака [19, 20].
Цель исследования — разработка альтернативного метода оценки аберрантного метилирования посредством количественного анализа плавления ДНК (qDMA, quantitative DNA melting analysis).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клинические образцы. В исследование включены случайно отобранные 39 пациентов с колоректальным раком, проходивших лечение в клинике Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России, и 41 здоровый донор. Клинические характеристики больных представлены в табл. 1.
Выделение ДНК проводили методом фенол-хлороформной депротеинизации [17].
Бисульфитная конверсия ДНК. К ДНК, выделенной из 1 мл плазмы крови, прибавляли 300 нг ДНК спермы
Таблица 1. Клинические характеристики пациентов с колоректаль-ным раком
Table 1. Clinical characteristics of patients with colorectal cancer
Показатель Число пациентов, абс. (n = 39)
Number of patients, abs. (n = 39)
Пол:
Gender:
мужской 16
male
женский 23
female
Возраст:
Age:
медиана 58
median
интервал 31-84
range
Стадия
Stage 1
Tis
Т3 23
Т4 13
Tx 2
Локализация:
Localization:
слепая кишка 1
caecum
ободочная кишка 24
colon
прямая кишка 14
rectum
лосося во избежание потерь из-за неспецифической сорбции, что повышало выход конвертированной ДНК (каждый опыт включал соответствующий контроль). Бисуль-фитную обработку ДНК проводили с использованием DNA Methylation-Gold Kit TM (Cat. № D5005, Zymo Research, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. ДНК элюировали 20 мкл буфера для элюции и хранили при 20 °C. В реакцию (объем — 25 мкл) вносили 3 мкл конвертированной ДНК.
Асимметричная ПЦР и количественный анализ плавления ДНК. Последовательность ампликона 5 гена SEPT9 (GenBank Accession number NC_000017) [21] амплифи-цировали в 2 параллелях посредством асимметричной ПЦР с зондом TaqMan. Праймеры и зонд подбирали с помощью программ Integrative Genomics Viewer (v. 2.8.2), Vector NTI Advance 10 (Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния, США), SnapGene Viewer 5.3.2 (GSL Biotech LLC, Сан-Диего, США) и MeltCalc [22]. Последовательности праймеров и зонда TaqMan представлены в табл. 2, а их взаимное расположение — на рис. 1. Зонд SEPT9-R (27 оснований) взаимодействует с 2 CpG-динуклео-тидами (chr17: 75369601-75369604, human hg19) - индикаторами метилирования SEPT9.
Асимметричную ПЦР вели в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Инкубационная смесь (25 мкл) содержала: 50 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 50 мМ KCl; 4 мМ MgCl2; 0,25 мМ каждого дНТФ; 0,2 мкМ зонда SEPT9-R; 0,08 мкМ праймера SEPT9-sense и 0,4 мкМ праймера SEPT9-antisense; 2,5 ед Hot-rescue
о
УЗ
о ^
о
о ^
о о;
о
Uj
о
>-ч §
Q
S
£
о ^
о
ic
о
0 *
о.
1
ic
Uj
«s;
о §
CG
CG
SEPT9-sense _\
CG
CG
CG
SEPT9-R _\
CG
CG
SEPT9-antisense
86 bp
Рис. 1. Схема расположения праймеров, зонда SEPT9-R (с флуорофором ROX) и CpG-динуклеотидов (отмечены зелеными штрихами) в амплико-не SEPT9
Fig. 1. Schematic presentation of primers, SEPT9-R TaqMan probe (with ROX fluorophore) and CpG dinucleotides (marked with green strokes) in the SEPT9 amplicon
Таблица 2. Последовательности праймеров и зонда TaqMan для ампликона SEPT9 Table 2. Sequences ofprimers and the TaqMan probe for the SEPT9 amplicon
Праймеры, зонд Primers, probe Последовательности
SEPT9-sense 5'-GTTGTTTATTAGTTATTATGTAGGATTT*
SEPT9 -antisense 5'-AACCCAACACCCACC
SEPT9-R 5'-ROX-TTAATGTGTAGTTGGATGGGATTATTT-BHQ2**
*Неспаренное основание A в праймере выделено подчеркиванием.**Основания Т в зонде SEPT9-R, возникающие в результате бисульфитной конверсии неметилированных CpG-динуклеотидов, выделены жирным шрифтом.
*Mismatched base A in the primer is underlined.**The T bases in the SEPT9-R probe resultingfrom bisulfite conversion ofunmethylated CpG dinucleotides are shown in bold.
О
УЗ
о ^
о
о ^
о о;
о
LU ^
О
«•ч
S3 §
Q
S
£
О ^
О
ic о
о *
о. §
ie
LU
«s;
о
^
s
is 1=
Taq polymerase («Синтол», Москва); 3 мкл раствора ДНК. Условия ПЦР: начальная денатурация — 5 мин при 95 °С; 55 циклов по 13 с при 95 °С, 40 с при 58 °С, 30 с при 72 °C (с регистрацией флуоресценции).
Дуплексы зонд/ампликон плавили по завершении ПЦР: денатурация — 1 мин при 95 °С, ренатурация — 2 мин при 52 °С, плавление — от 35 до 75 °C (инкремент— 0,4 °C, выдержка — 6 с, скорость нагревания — 3,3 °С/с).
Количественный анализ плавления ДНК с использованием программы PeakFit (v. 4.12.00; SeaSolve Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США) проводили, как описано ранее [17, 18]. Для измерения площадей под гауссовыми пиками плавления после вычитания фона использовали итеративную процедуру аппроксимации кривой методом наименьших квадратов (рис. 2).
а Пик плавления / Melt peak
500 400 || 300 13 £ 200 "О 100 0
55 60 65 70 75 80 85 Температура, оС / Temperature, 0C
Рис. 2. Количественный анализ плавления ДНК: а — показания модуля плавления CFX96; б — компьютерная обработка (надрисунком — статистические показатели аппроксимации кривой). Обработка сигнала включает удаление фона, разделение перекрывающихся пиков, определение площадей под гауссовыми пиками. SE — стандартная ошибка; R2 — коэффициент детерминации
Fig. 2. Quantitative DNA melting analysis: a — readings of the CFX96 melting module; б — computer processing (above the figure — statistical indicators of curve approximation). Signal processing includes background removal, separation of overlapping peaks, determination of areas under Gaussian peaks. SE — standard error; R2 — coefficient of determination
Статистический анализ. Статистический анализ проведен с помощью GraphPad Prism 9.2.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США) и онлайн-сервера CombiROC [23]. Для сравнения уровня метилирования SEPT9 в ДНК плазмы крови здоровых доноров и больных колоректальным раком использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Линейный регрессионный анализ проводили для оценки чувствительности qDMA, логистический регрессионный анализ — для построения ROC-кривых и определения AUC (area under curve — площади под ROC-кривой). Десятикратная перекрестная валидизация (10-fold cross-validation) была предпринята для исключения эффекта over-fitting и определения диагностической эффективности qDMA [23]. Все статистические тесты были двусторонними, статистически значимой принята величинаp <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для количественной оценки аберрантного метилирования в метод qDMA введен ряд модификаций, в частности: 1) дизайн максимально коротких ампли-конов; 2) асимметричная ПЦР с «ручным» подбором метилнезависимых праймеров; 3) расположение зонда TaqMan над 2 CpG-динуклеотидами — «индикаторами» степени метилирования SEPT9 (см. рис. 1); 4) замена в зонде оснований С на Т; 5) количественный анализ пиков плавления, соответствующих метилированным и неметилированным аллелям SEPT9 в исходном образце ДНК.
Указанные модификации основаны на следующих соображениях. ДНК плазмы крови фрагментирована, в силу чего амплификация происходит тем эффективнее, чем короче ампликон. Выбор метилнезависимых праймеров обусловлен необходимостью вовлечения в анализ всех (а не выборочных) аллелей SEPT9. Известные программы подбора праймеров и зондов, как правило, не справляются с этой задачей, что делает неизбежным «ручной» дизайн (имеются в виду «подгонка» величин Tm, контроль некомплементарности 3'-концов, отсутствия палиндромов, неспецифической амплификации, гашения флуоресценции и т.п.). Когда в процессе «подгонки» избежать присутствия CpG-динуклеотида в прай-мере не удавалось, основание С заменяли в нем не-спаренным основанием А, «не различающим», судя по термодинамическим показателям, метилированные и неметилированные CpG-динуклеотиды. Что касается замены оснований С на Т в зонде TaqMan, то они имели целью сделать его последовательность комплементарной неметилированным аллелям. Это должно было снизить эффект предпочтительного синтеза неметили-рованных аллелей [14, 24, 25].
Зонды TaqMan, изначально предложенные для ПЦР в реальном времени [26], нашли применение также в по-стамплификационном плавлении ДНК [27]. Оно становится возможным при условии проведения асимметричной ПЦР, когда оказавшаяся в избытке нить ампликона может взаимодействовать с зондом. Образующийся
Рис. 3. Определение аналитической чувствительности qDMA посредством серийных разведений метилированной ДНК (конечная концентрация 100, 50, 25, 12,5 и 0 % — 6 повторов) в неметилированной ДНК: а — пики плавления неметилированной и метилированной ДНК (указаны символами o и • соответственно); б — линейная регрессия фактической и измеренной концентраций метилированной ДНК. Планки погрешностей — средние с 95 % доверительным интервалом. R2 — коэффициент детерминации
Fig. 3. Determination of the analytical sensitivity of qDMA by serial dilutions of methylated DNA (final concentration 100, 50, 25, 12.5 and 0 % — 6 repeats) in unmethylated DNA: a — melt peaks of unmethylated and methylated DNA (indicated by symbols o and', respectively); б — linear regression of the actual and measured concentrations of methylated DNA. Error bars are means with 95 % confidence intervals. R2 — coefficient of determination
короткий гибрид крайне чувствителен к неспаренным основаниям и претерпевает при плавлении сильно выраженный температурный сдвиг, не требующий для визуализации и количественной оценки использования технологии HRMA [24, 27, 28].
Аналитическая чувствительность qDMA. Диагностический метод характеризуют 3 показателя: LoB (Limit of Blank) — предел негативного контроля, LoD (Limit of Detection) — предел обнаружения, LoQ (Limit of Quantitation) — предел количественного измерения [29].
LoB — наибольший ложноположительный результат, регистрируемый при повторных измерениях негативного (не содержащего исследуемое вещество) контроля. В 20 образцах неметилированной ДНК с помощью qDMA определяли процентное содержание метилированной ДНК. Показатели суммировали, находили среднее и стандартное отклонение (ББ). Величина LoB, определяемая по формуле LoB = среднее + 1,645 х ББ, составила 6,5 %.
LoD — минимальная концентрация анализируемого вещества, которую можно надежно отличить от ЬоВ. Величина LoD, определенная аналогично LoB, но по иной формуле (ЬоБ = среднее + 3 х ББ), составила 8,7 %.
о
УЗ
сз ^
сз
о ^
сз о;
о
Uj
сз
>-ч
Й §
Q
£
сз ^
сз
se *
сз
сз *
о.
I
se
Uj
сз g
Рис. 4. Профили плавления SEPT9: а — здоровые доноры (15 образцов), б — больные колоректальнымраком (15 образцов). Пики плавления неметилированной и метилированной ДНК указаны символами o и • соответственно
Fig. 4. Patterns of SEPT9 melting: a — healthy donors (15 samples); б — colorectal cancer patients (15 samples). Melt peaks of unmethylated and methylated DNA are indicated by symbols o and •, respectively
О
УЗ
о ^
о
о ^
о о;
о
LU ^
О
«•ч
S3 §
Q
S
£
О ^
О
ic о
о *
о. §
ie
LU
«s;
о
^
s
is 1=
Рис. 5. Сравнение степени метилирования SEPT9 в циркулирующей ДНК плазмы крови здоровых доноров и больных колоректальным раком (непараметрический критерий Манна—Уитни). Планки погрешностей — средние с 95 % доверительным интервалом Fig. 5. Comparison of SEPT9 methylation in circulating DNA from healthy donors and colorectal cancer patients (nonparametric Mann—Whitney test). The bars indicate the mean with 95 % confidence interval
LoQ — минимальная концентрация, при которой анализируемое вещество может быть не только обнаружено, но и количественно измерено. Для определения величины LoQ серийные разведения метилированной ДНК в неметилированной ДНК (по 6 параллелей каждого образца с конечной концентрацией метилированной ДНК — 100, 50, 25, 12,5 и 0 %) анализировали методом qDMA (рис. 3а). Регрессионный анализ выявляет хорошую корреляцию между реальным содержанием метилированной ДНК в исследованных образцах и результатами количественных измерений пиков плавления (рис. 3б). Величина LOQ составила 12 % метилированного SEPT9 как наименьшая процентная концентрация, определяемая с показателем CV (coefficient of variance) <20 % [29].
1,0
0,75
0,5
0,25
il
0
0
t
1,0
0,25 0,5 0,75
1-Специфичность / 1-Specificity
Маркер/Marker ■Jjf Оптимальный порог дискриминации 0,404 /
Optimal discrimination threshold 0,404 - Когорта исследованных лиц /Whole cohort
Итог 10-кратной перекрестной валидизации / 10-fold cross-validation
Рис. 6. Диагностическая эффективность qDMA Fig. 6. Diagnostic efficiency of qDMA
Диагностическая эффективность qDMA. Исследование проведено на когорте, включающей 41 здорового донора и 39 больных колоректальным раком. Выделенные из плазмы крови образцы ДНК обрабатывали бисульфитом, после чего подвергали асимметричной ПЦР с зондом SEPT9-R и последующим qDMA. На рис. 4 представлены профили плавления дуплексов SEPT9-R/ ампликон здоровых и больных людей (по 15 образцов тех и других), демонстрирующие явные различия в степени метилирования SEPT9. Различия статистически достоверны (рис. 5).
Пригодность qDMA гена SEPT9 для жидкостной биопсии колоректального рака оценивали посредством ROC-анализа (рис. 6). Величина AUC, определяющая эффективность диагностического теста, составила 0,812 (чувствительность — 90 %, специфичность — 66 %), что можно считать хорошим результатом, особенно учитывая первую попытку применения этого метода и использование лишь одного маркера, а не панели нескольких
Таблица 3. Количественные показатели чувствительности и специфичности qDMA Table 3. Quantitative indicators of sensitivity and specificity of qDMA
ТИп данных AUC Чувствительность,% Sensitivity,% Специфичность,% Specificity,%
Dataset type
Вся когорта Whole cohort 0,812 90,0 65,8
Десятикратная перекрестная
валидизация 0,801 90,0 65,8
10-fold cross-validation
Примечание. AUC — area under curve (площадь под кривой ROC). Note. AUC — area under curve.
маркеров. Указанные показатели сохранили свои прежние значения после процедуры 10-кратной перекрестной валидизации (cross-validation) (табл. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
В данном исследовании показана принципиальная возможность использования qDMA для оценки аберрантного метилирования клинически значимых генов. Учитывая малый размер зондируемой «мишени» (всего 2 CpG-динуклеотида), можно предположить, что, несмотря на известную гетерогенность паттернов метилирования CpG-островков [7], значительная масса CpG-динуклеотидов подвергается метилированию синхронно и координированно. Это наблюдение уравнивает шансы предлагаемого нами qDMA и общепринятого HRMA, использующего интеркалирующие красители и способного анализировать ампликон целиком (и, следовательно, десятки CpG-динуклеотидов) [5, 30-32].
Таким образом, хотя qDMA и уступает HRMA в размере анализируемой последовательности, он имеет преимущества в простоте исполнения, возможности мультиплексного анализа, специфичности и чувствительности. Последнее обусловлено дестабилизирующим эффектом неспаренных оснований, который тем сильнее, чем короче анализируемый дуплекс. Поэтому в qDMA значительно отчетливее, чем в HRMA (где часто имеет место суперпозиция плавления нескольких структурных доменов), выражены температурные
сдвиги, и они легче поддаются количественному анализу. Таким образом, метод qDMA, не требующий необходимых для HRMA оборудования и программного обеспечения, имеет ряд преимуществ: он более прост в использовании и позволяет осуществлять одновременный количественный анализ нескольких маркеров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метод асимметричной ПЦР с использованием зондов TaqMan, метилнезависимых праймеров и пост-амплификационного количественного анализа плавления ДНК ^БМА), предлагаемый для количественной оценки аберрантно метилированных ДНК, реализуется в закрытом формате, прост в исполнении, не требует нормализации и построения стандартных кривых. Предполагается возможность повышения его диагностической эффективности посредством применения мультиплексного варианта для одновременного анализа нескольких маркеров. Кроме того, увеличение анализируемой «мишени» (т. е. числа зондируемых CpG-динуклеотидов) повышает эффективность теста (здесь не представлено). Прямое сопоставление на 1 когорте испытуемых лиц разных подходов — общепринятого (ПЦР в реальном времени с метилспецифиче-скими праймерами) и оригинального (асимметричной ПЦР с метилнезависимыми праймерами, зондами TaqMan и qDMA) — является предметом дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Serrano M.J., Garrido-Navas M.C., Diaz Mochon J.J. et al. Precision prevention and cancer interception: the new challenges of liquid biopsy. Cancer Discovery 2020;10(11):1635-44. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-0466.
2. Cescon D.W., Bratman S.V., Chan S.M. et al. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer 2020;1:276-90. DOI: 10.1038/s43018-020-0043-5.
3. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res 1997;25(12):2532-4. DOI: 10.1093/nar/25.12.2532.
4. Worm J., Aggerholm A., Guldberg P. In-tube DNA methylation profiling by fluorescence melting curve analysis. Clinical Chemistry 2001;47(7):1183-9.
5. Tse M.Y., Ashbury J.E., Zwingerman N.
et al. A refined, rapid and reproducible high resolution melt (HRM)-based method suitable for quantification of global LINE-1 repetitive element methylation. BMC Research Notes 2011;4:565. DOI: 10.1186/1756-0500-4-565.
6. Quillien V., Lavenu A., Karayan-Tapon L. et al. Comparative assessment of 5 methods
(methylation-specific polymerase chain reaction, MethyLight, pyrosequencing, methylation-sensitive high-resolution melting, and immunohistochemistry) to analyze O6-methylguanine-DNA-methyltranferase in a series of 100 glioblastoma patients. Cancer 2012;118(17):4201—11. DOI: 10.1002/ cncr.27392.
7. Korshunova Y., Maloney R.K., Lakey N. et al. Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA. Genome Res 2008;18(1):19—29. DOI: 10.1101/ gr.6883307.
8. Sepulveda A.R., Jones D., Ogino S. et al. CpG methylation analysis-current status of clinical assays and potential applications in molecular diagnostics: a report
of the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn 2009;11(4):266-78. DOI: 10.2353/jmoldx.2009.080125.
9. Egger G., Wielscher M., Pulverer W. et al. DNA methylation testing and marker validation using PCR: diagnostic applications. Expert Rev Mol Diagn
2012;12(1):75—92. DOI: 10.1586/ erm.11.90.
10. Dietrich D., Jung M., Puetzer S. et al. Diagnostic and prognostic value of SHOX2 and SEPT9 DNA methylation and cytology in benign, paramalignant and malignant pleural effusions. PLoS ONE 2013;8(12):e84225. DOI: 10.1371/journal. pone.0084225.
11. De Vos L., Gevensleben H., Schrock A. et al. Comparison of quantification algorithms for circulating cell-free DNA methylation biomarkers in blood plasma from cancer patients. Clin Epigenetics 2017;9(1):125. DOI: 10.1186/s13148-017-0425-4.
12. Pharo H.D., Honne H., Vedeld H.M. et al. Experimental factors affecting the robustness of DNA methylation analysis. Sci Rep 2016;6:33936. DOI: 10.1038/ srep33936.
13. Pharo H.D., Andresen K., Berg K.C.G. et al. A robust internal control for high-precision DNA methylation analyses by droplet digital PCR. Clin Epigenetics 2018;10:24. DOI: 10.1186/s13148-018-0456-5.
14. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R. et al. Detection and measurement of PCR
О
УЗ
сз ^
сз
о ^
сз о;
о
Uj
сз
>-ч §
Q
S
£
сз ^
сз ie ï сз
сз *
о. §
ie
Uj
сз
s g
О
УЗ
о ^
о
о ^
о о;
о
LU ^
О
«•ч
S3 §
Q
S
£
О ^
О
ic о
о *
о. §
ie
LU
«s;
о
^
s
is 1=
bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Res 1997;25(21):4422-6. DOI: 10.1093/ nar/25.21.4422.
15. Wojdacz T.K., Hansen L.L., Dobrovic A. A new approach to primer design
for the control of PCR bias in methylation studies. BMC Res Notes 2008;1:54. DOI: 10.1186/1756-0500-1-54.
16. Wojdacz T.K., Borgbo T., Hansen L.L. Primer design versus PCR bias in methylation independent PCR amplifications. Epigenetics 2009;4(4):231-4. DOI: 10.4161/epi.9020.
17. Botezatu I.V., Kondratova V.N., Shelepov V.P. et al. Asymmetric mutant-enriched polymerase chain reaction and quantitative DNA melting analysis of KRAS mutation in colorectal cancer. Anal Biochem 2020;590:1-9.
DOI: 10.1016/j.ab.2019.113517.
18. Kondratova V.N., Botezatu I.V., Shelepov V.P. et al. SLAM-MS: mutation scanning of stem-loop amplicons
with TaqMan probes by quantitative DNA melting analysis. Sci Rep 2020;10:5476. DOI: 10.1038/s41598-020-62173-x.
19. Лазаревич Н.Л., Абрамов П.М., Федорова М.Д. и др. Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепа-тоцеллюлярной карциномы. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(4):26-37. [Lazarevich N.L., Abramov P.M., Fedorova M.D. et al. Identification
of a new methylation site in the Sept9 promoter region for the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2019;6:26-37.
(In Russ.)]. DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-4-26-37.
20. Sui J., Wu X., Wang C. et al. Discovery and validation of methylation signatures in blood-based circulating tumor cell-free DNA in early detection of colorectal carcinoma: a case-control study. Clin Epigenetics 2021;13:26. DOI: 10.1186/ s13148-020-00985-4.
21. Wasserkort R., Kalmar A., Valcz G. et al. Aberrant septin 9 DNA methylation
in colorectal cancer is restricted to a single CpG island. BMC Cancer 2013;13:398. DOI: 10.1186/1471-2407-13-398.
22. Schutz E., von Ahsen N. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques 1999;27(6):1218-22, 1224. DOI: 10.2144/99276bc04.
23. Mazzara S., Rossi R.L., Grifantini R. et al. CombiROC: an interactive web tool
for selecting accurate marker combinations of omics data. Sci Rep 2017;7:45477. DOI: 10.1038/srep45477.
24. Botezatu I.V., Panchuk I.O., Stroganova A.M. et al. TaqMan probes as blocking agents for enriched PCR amplification and DNA melting analysis of mutant genes. Biotechniques 2017;62(2):62-8.
DOI: 10.2144/000114515.
25. Montgomery J.L., Rejali N., Wittwer C.T. The influence of nucleotide sequence and temperature on the activity of thermostable DNA polymerases. J MolDiagn 2014;16(3):305-13. DOI: 10.1016/j. jmoldx.2014.01.006.
26. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes
Вклад авторов
И.В. Ботезату, В.Н. Кондратова: разработка дизайна, проведение экспериментов; А.М. Строганова: получение и характеристика клинических образцов; С.Л. Дранко: получение клинических образцов;
А.В. Лихтенштейн: разработка концепции исследования, написание статьи. Autrors' contributions
I.V. Botezatu, V.N. Kondratova: developing the concept design, conducting experiments; A.M. Stroganova: obtaining and characterization of clinical samples; S.L. Dranko: obtaining clinical samples;
A.V. Lichtenstein: developing the concept design, article writing.
at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 1995;4(6):357-62. DOI: 10.1101/gr.4.6.357.
27. Huang Q., Liu Z., Liao Y. et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis
for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE 2011;6(4):e19206. DOI: 10.1371/journal. pone.0019206.
28. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova CA. et al. Optimization
of melting analysis with Taqman probes for detection of KRAS, NRAS and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491:75-83. DOI: 10.1016/j.ab.2015.09.005.
29. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit
of quantitation. Clin Biochem Rev 2008;29(Suppl 1):S49-52.
30. Wojdacz T.K., Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting
(MS- HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res 2007;35(6):e41. DOI: 10.1093/nar/gkm013.
31. Malentacchi F., Forni G., Vinci S. et al. Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a differential-high resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Res 2009;37(12):e86. DOI: 10.1093/ nar/gkp383.
32. Spitzwieser M., Entfellner E., Werner B.
et al. Hypermethylation of CDKN2A exon 2 in tumor, tumor-adjacent and tumor-distant tissues from breast cancer patients. BMC Cancer 2017;17:260. DOI: 10.1186/ s12885-017-3244-2.
ORCID авторов / ORCID of authors
И.В. Ботезату / I.V. Botezatu: https://orcid.org/0000-0002-0297-4963
B.Н. Кондратова / V.N. Kondratova: https://orcid.org/0000-0003-0614-8789 А.М. Строганова / A.M. Stroganova: https://orcid.org/0000-0002-7297-5240
C.Л. Дранко / S.L. Dranko: https://orcid.org/0000-0003-3315-0817
A.B. Лихтенштейн / A.V. Lichtenstein: https://orcid.org/0000-0002-0190-5069
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Финансируется в рамках госбюджетной темы. Financing. It is funded under the state budget theme.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics. All patients gave written informed consent to participate in the study.
Статья поступила: 22.09.2021. Принята к публикации: 19.11.2021. Article submitted: 22.09.2021. Accepted for publication: 19.11.2021.
