CC BY
170
Железозависимость биологических свойств Candida albicans
Леонов В.В.1 • Миронов А.Ю.
Леонов Вадим Вячеславович -
канд. техн. наук, доцент кафедры микробиологии лечебного факультета1
Миронов Андрей Юрьевич - д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела микробиологии2
И 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, Российская Федерация. Тел.: +7 (495) 380 20 19. Е-таИ: andy.60@mail.ru
1 БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия»; 628011, г. Ханты-Мансийск, ул. Мира, 40, Российская Федерация
2 ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора; 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, Российская Федерация
Актуальность. Кандидозы возникают у имму-нокомпрометированных лиц с дефектами гуморального или клеточного звеньев иммунитета. Любые нарушения обмена железа способствуют развитию иммунодефицита и изменению инфекционной чувствительности. Возможность изменения биологических свойств грибов рода Candida при нарушениях обмена железа не обсуждалась. Цель - выяснить влияние нарушений обмена железа на модификацию биологических свойств C. albicans. Материал и методы. С помощью турбидиметрического метода изучалась кинетика роста референтного штамма (24433 АТСС) и клинических изо-лятов C. albicans в бульоне (n = 20) в зависимости от концентрации ионов Fe2+ и в сыворотке крови доноров с разным вариантом обмена железа (n = 2). Определялась экспрессия гена адгезии (als3), генов фосфолипаз С (plbl, plb2, plc), гена аспартильной протеазы (sapl) в сыворотке крови доноров с разным содержанием железа. Результаты. Активность роста всех изученных штаммов C. albicans зависит от концентрации железа в питательной среде. Расчет значений константы сродства к ионам Fe2+ (Ks) для штаммов C. albicans показал, что они изменяются от 179,5 до 1863,3 мкМ. Клинические
изоляты отличаются большей железозави-симостью (179,5 < Ks < 1000 мкМ) по сравнению с референтным штаммом 24433 АТСС (Ks = 1199,5 ± 28,3 мкМ). Оптимальная концентрация железа для роста в бульоне составляет 3050 мкМ. Сыворотка крови с нормальным обменом железа ингибирует ростовую активность C. albicans и увеличивает экспрессию всех изученных генов патогенности. Культивирование C. albicans в железодефицитной и железона-груженной сыворотках увеличивает скорость роста до 0,017 ч-1 и 0,012 ч-1 соответственно, но уменьшает экспрессию основных генов пато-генности. Заключение. Биологические свойства C. albicans изменяются в зависимости от состояния обмена железа организма хозяина. При нормальном обмене железа иммунная система подавляет развитие кандид. Избыточное накопление железа способствует возникновению кандидоза, при дефиците железа исход инфекции будет зависеть от состояния иммунного статуса организма хозяина.
Ключевые слова: Candida albicans, кандидоз, обмен железа, биопленки, кинетика роста, фос-фолипазы С, адгезия, аспартильные протеазы
doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-133-137
Грибы рода Candida входят в состав нормальной микробиоты организма человека. Для возникновения кандидозов нужны условия, при которых эти грибы начинают проявлять свои патогенные свойства. Факторы,
способствующие развитию кандидозов, разделяют на экзогенные и эндогенные. Результатом заболевания, патогенез которого обусловлен активацией факторов эндогенного происхождения, становится иммунодефицит организма хозяина
[1]. Нарушения обмена железа как в сторону избыточного его накопления, так и дефицита угнетают клеточное и гуморальное звенья иммунитета, ведя к изменению инфекционной чувствительности организма хозяина [2, 3]. Опубликовано немало работ, посвященных биологии грибов рода Candida и кандидозам [1]. Возможность изменения биологических свойств грибов рода Candida при нарушениях обмена железа не обсуждалась. Цель нашей работы - выяснить влияние нарушений обмена железа на изменение биологических свойств C. albicans.
Материал и методы
Изучены биологические свойства 20 штаммов C. albicans, выделенных из фекалий, крови, влагалища, мокроты, раневого отделяемого больных Окружной клинической больницы г. Ханты-Мансийска. В качестве референтного использовали штамм C. albicans 24433 АТСС. Для всех штаммов изучалась кинетика роста в бульоне и сыворотке крови. Определение ростовой активности грибов осуществлялось посевом в физиологическом растворе микробной взвеси, стандартизированной до 3 МсБ в бульон Сабуро с разным содержанием железа и сыворотку доноров с разными вариантами обмена железа. Посевы выращивали с помощью прибора Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific) при 37 °С, позволяющего контролировать турбидиметри-ческим методом рост микроорганизмов в автоматическом режиме (А = 540 нм). Скорость экспоненциального роста (ч-1) определяли по тангенсу угла наклона касательной к начальному участку кривой роста, построенной в полулогарифмических координатах. Для характеристики желе-зозависимости штаммов рассчитаны константы сродства С. albicans к железу - Ks (мкМ). Значения Ks позволяют судить о степени железозависимо-сти штамма [2, 4]: чем оно меньше, тем больше сродство С. albicans к железу, и наоборот.
Сыворотку крови получали общепринятыми методами. Для экспериментов по изучению кинетики роста использовали сыворотку доноров с нормальным обменом железа, железодефицитной анемией, а также избытком железа, который создавался искусственно путем добавления стерильного раствора цитрата железа. Контроль параметров обмена железа (содержание гемоглобина - Hb, ферритина, сывороточного железа - ^е2+]сыв., общая железосвязывающая способность сыворотки - ОЖСС) осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе Beckman Coulter AU480 (США) и феррозиновым способом с применением
набора IRON (ChronolabAG, Швейцария). Для подтверждения истинной железодефицитной анемии, согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, использовали следующие показатели: [Бе2+]сыв. < 10 мкМ и ОЖСС > 70 мкМ на фоне снижения уровней ферритина и Hb. Содержание ^е2+]сыв. от 10 до 25 мкМ принимали за норму, ^е2+]сыв. > 50 мкМ считали избыточным.
Изучение экспрессии генов патогенности в зависимости от концентрации сывороточного железа проводилось в сыворотке здоровых доноров, в которую добавляли цитрат железа (II) до ^е2+]сьш. > 50 мкМ (моделирование избытка) и хе-латора железа - феррозина (моделирование дефицита железа). Данный эксперимент позволил нивелировать влияние прочих условий на экспрессию генов. Для изучения экспрессии генов факторов патогенности C. albicans выбраны: ген als3 - фактор адгезии; гены фосфолипаз С plbl, plb2, plc, ген аспартильной протеазы sapl. Считается, что этим факторам принадлежит главная роль в патогенезе кандидозов разной локализации [5, 6]. В качестве гена «домашнего хозяйства» использован ген изоцитратлиазы - icl. Праймеры и наборы для обратной транскрипции произведены ЗАО Евроген (Россия). Для проведения полимеразной цепной реакции использован термоциклер CFX 96 (Bio-Rad, США). Данные проанализированы ACt-методом с применением референт-гена, который используется для относительной количественной оценки экспрессии генов [7]. Уровень экспрессии генов выражался в условных единицах. Структура праймеров и условия полимеразной цепной реакции описаны в работах [8-10].
Все исследования проведены в соответствии с принципами надлежащей клинической и лабораторной практики (Good Clinical Practice - GCP, Good Laboratory Practice - GLP), одобрены на заседании локального этического комитета БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия» (рег. номер 106 от 11.05.2016).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Office Excel 2003. Рассчитывали средние арифметические значения (М) и доверительные интервалы (5). Для расчета границ доверительного интервала использовали t-критерий при доверительной вероятности p = 0,95 и числе степеней свободы f = 2 (кинетика роста) и 4 (экспрессия генов).
Результаты и обсуждение
Для всех штаммов С. albicans зависимость удельной скорости роста от [Fe2+] в питательной среде описывалась кривой с экстремумом (рис. 1).
Рост эталонного штамма С. albicans АТСС 24433, в отличие от клинических изолятов, мало зависел от [Fe2+], скорость роста изменялась от 0,65 до 0,67 ч-1. Для штамма 273 (кровь) кривая зависимости скорости роста от концентрации железа была наиболее выражена, наименьшая скорость роста 0,62 ч-1 наблюдалась при отсутствии железа в среде, увеличение [Fe2+] до 50 мкМ вело к возрастанию скорости роста до максимального значения - 0,75 ч-1. Ингибирование роста этого штамма при [Fe2+] = 60 мкМ происходило сильнее, чем для других. Можно предположить, что штамм 273 более железозависим. Оптимальная [Fe2+] для роста всех исследованных штаммов С. albicans составляла 30-50 мкМ, увеличение концентрации до 60 мкМ вело к ингибированию роста.
Расчет значений К к ионам Fe2+ для штаммов C. albicans показал, что они изменяются от 179,5 мкМ для штамма 273 до 1863,3 мкМ для штамма 192 (влагалище). В соответствии со значениями Ks все штаммы C. albicans разделены на две группы:
• Ks < 1000 мкМ - сильно железозависимые;
• Ks > 1000 мкМ - слабо железозависимые.
Из 20 исследованных штаммов С. albicans все штаммы, выделенные от пациентов, за исключением 192, отнесены к группе сильно железозави-симых. Сравнение значений K с аналогичными показателями для бактерий (Ks = 3-211 мкМ) [4] позволяет сделать заключение, что C. albicans - микроорганизм, менее зависимый от содержания железа в среде культивирования.
Для приближения эксперимента к условиям in vivo на следующем этапе исследования изучалась кинетика роста и экспрессия специфических факторов патогенности С. albicans в сыворотках крови
50 Fe2+, мкМ
60
75
Рис. 1. Зависимость удельной скорости роста для штаммов C. albicans от [Fe2+] в питательной среде; ц - удельная скорость роста штамма, ч-1; [Fe2+] - концентрация ионов Fe2+ в питательной среде, мкМ
здоровых доноров и доноров с нарушениями обмена железа.
Рост С. albicans 24433 АТСС в сыворотке с нормальным обменом железа не наблюдался в течение всего периода культивирования (рис. 2). Скорость роста С. albicans 24433 АТСС в железодефицитной сыворотке составляла 0,017 ч-1 и была незначительно выше скорости роста в сыворотке с избыточным содержанием железа 0,012 ч-1. Несмотря на это, кривая роста кандид в железонагруженной сыворотке быстрее достигала стационарной фазы роста
Экспрессия генов патогенности C. albicans 24433 АТСС в сыворотке крови в зависимости от содержания железа
Ген [Fe2+]C„B, мкМ
0* 18,3 ± 0,01" 50,5 ± 0,01'"
als3 2,8 ± 0,2 558,1 ± 2,8 193,0 ± 3,3
plc 0,9 ± 0,3 19,6 ± 1,2 17,2 ± 2,5
plbl 0,6 ± 0,3 0,9 ± 0,6 1,9 ± 0,8
plb2 3,9 ± 0,5 649,7 ± 0,3 82,8 ± 0,2
sapl 5,1 ± 1,6 1710,2 ± 25,6 385,9 ± 54,5
Данные представлены в виде среднего арифметического значения (М) и 95% доверительного интервала (б) * сыворотка с хелатором железа ** сыворотка с нормальным содержанием железа *** сыворотка с цитратом железа (II)
0
3
9
Леонов В.В., Миронов А.Ю. Железозависимость биологических свойств Candida albicans
135
0,2 -1-1-1-1-1-
0 10 20 30 40 50
Продолжительность, ч ♦ Норма Избыток железа Дефицит железа
Рис. 2. Кривые роста С. albicans 24433 АТСС в сыворотке крови доноров с разным содержанием железа
и урожай культуры в железонагруженной сыворотке был выше, чем в сыворотке с дефицитом железа. Продолжительность лаг-фазы составляла 2,5-3 ч. Максимальная плотность популяции достигалась через 25-30 ч культивирования для С. albicans 24433 АТСС. Результаты принципиально не изменялись при использовании клинических изолятов С. albicans и замене донора крови.
Изучена экспрессия наиболее важных факторов патогенности C. albicans в сыворотке в зависимости от варианта обмена железа (таблица). В железоде-фицитных условиях значения экспрессии факторов патогенности C. albicans очень низки. Таким образом, экспрессия этих генов в железодефицитной сыворотке практически не происходит. Сыворотка с нормальным содержанием железа (18,3 мкМ) инициировала экспрессию генов als3, plb2, plc, sapl, изменение экспрессии гена фосфолипазы С plbl не достоверно. Наибольшая зависимость от концентрации железа наблюдалась для генов als3, plb2, sapl, их экспрессия при увеличении концентрации
сывороточного железа возрастала в 199, 167, 335 раз соответственно. Наименьшая железозави-симость экспрессии наблюдалась для гена plc, его экспрессия в указанных условиях увеличивалась лишь в 22 раза. Аналогичные тенденции выявлены при использовании вместо референтного штамма 24433 клинического изолята 9583 (кровь).
Несмотря на стимуляцию экспрессии факторов патогенности сывороткой с нормальным обменом железа, рост кандид подавляется эффек-торными механизмами врожденного иммунитета. Нарушения обмена железа в сторону избыточного накопления стимулируют активность роста C. albicans и экспрессию ведущих генов патоген-ности. При дефиците сывороточного железа подавляется экспрессия всех изученных генов патоген-ности при одновременной стимуляции активности роста. Полученные результаты позволяют высказать предположение об инфектологических механизмах возникновения кандидозной инфекции на фоне нарушений обмена железа. При нормальном обмене железа гуморальные и клеточные механизмы врожденного иммунитета подавляют развитие кандидоза. Избыточное накопление железа способствует возникновению кандидоза, при дефиците железа исход инфекции будет зависеть от активности механизмов врожденного иммунитета.
Заключение
Биологические свойства C. albicans изменяются в зависимости от обмена железа организма хозяина. Оптимальная концентрация железа для роста в бульоне составляет 30-50 мкМ. Клинические изоляты отличаются большей железозави-симостью по сравнению с референтным штаммом 24433 АТСС. Сывороточное железо регулирует экспрессию генов патогенности als3, sapl, plbl, plb2, plc, кодирующих наиболее важные факторы адгезии и инвазии C. albicans; максимальная экспрессия данных генов наблюдается при [Бе2+]сыв., соответствующей физиологической норме, и уменьшается при избытке и дефиците [Бе2+]сыв. <$>
Литература
1. Реброва РН. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. М.: Медицина; 1989. 132 с.
2. Леонов ВВ, Миронов АЮ. Железо и микроорганизмы. Ханты-Мансийск: Печатный мир г. Ханты-Мансийск; 2016. 190 с.
3. Миронов АЮ, Леонов ВВ. Железо, вирулентность и межмикробные взаимодействия условно-патогенных микробов. Успехи современной биологии. 2016;136(3):301-10.
4. Леонов ВВ, Молчанова ТН. Влияние железа на ростовые характеристики условно-патогенных бактерий. Медицинская наука и образование Урала. 2011;(4):41-3.
5. Fallon K, Bausch K, Noonan J, Huguenel E, Tamburini P. Role of aspartic proteases in disseminated Candida albicans infection in mice. Infect Immun. 1997;65(2):551-6.
6. Чеботарь ИВ. Аспартат протеазы грибов рода Candida - потенциальная мишень для антивирулентной терапии. Клиническая
дерматология и венерология. 2012;10(1): 33-8.
7. Ермилова ЕВ, Залуцкая ЖМ, Лапина ТВ, Матвеева ТВ. Количественный анализ экспрессии генов. Учебное пособие. СПб.: ТЕССА; 2010. 104 с.
8. Nas T, Kalkanci A, Fidan I, Hizel K, Bolat S, Yolbakan S, Yilmaz E, Ozkan S, Kustimur S. Expression of ALS1, HWP1 and SAP4 genes in Candida albicans strains isolated from
Almanac of Clinical Medicine. 2017 March-April; 45 (2): 133-137
women with vaginitis. Folia Microbiol (Praha). 2008;53(2):179-83. 9. Samaranayake YH, Cheung BP, Yau JY, Yeung SK, Samaranayake LP. Human serum promotes Candida albicans biofilm growth
and virulence gene expression on silicone biomaterial. PLoS One. 2013;8(5):e62902. doi: 10.1371/journal.pone.0062902.
10. Леонов ВВ, Булатов ИА, Миронов АЮ. Рост и экспрессия факторов вирулентности
условно-патогенных микроорганизмов в сыворотке крови при разных вариантах гомеостаза железа. Клиническая лабораторная диагностика. 2016;61(8):498-501. doi: 10.18821/0869-2084-2016-61-8-498-501.
References
1. Rebrova RN. Fungi of the genus Candida fungous-free at disease etiology. Moscow: Medit-sina; 1989. 132 p. Russian.
2. Leonov VV, Mironov AYu. Iron and microorganisms. Khanty-Mansiysk: Pechatnyy mir g. Khanty-Mansiysk; 2016. 190 p. Russian.
3. Mironov AYu, Leonov VV. Iron, virulence and intermicrobial interactions of opportunistic pathogens. Biology Bulletin Reviews. 2016;136(3):301 -10. Russian.
4. Leonov VV, Molchanova TN. Effect of iron on the growth characteristics of opportunistic bacteria. Medical Science and Education of Ural. 2011;(4):41-3. Russian.
5. Fallon K, Bausch K, Noonan J, Huguenel E, Tamburini P. Role of aspartic proteases in disseminated Candida albicans infection in mice. Infect Immun. 1997;65(2):551-6.
6. Chebotar' IV. Aspartate proteases of Candida fungi - a potential target for anti-virulent therapy. The Russian Journal of Dermatology and Venereology. 2012;10(1):33-8. Russian.
7. Ermilova EV, Zalutskaya ZhM, Lapina TV, Mat-veeva TV. Quantitative analysis of gene expression. Saint Petersburg: TESSA; 2010. 104 p. Russian.
8. Nas T, Kalkanci A, Fidan I, Hizel K, Bolat S, Yol-bakan S, Yilmaz E, Ozkan S, Kustimur S. Expression of ALS1, HWP1 and SAP4 genes in Candida
albicans strains isolated from women with vaginitis. Folia Microbiol (Praha). 2008;53(2):179-83.
9. Samaranayake YH, Cheung BP, Yau JY, Yeung SK, Samaranayake LP. Human serum promotes Candida albicans biofilm growth and virulence gene expression on silicone biomaterial. PLoS One. 2013;8(5):e62902. doi: 10.1371/journal.pone.0062902.
10. Leonov VV, Bulatov I A, Mironov AYu. The increasing and expression of virulence factors of opportunistic microorganisms in blood serum under various alternatives of iron ho-meostasis. Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2016;61(1):498-501. Russian. doi: 10.18821/0869-2084-2016-61-8-498-501.
Iron-dependency of biological properties of Candida albicans
Leonov V.V.1 • Mironov A.Yu.2
Background: Candidal infections occur in individuals with humoral or cell immunity deficiency. Any disorders of iron metabolism promote immune deficiency and abnormal sensitivity to infections. Potential modification of biological properties of Candida spp. in disorders of iron metabolism has not been discussed. Aim: To clarify the effects of iron metabolism disorders on the modification of biological properties of C. albicans. Materials and methods: Growth kinetics of reference strain (24433 ATCC) and clinical isolates of C. albicans (n = 20) depending on the concentration of Fe2+ ions in the broth and serum of blood donors with various types of iron metabolism (n = 2) was studied by turbidimetry. We also assessed the expression of the adhesion gen (als3), hemolytic phospholipase C genes (plbl, plb2, plc) and aspartic protease gene (sapl) in serum of donors with various iron levels. Results: Growth parameters of all C. albicans strains studied depends on the iron levels in the medium. The calculated constant of affinity to Fe2+ (Ks) for C. albicans strains was in the range from 179.5 to 1863.3 |M. Clinical isolates are more iron-dependent (179.5 < Ks < 1000 |M), compared to the
reference strain ATCC 24433 (Ks = 1199.5 ± 28.3 |M). The optimal concentration of iron for the growth in the broth is 30 to 50 |M. The serum from individuals with normal iron metabolism inhibits the growth activity of C. albicans and is associated with overexpression of all virulence genes studied. Incubation of C. albicans with iron-deficient and iron-loaded sera results in an increase in the growth rate up to 0.017 h-1 and 0.012 h-1, respectively, but is associated with a reduction in expression of the major virulence genes. Conclusion: Biological properties of C. albicans are modified depending on the iron metabolism of the host. In those with normal iron metabolism, immune system suppresses Candida growth. Excess iron levels may promote candidiasis, whereas in iron deficient states the outcome of infection depends on the immune status of the host.
Key words: Candida albicans, candidiasis, iron metabolism, biofilm, growth kinetics, phospholi-pases C, adhesion, aspartic proteases
doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-133-137
Leonov Vadim V. - PhD (in Engineering), Associate Professor, Chair of Microbiology1 Mironov Andrey Yu. - MD, PhD, Professor, Chief of Department of Microbiology2 * 10 Admirala Makarova ul., Moscow, 125212, Russian Federation. Tel.: +7 (495) 380 20 19. E-mail: andy.60@mail.ru
1 Khanty-Mansiysk State Medical Academy; 40 Mira ul., Khanty-Mansiysk, 628011, Russian Federation
2 G.N. Gabrichevsky Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology;
10 Admirala Makarova ul., Moscow, 125212, Russian Federation
