CC BY
56
УДК 581.1
ЗАВИСИМОСТЬ НАКОПЛЕНИЯ ЦИТОКИНИНОВ В КОРНЯХ И ИХ ОТТОКА В ПОБЕГ У РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ОТ ВТОРИЧНО АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА
© А. В. Коробова1*, М. И. Гарипова2, Г. Р. Кудоярова1,
С. С. Медведев3, С. Ю. Веселов2
1 Институт биологии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 69.
Тел./факс: +7 (347) 235 62 47.
E-mail: muksin@mail.ru Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (34 7) 273 6 7 78.
E-mail: margaritag@list.ru Санкт-Петербургский государственный университет Россия, 199034 г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9.
Тел./факс: +7 (812) 328 96 61.
E-mail: ssmedvedev@mail.ru
Была изучена роль вторично активного транспорта цитокининов в распределении этих гормонов между органами растений твердой пшеницыг при введении в питательныгй раствор зеатина. Для этого растения обрабатыгвали карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразоном (КЦХФ). В отсутствие КЦХФ введение гормона приводило к четыгрехкратному повыгшению содержания цитокининов в корнях и относительно слабому их оттоку в побег. При добавлении КЦХФ в среду как у обработанныгх, так и необработанныгх зеатином растений происходило снижение концентрации цитокининов в корнях и повыгшение — в ксилемном соке и побегах. КЦХФ, по-видимому, способствовал выходу цитокининов из клеток в апопласт, что приводило к усилению их загрузки в ксилему. Таким образом, задержка цитокининов в корнях при введении зеатина в среду могла происходить вследствие работы переносчиков, удерживающих эти гормоныг в цитоплазме.
Ключевые слова: Triticum durum Desf, цитокининыг, карбонил-цианид-м-хлор-
фенилгидразон, вторично активныгй транспорт.
Введение
Фитогормоны цитокинины известны своей способностью регулировать многие жизненно важные процессы растений. Было показано, что цитокинины могут выполнять свою регуляторную роль в месте синтеза. Так, увеличение синтеза цитокининов именно в побеге, но не в корнях, усиливало ветвление надземной части [1]. В то же время участие цитокининов в качестве сигнальных молекул, приходящих из корней в побег, не вызывает сомнений. Оно было продемонстрировано на примере взаимодействия этих гормонов с нитратным сигна-лингом [2], а также на примере задержки старения [3] и открытия устьиц [4] в ответ на усиление продукции цитокининов корнями. Изменение концентрации цитокининов в ксилемном соке растений может быть связано синтезом этих гормонов в корнях [2, 5] или с их распадом, поскольку локализация катализирующего его фермента цитокининок-сидазы была обнаружена в местах загрузки ксилемы [6]. Однако существует еще один потенциальный механизм регуляции загрузки цитокининов в ксилему. Он может работать на этапе трансмембранного переноса гормонов. Так, у растений ара-бидопсиса и риса были обнаружены гены PUP (purine permease) и ENT (equilibrium nucleoside trans-
port), кодирующие ферменты, ответственные за поглощение клетками свободных оснований и ри-бозилированных форм цитокининов, соответственно [7, 8]. Однако до сих пор еще до конца не ясна функциональная важность этих переносчиков ци-токининов для роста и развития растений, и этот вопрос требует дальнейшего изучения [9].
Целью данной работы было исследовать значение вторично активного транспорта цитокининов в регуляции их распределения в растении. В качестве ингибитора работы переносчиков мы использовали протонофор карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразон (КЦХФ), при этом мы исследовали его влияние на накопление и распределение цито-кининов в разных органах растения при введении в питательный раствор зеатина.
Материалы и методы
Объектом исследования служили 7-суточные растения твердой пшеницы Семена растений твердой пшеницы (Triticum durum Desf сорта Безенчук-ская 139) проращивали при 24 °С в темноте на водопроводной воде. На третьи сутки проростки переносили на 10 %о-ный раствор Хогланда - Арнона под светоплощадку с освещенностью 400 цмоль фото-нов/(м2с), с 14-часовым световым периодом и температурой 24-26 °С днем и 18-19 °С ночью. Шестису-
* автор, ответственный за переписку
точные растения переносили в сосуды по 10 растений со 100мл 100%-го раствора Хогланда-Арнона для адаптации. Корни семисуточных растений твердой пшеницы погружали на 1 ч в среду с 4.0x10-7 М зеатином. К половине контейнеров также добавляли КЦХФ до конечной концентрации 10 мкМ.
Ксилемный сок для определения гормонов собирали, как описано ранее [10]. Побеги отделяли от корней под водой и соединяли силиконовой трубочкой, заполненной водой, которая вытеснялась ксилемным соком.
Иммуноферментный анализ проводили с использованием антител, специфичных к цитокини-нам зеатинового типа, после разделения свободного зеатина и его рибозида с помощью тонкослойной хроматографии.
Результаты и их обсуждение
Через 1 ч после введения зеатина в питательный раствор возрастал отток цитокининов в побеги, о чем свидетельствует более высокое содержание цитокининов в ксилемном соке этих растений по сравнению с необработанными (рис. 1). Тем не менее, накопление цитокининов в корнях происходило в гораздо большей степени, чем в побегах. Так, через 1 ч инкубации растений на растворе зеатина содержание цитокининов в корнях возрастало в 4 раза, тогда как в побегах - лишь на 80% по сравнению с необработанными гормоном растениями (рис. 2 и 3). Дальнейшее накопление цитокининов в корнях привело к тому, что через 6 ч после начала экзогенной обработки содержание цитокининов в этих органов превышало контрольные растения в 9 раз. В это время концентрация цитокининов в побегах была лишь в 2 раза выше, чем у необработанных растений.
Что же являлось причиной задержки цитоки-нинов в корнях обработанных зеатином растений? Очевидно, что перед загрузкой в ксилему, цитоки-нинам необходимо выйти из прилегающих паренхимных клеток. Рассмотрим, как может происходить трансмембранный транспорт этих гормонов.
0.
со
25 -20 -
* и 2 g S о
3- I п- 2
а>
□ г^1
КЦХФ- КЦХФ+ ЦК- КЦХФ- З+
Рис. 1. Суммарная концентрация зеатина (З) и его рибозида (ЗР) в ксилемном соке через 1 ч после введения в питательный раствор зеатина (З+) и/или КЦХФ (КЦХФ+) по сравнению с необработанными цитокинином (ЦК-) или КЦХФ (КЦХФ-) 7-суточными растениями пшеницы (n = 3).
Рис. 2. Содержание зеатина (З) ,зеатинрибозида (ЗР) и зеатиннуклеотида (ЗН), а также их суммарная концентрация (сумма) в корнях через 1 или 6 ч после введения в питательный раствор зеатина (З+) по сравнению с необработанными цитокинином (ЦК-) 7-суточными растениями пшеницы (п = 6).
Рис. 3. Содержание зеатина (З), зеатинрибозида (ЗР) и зеатиннуклеотцца (ЗН), а также их суммарная концентрация (сумма) в побегах через 1 или 6 ч после введения в питательный раствор зеатина (З+) по сравнению с необработанными цитокинином (ЦК-) 7-суточными растениями пшеницы (п = 6).
Считается, что мембраны клеток проницаемы как для зеатина, так и его рибозида [11]. Ранее сообщалось о пассивном транспорте через мембраны синтетического цитокинина бензиладенина [12]. Также была выдвинута гипотеза о транспирацион-ной регуляции пассивного транспорта цитокининов по ксилеме [13]. Таким образом, накопление цитокининов в корнях обработанных зеатином растений могло происходить вследствие пассивного тока этих гормонов по градиенту концентрации (1.5х10-8 М и 4х10-7 М — концентрации цитокини-нов в клетках корней и питательном растворе, соответственно). Однако с помощью данного механизма невозможно объяснить, почему цитокинины задерживались в клетках корней, а не массово транспортировались в побег (учитывая гораздо
15
10
5
0
большее накопление этих гормонов в корнях по сравнению с побегами в ответ на введение в питательный раствор свободного основания). Изучение транспорта ауксинов показало зависимость проникновения этих гормонов через мембрану от формы, в которой находится ауксин. Так, в цитоплазме, имеющей нейтральную реакцию, большинство молекул находится в диссоциированной форме и не способно проходить через мембрану путем простой диффузии. Вследствие этого, ауксины оказываются запертыми в клетках и могут покинуть их только посредством работы переносчиков [14, 15]. Однако подобный механизм невозможен в случае цитоки-нинов. Дело в том, что было показано, что в диапазоне рН 5-9 100% молекул зеатина находилось в молекулярной форме [16] и могло свободно диффундировать через мембрану; следовательно, необходимо найти другое объяснение задержке цитоки-нинов в корнях обработанных зеатином растений.
Энергозависимый транспорт зеатина был показан на примере культуры клеток корней растений арабидопсиса [17], он был связан с экспрессией в корнях PUP генов, кодирующих предполагаемые переносчики цитокинновых оснований [7].
Таким образом, накопление цитокининов в корнях растений, обработанных зеатином, и их слабый отток в побег может объясняться активным поглощением зеатина клетками корней. Поэтому важно было проверить зависимость распределения цитокининов между органами растений от функционирования вторично активного транспорта. В качестве ингибитора вторично активного транспорта цитокининов мы использовали карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразон (КЦХФ) [7, 17].
Рис. 4. Содержание зеатина (З), зеатинрибозида (ЗР) и зеатиннуклеотида (ЗН), а также их суммарная концентрация (сумма) в корнях через 1 ч после введения в питательный раствор зеатина (З+) и/или КЦХФ (КЦХФ+) по сравнению с необработанными цитокинином (ЦК-) или КЦХФ (КЦХФ-) 7-суточными растениями пшеницы (n = 6).
Из рис. 4 видно, что подавление активного транспорта цитокининов этим протонофором при-
водило к снижению содержания цитокининов в корнях как обработанных, так и необработанных зеатином растений. В то же время обработка КЦХФ приводила к повышению концентрации цитокини-нов в ксилемном соке контрольных и обработанных зеатином растений, а также в побегах (рис. 1, 5). Полученные нами результаты показывают, что обработка растений протонофором снижала накопление цитокининов в корнях. Это, по-видимому, происходило вследствие выхода гормонов из клеток в апопласт, откуда они могли свободно загружаться в ксилему. Следовательно, можно сделать вывод, что задержка цитокининов в корнях при введении зеа-тина в питательный раствор происходила вследствие работы переносчиков, удерживающих эти гормоны в цитоплазме.
Рис. 5. Содержание зеатина (З), зеатинрибозида (ЗР) и зеатиннуклеотида (ЗН), а также их суммарная концентрация (сумма) в побегах через 1 ч после введения в питательный раствор зеатина (З+) и/или КЦХФ (КЦХФ+) по сравнению с необработанными цитокинином (ЦК-) или КЦХФ (КЦХФ-) 7-суточными растениями пшеницы (n = 6).
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 13-04-00666.
ЛИТЕРАТУРА
1. Faiss M., Zalubilova J., Stmad M., Schmulling T. Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants // The Plant Journal. 1997. V. 12. P. 401-415.
2. Takei K., Takahashi T., Sugiyama T., Yamaya T. Sakakibara H. Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin // Journal of Experimental Botany. 2002. V. 53. P. 971-977.
3. Dong H., Niu Y., Li W., Zhang D. Effects of cotton rootstock on endogenous cytokinins and abscisic acid in xylem sap and leaves in relation to leaf senescence // Journal of Experimental Botany. 2008. V. 59. P. 1295-304.
4. Vysotskaya L. B., Stanislav Yu. V., Kudoyarova G. R. Effect on shoot water relations, and cytokinin and abscisic acid levels of inducing expression of a gene coding for isopentenyltransferase in roots of transgenic tobacco plants // Journal of Experimental Botany. 2010. V. 61. I. 13. P. 3709-3717.
5. Rahayu Y. S., Walch-Liu P., Neumann G., Romheld V., von Wiren N., Bangerth F. Root-derived cytokinins as long-
distance signals for NO3 induced stimulation of leaf growth // 11.
Journal of Experimental Botany. 2005. V. 56. P. 1143-1152.
6. Brugiere N., Jiao S. P., Hantke S., Zinselmeier C., Roessler J.
A., Niu X. M., Jones R. J., Habben J. E. Cytokinin oxidase
gene expression in maize is localized to the vasculature, and is 12
induced by cytokinins, abscisic acid, and abiotic stress // Plant Physiology. 2003. V. 132. P. 1228-1240.
7. Burkle L., Cedzich A., Dopke C., Stransky H., Okumoto S., 13
Gillissen B., Kuhn K., Frommer W. B. Transport of cytokinins mediated by purine transporters of the PUP family expressed in phloem, hydathodes, and pollen of Arabidopsis // The Plant 14
Journal. 2003. V. 34. P. 13-26.
8. Hirose N., Makita N., Yamaya T., Sakakibara H. Functional
characterization and expression analysis of a gene, OsENT2, encoding an equilibrative nucleoside transporter in rice sug- 15
gest a function in cytokinin transport // Plant Physiology.
2005. V. 138. P. 196-206.
9. Muraro D., Wilson M., Bennett M. C. Root development: 16
cytokinin transport matters, too! // Current Biology. V. 21. I.
11. P. R423-R425.
10. Vysotskaya L. B., Kudoyarova G. R., Veselov S., Jones H. G. 17
Unusual Stomatal Behaviour on Partial Root Excision in Wheat Seedlings // Plant Cell and Environment. 2004. V. 27. P. 69-77.
Glover B. J., Torney K., Wilkins C. G., Hanke D. E. CYTOKININ INDEPENDENT-1 regulates levels of different forms of cytokinin in Arabidopsis and mediates response to nutrient stress // Journal of Plant Physiology. 2008. V. 165. P. 251-261.
Lampugnani M. G., Fantelli R., Longo G. P., Longo C. P., Rossi G. Uptake of benzyladenine by excised watermelon cotyledons // Plant Physiology. 1981. V. 68. P. 11-14.
Ramina A., Pimpini F., Boniolo A., Bergamasco F. Benzyla-minopurine translocation in Phaseolus vulgaris // Plant Physiology. 1979. V. 63. P. 294-297.
Tanaka H., Dhonukshe P., Brewer P. B. Friml J. Spatiotem-poral asymmetric auxin distribution: a means to coordinate plant development // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 2738-2754.
Medvedev S. S. Mechanisms and physiological role of polarity in plants // Russian Journal of Plant Physiology. 2012. V. 59. No. 4 .P. 502-514.
MacMillan J. Hormonal regulation of development I. Molecular aspects of plant hormones // Encyclopedia of Plant Physiology, New series. Berlin: Springer-Verlag, 1980.
Cedzich A., Stransky H., Schulz B., Frommer W.B. Characterization ofcytokininandadeninetransportin Arabidopsis cell cultures // Plant Physiology. 2008. V. 148. P. 1857-1867.
Поступила в редакцию 30.09.2013 г.
