CC BY
37
УДК 577.152.321
ЗАЛЕЖНІСТЬ АКТИВНОСТІ ЦЕЛЮЛОЗОЛІТИЧНИХ ЕНЗИМІВ МОНО- ТА ДИКАРІОТИЧНИХ КУЛЬТУР Stereum hirsutum (Wild.) Gray (Basidiomycetes)
ВІД СУБСТРАТУ
С. М. Бойко
М. Є. Рязанова Донецький національний університет, Україна
E-mail: bsm73@ukr.net
Отримано 30.05.2012
Досліджено активність целюлозолітичних ензимів культур Stereum hirsutum (Wild.) Gray, різних за ядерним статусом, залежно від субстрату. Найпродуктивнішими за синтезом ендоглюконаз були монока-ріотичні культури Sh1-4 та Sh7-2. Встановлено, що живильне середовище зі вмістом фільтрувального паперу є оптимальним для синтезу целюлаз (культура Sh1-4, максимум целюлозолітичної активності — 319 цМ/мг, культура Sh7-2 — 101 цМ/мг). За культивування на тирсі деревини максимум целюлозолітичної активності у культури Sh1-4 спостерігали на 10-ту добу — 142 цМ/мг (тирса дуба), у культури Sh7-2 — на 20-ту добу — 34 цМ/мг (тирса ясеня). Дослідження якісного складу целюлозолітичних ензимів дало змогу встановити наявність чотирьох екзоензимів Сх-комплексу з відносною електрофоретичною рухливістю 0,22; 0,24; 0,47; 0,74. Ензим з відносною електрофоретичною рухливістю 0,47 відзначається високою концентрацією та активністю.
Ключові слова: целюлозолітичні ензими, Stereum hirsutum, монокаріотичні культури, електрофорез протеїнів.
Сучасним напрямом прикладних мікологічних досліджень є пошук перспективних продуцентів біологічно активних речовин.
Науковий досвід свідчить, що дереворуйнів-ні базидіальні гриби мають лабільну й різноманітну ензиматичну систему, складність якої зумовлена структурою природних субстратів, якими вони живляться. Саме тому в біотехнологічній галузі базидіоміцети розглядають як перспективні продуценти сировини для виробництва харчових добавок, антибіотиків, стероїдів, різних кислот, ріст-активуючих речовин, вітамінів тощо [1].
Ензиматична конверсія рослинної сировини, продукти трансформації якої можна широко застосовувати для одержання продуктів харчування, протеїново-вітамінних концентратів, спиртів, а також як замінники вуглеводного палива, є актуальним питанням сьогодення [2].
До найбільш вивчених целюлаз нижчих грибів належать ензиматичні системи представників родів Trichoderma, Penicillium,
Aspergillus, Fusarium [3], серед вищих грибів можна відзначити представників родів Phanerochaete, Coriolus, Schizophyllum,
Irpex, Stereum [1, 4]. Сапротрофні дерево-руйнівні гриби мають у своєму складі весь спектр ензимів (екзо-, ендоглюканази, целобіогідролази, целобіази, геміцелюлази, пектинметилгідролази, екзо-, ендополіга-лактуронази), що потрібні для біодеградації складних і водночас широко розповсюджених компонентів. Активність окремих компонентів целюлазного комплексу досить видоспецифічна й істотно залежить від умов культивування [1, б]. Тому пошук та добір високоактивних культур є першочерговим завданням у вирішенні питання біо-трансформації лігноцелюлозної сировини
[6]. Базидіальний гриб Stereum hirsutum (Wild.) Gray є космополітом, трапляється на залишках багатьох видів листяних дерев
[7]. Про зацікавленість науковців цим грибом та його властивостями свідчать публікації [8-11]. Трофічна невибагливість S. hir-sutum може вказувати на високий потенціал ензимів гідролітичного комплексу. Враховуючи значну гетерогенність спорового матеріалу, високоактивна дикаріо-тична культура може становити інтерес для біотехнології.
11б
Мета роботи — дослідити залежність целюлозолітичної активності моно- та дика-ріотичних культур сапротрофного гриба
S. hirsutum за культивування на різних субстратах.
Матеріали і методи
Попередньому скринінгу було піддано шість дикаріотичних культур S. hirsutum. Далі відібрали дві найактивніші культури, які було виділено з плодових тіл грибів, що зростали у м. Ялті (Південний Берег Криму) — Sh1 та м. Макіївці (Південний Схід України) — Sh7. Виділення чистої культури проводили за загальновідомими методами з використанням пероксиду водню [12]. Одержану чисту культуру вирощували на картопляно-агаризованому середовищі у термостаті ТС-80М-2 за температури 26 °С. Моноспорові культури (Sh1-1, Sh1-2, Sh1-3, Sh1-4, Sh7-1, Sh7-2, Sh7-5) отримували методом спорових відбитків, з яких робили змив з наступним багаторазовим розведенням стерильною дистильованою водою. Однорідну водну суспензію базидіоспор висівали глибинно у чашки Петрі на агаризова-не середовище й пророщували у термостаті [12]. Чистоту та належність до моноспоро-вих культур контролювали за допомогою мікроскопії.
Штами культивували на рідкому живильному середовищі Чапека такого складу (г/л): NaNO3 — 2 г, K2HPO4 — 1 г , MgSO47H2O — 0,5 г, FeSO47H2O — 0,01 г, KCl — 0,б г [13]. Як єдине джерело вуглецю використовували фільтрувальний папір (Whatman № 1, щільність 80 г/м2). Природним джерелом вуглецю слугувала дрібна тирса деревини абрикоса (Prunus sp.), ясеня (Fraxinus sp.) та дуба (Quercus sp.) у кількості 50 мг на 20 мл живильного середовища. Культивування проводили у колбах Ерленмеєра об’ємом 100 мл за оптимальної температури 24 °С упродовж 20 діб.
Активність позаклітинних ендоглюка-наз визначали на 5-, 10-, 15- та 20-ту добу культивування стосовно Na-карбоксиметил-целюлози (С5678, Sigma). За одиницю активності приймали кількість редукуючих цукрів (цМ), утворених 1 мг протеїну, що міститься в культуральній рідині, за 1 год. Редукуючі цукри виявляли методом Шомо-дьї-Нельсона [12, 14]. Кількість протеїну визначали спектрофотометрично [15, 16].
Якісний склад Сх-ендоглюканаз оцінювали електрофоретичним методом. Для цього застосовували 7,5%-й поліакриламідний
гель зі вмістом Na-КМЦ з використанням трис-гліцинової буферної системи (рН 8,3) [17, 18]. Гель витримували протягом 30 хв у
0,2 М фосфатному буфері за температури 50 °С. Потім забарвлювали його, використовуючи барвник конго-червоний. Концентрування культуральної рідини здійснювали за допомогою системи Vivaspin turbo 15 (Sartorius stedim biotech Gmbh).
Отримані дані обробляли статистично за допомогою дисперсійного аналізу, зокрема порівняння середніх — за методом Дункана [19].
Результати та обговорення
Попередній скринінг культур S. hirsutum дав змогу встановити найбільш активні ізоляти з подальшим синтезом ензимів целю-лозолітичної дії (рис. 1). Так, культура Sh1-4 показала вірогідний максимум активності на 5-ту добу — 319 цМ/мг протеїну. Культура Sh7-2 була менш активною (101 цМ/мг), але вірогідний максимум її целюлозолітичної активності також спостерігався на 5-ту добу. Високі показники питомої целюлозолітичної активності на 5-ту добу пояснюються низькою концентрацією загального протеїну в культуральній рідині, що свідчить про високу синтетичну активність у культури саме целюлаз. Однак низька концентрація протеїну унеможливлює його практичне отримання в цей термін. Слід також зазначити, що хоча дикаріотич-ні культури Sh1 та Sh7 S. hirsutum містять удвічі більше ДНК, вони не мають суттєвої переваги в експресії целюлозолітичних ензимів. Завдяки гетерогенності монокаріо-тичних культур деякі з них виявляють ендоглюканазну активність, що є значно вищою порівняно з батьківськими культурами.
На другому етапі досліду використовували культури, найбільш активні за синтезом ензимів целюлозолітичної дії. Встановлено, що загалом питома целюлозолітична активність досліджуваних культур на фільтрувальному папері була вищою, ніж у разі культивування на тирсі дерев різних видів (рис. 2). Вірогідний максимум целюлозолі-тичної активності у культури Sh1-4 за культивування на тирсі деревини спостерігали на 10-ту добу — 142 цМ/мг протеїну (тирса дуба).
У випадку з культурою Sh7-2 найкращою деревиною був ясень, показник дорівнював 34 цМ/мг на 20-ту добу культивування (рис. 3). Максимум целюлозолітичної
активності за культивування на деревині абрикоса зафіксовано на 10-ту добу культивування — 21 цМ/мг, а у разі культивування на деревині дуба — 26 цМ/мг на 20-ту добу.
Для електрофоретичного дослідження застосовували культуральні фільтрати ізо-
лятів Sh1-4 та Sh7-2 5. Ы^иШт, що їх було попередньо сконцентровано. Культури вирощували за оптимальних умов на живильному середовищі Чапека, яке містило фільтрувальний папір. Якісний склад целюлаз Сх-комплексу наведено на рис. 4.
ЗИ SM- SH1- Shi- ЗМ- Sh7 3tl7- 5Г7- 5"Т-
g ■ ■ : ■. і і г. м
Культура
Рис. 1. Порівняльна характеристика питомої целюлозолітичної активності дикаріотичних та моноспорових культур S. hirsutum
Рис. 2. Порівняння питомої целюлозолітичної активності моноспорової культури Sh1-4 Stereum hirsutum за культивування на різних субстратах
о
л
S
4
я
ЇС
5 о
S
е
1 Л)
1 CD
Я1
Доба
Рис. 3. Порівняння питомої целюлозолітичної активності моноспорової культури Sh7-2 Stereum hirsutum за культивування на різних субстратах
R1
0,22 0,24
0,47 0,74
Рис. 4. Електрофореграма Сж-целюлаз монокаріотичних культур S. hirsutum:
1 — ізолят Sh1-4; 2 — ізолят Sh7-2.
Загалом було виявлено чотири екзоензи-ми Сх-комплексу культур 5. hirsutum. Ізоензим з відносною електрофоретичною рухливістю 0,47 добре визначається навіть за умов використання неконцентрованого культурального фільтрату. Концентрування останнього приблизно у 12 разів допомогло визначити ще три ізоензими, однак їхня активність є дуже низькою. За своєю електрофоретичною рухливістю ензими двох культур схожі.
Таким чином, проведені дослідження дали змогу встановити суттєву гетероген-
ність за целюлозолітичною активністю ди-та монокаріотичних культур 5. кі^иШт. Визначено монокаріотичні культури Sh1-4 та Sh7-2 як найбільш активні продуценти екзоензимів целюлозолітичної дії. Усі досліджені культури Stereum hirsutum мають вищі показники целюлозолітичної активності за культивування на середовищі, що містить фільтрувальний папір. За допомогою зимограми встановлено, що в культур 5. кі^Шит відбувається експресія чотирьох екзоензимів Сх-комплексу.
ЛІТЕРАТУРА
1. Даниляк Н. И., Семичаевский В. Д., Дудченко Л. Г. и др. Ферментные системы высших базидиомицетов. — К.: Наук. думка, 1989. — 280 с.
2. СиницынА.П.,ГусаковА.В., ЧерноглазовВ.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Уч. пособие. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с.
3. Wood T. M. Fungal cellulases // Biochem. Soc. Trans. — 1992b. — V. 20. — P. 46-53.
4. Novotny C., Cajthaml T., Svobodova K. et al. Irpex lacteus, a white-rot fungus with biotechnological potential // Folia Microbiol. —
2009. — V. 54, N 5. — P. 375-390.
5. Билай В. И., Билай Т. И., Мусич Е. Г. Трансформация целлюлозы грибами. — К.: Наук. думка, 1982. — 296 с.
6. Древаль К. Г., Бойко М. І. Нові продуценти целюлозолітичних ензимів серед вищих базидіальних грибів // Біотехнологія. — 2011. — Т. 4, № 1. — С. 87-92.
7. Лессо Т. Грибы: Определитель. — М.: ООО «Издательство АСТ», 2003. — 304 с.
8. Palma C., Contreras E, Urra J, Martinez M. Eco-friendly technologies tased on banana peel use for the decolourization of the dyeing process wastewater // Waste Biomass Valor. — 2011. — V. 2. — P. 77-86.
9. Heilmann-Clausen J., Boddy L. Inhibition and stimulation effects in communities of wood decay fungi: exudates from colonized wood influence growth by other species // Microb. Ecol. — 2005. — V. 49. — P.399-406.
10. Nguyen Ngoc-Phuong-Thao, Lee Kyoung-Mi, Lee Kyoung-Min et al. One-step purification and characterization of a P-1,4-glucosidase from a newly isolated strain of Stereum hirsutum // Appl. Microbiol. Biotechnol. —
2010. — V. 87. — P. 2107-2116.
11. Бойко С. М. Різноманітність внутрішньоклітинних ферментних систем природних штамів Stereum hirsutum (Willd.) Gray (Basidiomycetes) на території Донецької області // Укр. бот. журн. — 2012. — Т. 69, № 2. — С. 286-291.
12. Билай В. И. Методы экспериментальной микологии. — К.: Наук. думка, — 1982. — 50 с.
13. Семенов С. М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справочник. — М.: Агропромиздат, 1999. — 240 с.
14. Green F., Clausen C. A., Highley T. L.. Adaptation of the Nelson-Somogyi reducing-rugar assay to a microassay using microtiter plates / / Anal. Biochem. — 1989. — V. 182. — P.197-199.
15. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высш. шк., 1980. — 272 с.
16. Дарбре А. Практическая химия белка: Пер. с англ. — М.: Мир, 1989. — 623 с.
ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ЭНЗИМОВ МОНО- И ДИКАРИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР Stereum hirsutum (Wild.) Gray (Basidiomycetes)
ОТ СУБСТРАТА
С. М. Бойко М. Е. Рязанова
Донецкий национальный университет, Украина
E-mail: bsm73@ukr.net
Исследована активность целлюлозолити-ческих энзимов культур Stereum hirsutum (Wild.) Gray, различных по ядерному статусу, в зависимости от субстрата. Наиболее продуктивными относительно синтеза эндоглюканаз были монокариотические культуры Sh1-4 и Sh7-2. Установлено, что питательная среда, содержащая фильтровальную бумагу, является оптимальной для синтеза целлюлаз (культура Sh1-4, максимум целлюлозолитической активности — 319 цМ/мг, культура Sh7-2 — 101 цМ/мг). Максимум целлюлозолитической активности при культивировании с опилками древесины у культуры Sh1-4 наблюдался на 10-е сут — 142 цМ/мг (опилки дуба), у культуры Sh7-2 — на 20-е сут — 34 цМ/мг (опилки ясеня). Исследование качественного состава целлюлозолитических энзимов позволило установить наличие четырех экзоэнзимов Сх-комплекса с относительной электрофоретической подвижностью 0,22; 0,24; 0,47; 0,74. Энзим с относительной электрофоретической подвижностью 0,47 отличается высокой концентрацией и активностью.
Ключевые слова: целлюлозолитические
энзимы, Stereum hirsutum, монокариоти-ческие культуры, электрофорез протеинов.
17. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). — М.: Наука, 1981. — 288 с.
18. Bartley T. D., Murphy-Holland K., Eveleigh
D. E. A method for the detection and differentiation of cellulase components in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. — 1984. — V. 14. — P. 157-161.
19. Приседський Ю. Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів. Навч. посібн. — Донецьк: Кассиопея, 1999. — 210 с.
ACTIVITY DEPENDENCE OF CELLULOLYTIC ENZYMES MONO-AND DIKARYOTIC CULTURES OF Stereum hirsutum (Wild.) Gray (Basidiomycetes)
FROM A SUBSTRATUM
S. M. Boiko M. E. Ryazanova
Donetsk national university,
Ukraine
E-mail: bsm73@ukr.net
Activity of cellulolytic enzymes cultures Stereum hirsutum (Wild.) Gray, different nuclear status, depending on the substrate have been studied. The most productive by synthesis endoglucanases monokaryotic cultures of Sh1-4 and Sh7-2 were determined. It is found that nutrient medium containing filtering paper is optimal for synthesis of cellulase (culture Sh1-4, maximum of cellulolytic activity is 319 |j.M/mg, culture Sh7-2 — 101 |j.M/mg). Maximum of cellulolytic activity at cultivation with sawdust of trees for culture Sh1-4 observed at the 10th day was 142 |j.M/mg (oak sawdust), for culture Sh7-2 at the 20th days it was 34 |j,M/mg (ash-tree sawdust). Study of quality cellulolytic enzymes enabled to establishe presence of four exoenzymes of Cx complex with a relative electrophoretic mobility of 0.22; 0.24; 0.47; 0.74. Enzyme with relative electrophoretic mobility 0.47 showed high concentration and activity.
Key words: cellulolytic enzymes, Stereum hirsu-tum, monokaryotic cultures, electrophoresis of proteins.
