CC BY
9Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского Биология. Химия. Том 3 (69). 2017. № 1. С. 42-48.
УДК 577.112:612
ЗАВИСИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОСТИ ГЛИКОЛИТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ ОТ СКОРОСТИ ГЕНЕРИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ ОТДЕЛЬНЫХ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЯХ
Елкина Н. М.1, Коношенко С. В.2, Казакова В. В.1
1Медицинская академия (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского» Симферополь, Республика Крым, Россия 2Таврическая академия (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Симферополь, Республика Крым, Россия E-mail: nataleiolkina@gmail. com
Показано, что в эритроцитах больных дилатационной кардиомиопатией и ишемической болезнью сердца интенсифицируются гликолитические реакции и вместе с этим активизируется генерирование активных форм кислорода (супероксиданиона и гидроксил-радикала). Установлена тесная корреляционная взаимосвязь в изменении показателей гликолитических реакций и генерирования активных форм кислорода в эритроцитах при соответствующих патологиях.
Ключевые слова: эритроциты, гликолиз, гексокиназа, фосфоенолпируват, АТФ, генерирование супероксиданиона и гидроксил-радикала, сердечно-сосудистые заболевания.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение биохимических изменений в организме человека при различных заболеваниях, сопровождающихся развитием окислительного стресса, является одной из задач современной биологии и медицины. Имеется ряд работ, свидетельствующих о том, что при многих заболеваниях такого характера в патологический процесс вовлекаются эритроциты, осуществляются изменения в их структурном и метаболическом состоянии [1-4].
Представляется важным понять, какие из этих изменений имеют необратимый характер и ведут к деструктивным процессам, а какие имеют адаптивное значение и направлены на поддержание функциональной активности эритроцитов.
Известно, что одним из основных видов метаболизма в эритроцитах является гликолиз - окисление глюкозы до лактата, что позволяет поддерживать определенный уровень АТФ, необходимый для обеспечения энергозависимых процессов [5]. Имеются также данные, свидетельствующие о том, что при некоторых заболеваниях в эритроцитах усиливается генерирование активных форм кислорода (АФК) радикальной природы [2].
В связи с этим представляет интерес изучение зависимости интенсивности гликолитических реакций в эритроцитах от скорости генерирования в них АФК в
условиях патологии, в частности при сердечно-сосудистых заболеваниях, что и составило цель настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили эритроциты практически здоровых людей (контрольная группа - 25 человек, средний возраст 39,0 лет), а также больных дилатационной кардиомиопатией (20 человек, средний возраст 45,0 лет) и ишемической болезнью сердца (25 человек, средний возраст 49,0 лет).
Кровь больных брали на базе 7-й городской больницы г. Симферополя, кровь практически здоровых людей - на базе ГБУЗ РК «Центр крови».
Кровь больных людей брали при поступлении в стационар, перед началом лечения, придерживаясь норм и принципов биоэтики.
Эритроциты гемолизировали, добавляя равный объем дистиллированной воды [6]. В гемолизатах эритроцитов определяли активность гексокиназы [7], содержание метаболита гликолиза фосфоенолпирувата (ФЕП) и АТФ [8] По этим показателям оценивали интенсивность гликолитических реакций в эритроцитах. Наряду с этим в гемолизатах проводили определение скорости генерирования супероксиданиона (О2) и гидроксил-радикала (*ОН) [9].
Во всех опытах использовались спектрофотометрические методы биохимического анализа.
Полученные данные обрабатывали статистически с применением 1>критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с использованием метода, применяемого для малых выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из показателей интенсивности гликолитических реакций является активность гексокиназы - фермента, катализирующего первую «пусковую» реакцию гликолиза.
При изучении активности гексокиназы в эритроцитах больных и практически здоровых людей были получены данные, представленные в табл. 1. Из этих данных видно, что активность изученного фермента в эритроцитах больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и дилатационной кардиомиопатией была достоверно выше по сравнению с контрольной группой. В обеих группах больных активность внутриэритроцитарной гексокиназы превышала показатель контрольной группы практически в 2,0 раза.
Изучение количественного содержания в эритроцитах фосфоенолпирувата (макроэргического метаболита гликолиза) показало, что уровень ФЕП в гемолизатах эритроцитов больных был также существенно выше по сравнению с контрольной группой: в 2,3 раза у больных ИБС и в 1,8 раза - у больных кардиомиопатией. В большей степени изменения данного показателя прослеживаются в эритроцитах больных ишемической болезнью сердца.
Наряду с этим были выявлены существенные изменения в количественном содержании АТФ. Содержание АТФ в эритроцитах больных превышало показатель
контрольной группы: в 2,5 раза при ишемической болезни сердца и в 2,4 раза - при дилатационной кардиомиопатии.
В целом, из всех этих данных следует, что при ишемической болезни сердца и дилатационной кардиомиопатии в эритроцитах усиливаются гликолитические реакции и, следовательно, возрастает продукция АТФ. Не исключено, что при этом возрастает образование побочного продукта гликолиза 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) - аллостерического эффектора гемоглобина, регулирующего средство дыхательного белка к кислороду [10]. Изменения такого рода в эритроцитах могут иметь определенное адаптивно-компенсаторное значение.
Таблица 1
Содержание ФЕП и АТФ и активность гексокиназы в гемолизате эритроцитов больных ИБС и дилатационной кардиомиопатией (М ± т)
Обследованные группы Активность гексокиназы, -1 -1 нмоль-мин -мл Содержание ФЕП, мг % Фн Содержание АТФ, мг % Фн
Контрольная группа 0,66 ± 0,03 0,43 ± 0,02 0,48± 0,01
Больные ИБС 1,36 ± 0,03* 0,99 ± 0,03* 1,2 ± 0,1*
Больные дилатационной кардиомиопатией 1,28 ± 0,12* 0,77 ± 0,07* 1,16 ± 0,05*
- достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
Таблица 2
Скорость генерирования супероксиданиона и *ОН-радикала в гемолизате эритроцитов больных ИБС и дилатационной кардиомиопатией (М ± т)
Обследованные группы Скорость генерирования супероксиданиона, усл. ед.-мин- мгНЬ- Скорость генерирования *ОН-радикала, усл. ед.-мин- мгНЬ-
Контрольная группа 2,90 ± 0,15 16,50 ± 0,84
Больные ИБС 4,95 ± 0,26* 54,35 ± 2,95*
Больные дилатационной кардиомиопатией 4,35 ± 0,21* 45,40 ± 2,70*
* ~ ~
- достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
Учитывая то обстоятельство, что при ишемической болезни сердца и дилатационной кардиомиопатии в эритроцитах интенсифицируются реакции перекисного окисления липидов [11], тем самым свидетельствуя о развитии окислительного стресса, представляло интерес определить уровень образования активных форм кислорода в эритроцитах при соответствующих заболеваниях и выяснить вопрос о возможности связи наблюдаемых изменений в показателях гликолитических реакций с процессом генерирования АФК.
При изучении скорости генерирования супероксиданиона и гидроксил-радикала в эритроцитах практически здоровых людей и больных были получены данные, представленные в табл. 2. Как показали результаты исследований, скорость генерирования супероксиданиона в эритроцитах больных была достоверно выше по сравнению с контрольной группой: в 1,7 раза при ишемической болезни сердца и в 1,5 раза - при кардиомиопатии. При этом более выраженными оказались изменения скорости генерирования *ОН-радикала. В эритроцитах больных ИБС скорость генерирования гидроксил-радикала превышала показатель контрольной группы в 3,3 раза, у больных дилатационной кардиомиопатией - в 2,75 раза.
Для установления тесноты взаимосвязи интенсивности гликолитических реакций и генерирования АФК был проведен корреляционный анализ между изученными показателями в следующем порядке: активность гексокиназы -скорость генерирования О2; активность гексокиназы - скорость генерирования 'ОН; содержание ФЕП - скорость генерирования О2; содержание ФЕП - скорость генерирования 'ОН; содержание АТФ - скорость генерирования О2;; содержание АТФ - скорость генерирования 'ОН.
Во всех случаях коэффициент корреляции был положительным и существенно высоким и находился, в целом, в пределах (+0,93) - (+0,98), что указывает на достаточно хорошо выраженную зависимость интенсивности гликолитических реакций в эритроцитах больных от скорости генерирования активных форм кислорода. На наш взгляд, этот факт представляет большой интерес и создает перспективу для дальнейших исследований с целью выяснения причины столь тесной взаимосвязи двух совершенно разных внутриэритроцитарных процессов.
Усиленное генерирование супероксиданиона и гидроксил-радикала в эритроцитах больных свидетельствует о развитии окислительного стресса и о возможности интенсификации в эритроцитах деструктивных процессов, осуществляемых под действием АФК. Факт активизации гликолиза в эритроцитах в этих условиях позволяет предположить реализацию некоторого процесса, возможно, запускаемого АФК и способствующего оптимизации гликолитических реакций, энергообмена и в итоге - поддержанию функциональной активности эритроцитов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, результаты исследований позволяют сделать следующие
выводы:
1. В эритроцитах больных дилатационной кардиомиопатией и ишемической болезнью сердца интенсифицируются гликолитические реакции, о чем свидетельствует повышение активности внутриэритроцитарной гексокиназы, содержания фосфоенолпирувата и АТФ.
2. При ишемической болезни сердца и дилатационной кардиомиопатии в эритроцитах усиливается генерирование супероксиданиона и гидроксил-радикала, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Показано более интенсивное генерирование *ОН-радикала по сравнению с супероксиданионом.
3. Методом корреляционного анализа установлена тесная взаимосвязь интенсивности гликолитических реакций в эритроцитах больных и скорости генерирования супероксиданиона и гидроксил-радикала. Коэффициенты корреляции положительные и находятся в пределах (+0,93) - (+0,98).
Список литературы
1. Новицкий В. В. Белковый спектр мембран эритроцитов у больных раком легкого и с опухолями головы и шеи / В. В. Новицкий, В. Е. Гольдберг, М. В. Колосова и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1999. - Прил. 1. - С. 18-20.
2. Елкина Н. М. Процессы пероксидации липидов, метгемоглобинообразования и генерирования активных форм кислорода в эритроцитах больных эритремией / Н. М. Елкина // Уч. записки Таврического нац. ун-та им. В. И. Вернадского. - Сер.: Биология, химия. - 2013. - Т. 26 (65), № 4. - С. 39-43.
3. Коношенко С. В. Особливост окиснювально! модифжацп проте!шв в еритроцитах хворих на кардюмюпатто, iшемiчну хворобу серця, еритремто та апластичну анемш / С. В. Коношенко, Н.М. Йолюна // Експериментальна та клшчна фiзiологiя i бiохiмiя. - 2013, № 2. - С. 40-43.
4. Novgorodtseva T. P. Modifications of the fatty acid composition of the erythrocyte membrane in patients with chronic respiratory diseases / T. P. Novgorodtseva, Y. K. Denisenko, N. N. Zhukova [et al] // Lipids Health Dis. - 2013, N 12. - P. 117-121.
5. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / У. Мак-Мюррей. - М.: Мир, 1980. - 368 с.
6. Drabkin D. A simplified technique for large scale crystallization myoglobin and haemoglobin in the crystalline / D. Drabkin // Arch. Biochem. - 1959. - V. 21. - P. 224-226.
7. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии / Г. А. Кочетов. - М.: Высшая школа, 1980. - 271 с.
8. Алейникова Т. Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Т. Л. Алейникова, Г. В. Рубцова. - М.: Высшая школа, 1988. - 238 с.
9. Basaga H. S. Biochemical aspects of free radicals / H. S. Basaga // Cell. Biol. - 1990. - V. 68, N 5. -P. 989-998.
10. Иржак Л. И. Гемоглобины и их свойства / Л. И. Иржак. - М.: Наука, 1975. - 240 с.
11. Елкина Н. М. Состояние антиоксидантной системы в эритроцитах при отдельных гематологических и сердечно-сосудистых заболеваниях / Н. М. Елкина, С. В. Коношенко // Уч. записки Таврического нац. ун-та им. В. И. Вернадского. - Серия: Биология, химия. - 2015. -Т. 1 (67), № 3. - С. 14-20.
CORRELATION OF INTENSIVITY OF GLYCOLITIC REACTIONS AND
OXYGEN ACTIVE FORMS GENERATION IN ERYTHROCYTES UNDER SOME CARDIOVASCULAR DISEASES
Yolkina N. M., Konoshenko S. V., Kazakova V. V.
V.I. Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol, Crimea, Russia
E-mail: nataleiolkina@gmail com
Today we have much dates about that under some diseases erythrocytes are involved in pathological process as demonstrated by biochemical changes occurring in them [1-3]. In is known, that glycolysis is the main metabolic way in erythrocytes and it's very important for energy production and regulation of hemoglobin oxygen - transport function
[4].
Also, we have about more intensive production of oxygen active forms in erythrocytes under some diseases [1]. In this regard, it is interest to examine the correlation of the state of glycolytic reactions and oxygen active forms production in erythrocytes under some cardio-vascular diseases that was the aim of our work.
The materials for the study were the erythrocytes of healthy subjects (control group) and patients with dilated cardiomyopathy (20 persons, middle age 45,0 years) and with ischemic heart disease (25 persons, middle age 48,0 years). The blood of patients with disease was taken before treatment for an illness.
It has been shown, that in hemolysates of erythrocytes at two groups of patients the activity of hexokinase was rised: at 2,0 times as compared with control group. The content of phosphoenolpiruvate was rised also: at 1,8 times under cardiomyopathy and at 2,3 times under ischemic heart disease. The content ATP was rised at 2,4 times under cardiomyopathy and at 2,5 times under ischemic heart disease. These dates evidence about that in erythrocytes of patients with dilated cardiomyopathy and ischemic heart disease the glycolitic reaction are intensified and these changes may have compensatoric sense.
At the same time, in hemolysates of erythrocytes of patients the speed of oxygen active forms (hydroxyl-radicals and superoxideanione) generation was rised also. The speed of generation of superoxideanione in erythrocytes was rised: at 1,7 times under ischemic heart disease, at 1,5 times - under cardiomyopathy. The speed of generation of hydroxyl-radicals was rised at 3,3 times under ischemic heart disease and at 2,75 times -under dilated cardiomyopathy as compared with control group.
It has been shown, that between indexes of glycolitic reactions and oxygen active forms generation in erythrocytes of patients the high correlation is observed. These dates evidence about possibility realization in erythrocytes some processes with participation of oxygen active forms, that lead to optimisation of glycolitic reactions, energy production and, as a result, to supporting of erythrocytes functional activity.
Keywords: erythrocytes, glycolysis, hexokinase, phosphoenolpiruvate, ATP, superoxideanione and hydroxyl-radicals generation, cardiovascular diseases.
References
1. Yolkina N. M., Processes of lipids peroxide, methaemoglobin formation and oxygen active forms generation in erythrocytes of patients with erythraemia, Sc. notes of V. I. Vernadsky Taurida university, Biology and Chemistry, 26 (65), 4, 39 (2013).
2. Konoshenko S. V., Yolkina N. M., Peculiarities of proteins oxidative modification in erythrocytes of patients with cardiomyopathies, ischemic heart disease, erythraemia and aplastic anemia, Experimental and clinical physiology and biochemistry, 2, 40 (2013).
3. Novgorodtseva T. P., Denisenko Y. K., Zhukova N. N., Modifications of the fatty acid composition of the erythrocyte membrane in patients with chronic respiratory diseases, Lipids Health Dis., 12, 117 (2013).
4. McMurray W., Essentials of human metabolism, 366 (Moscow, 1980).
5. Kochetov G. A., Enzymologypractical textbook, 271 (Moscow, 1980).
6. Alejinikova T. L., Rubtsova G. V., Textbook for biochemistry practice, 238 (Moscow, 1988).
7. Basaga H. S., Biochemical aspects of free radicals, Cell. Biol., 68, 5, 989 (1990).
