CC BY
41
—---------------------—
Зависимость активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в плазме и клетках крови больных тромбофлебитом от уровня лейкоцитоза
Н.В. Фомина1, М.А. Фомина1, А.А. Царегородцев2, С.А. Исаков2
1ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»
Минздравсоцразвития России, Рязань 2ГБУ РО «Областной клинический кардиологический диспансер», Рязань
Изучена активность лизосомальных цистеиновых протеиназ (ЛЦП) - катепсинов L и Н в плазме и различных фракциях лейкоцитов крови у больных тромбофлебитом вен нижних конечностей в зависимости уровня лейкоцитоза. Обнаружено статистически значимое повышение активности катепсина L в полиморфноядерных (ПМЯЛ) и моноядерных (МЯЛ) лейкоцитах, а также статистически значимое снижение активности катепсина Н в плазме крови больных тромбофлебитом вен нижних конечностей у пациентов с повышенным количеством лейкоцитов.
Ключевые слова: лизосомальные цистеиновые протеиназы, полиморфноядерные и моноядерные лейкоциты, тромбофлебит вен нижних конечностей.
Лизосомальные цистеиновые протеиназы ка-тепсины L и Н являются важными протео-литическими ферментами клетки, изменение активности которых может служить одним из показателей изменения биохимических процессов при различных патологических процессах, в том числе при воспалении [9, 12].
Показано, что ЛЦП, а также дисбаланс между ЛЦП и их внутриклеточным ингибитором - циста-тином С играет одну из ведущих ролей в ремоделировании сосудистой стенки при патологии сосудов -атеросклерозе [10] и аневризме аорты [11]. В то же время данные об участии ЛЦП в патологии венозной системы практически отсутствуют.
Следует также отметить, что чётких представлений о роли лейкоцитов в патогенезе тромбофлебита до настоящего времени не сформировано. В настоящее время имеются данные, как подтверждающие [1, 4], так и опровергающие [7] возможную роль лейкоцитов в повреждении венозной стенки. В то же время именно ЛЦП могут оказаться самыми вероятными эффекторами в данном процессе, так как они способны к секреции во внеклеточный матрикс [3] и одним из объектов их действия является коллаген. Лизосо-мальные ферменты лейкоцитов воздействуют на коллагеновые волокна, что приводит к утрате целости каркаса вены. В перицеллюлярное пространство выходит большое количество веществ, способных к повреждению интимы сосуда с обнажением субэндотелиаль-ных слоёв, в результате чего и запускается каскад свёртывания крови и образование тромба в вене [5].
Целью нашей работы явилось изучение изменения активности катепсинов L и Н различных фракций лейкоцитов в зависимости от количества лейкоцитов в периферической крови при тромбофлебите.
Материалы и методы
В работе представлены результаты обследования 40 пациентов с диагнозом «тромбофлебит нижних конечностей», находившихся на лечении в Рязанском областном кардиологическом диспансере. Средний возраст пациентов составил 62,5 ± 11,7 года. В процессе исследования испытуемые были разделены на две группы: группа 1 - пациенты с нормальным уровнем лейкоцитов (общий лейкоцитоз до 9,0 х 109/л), группа 2 - пациенты с повышенным уровнем лейкоцитов (общий лейкоцитоз свыше 9,0 х 109/л) [2]. Контрольную группу составили здоровые доноры, забор крови осуществлялся в отделении переливания крови Рязанской ОКБ. Группы были сопоставимы по возрасту и полу. Забор крови у пациентов производился из локтевой вены утром натощак. Для выделения различных фракций лейкоцитов использовали кровь, стабилизированную ЭДТА. Эритроциты осаждали 6 % раствором декстрана, после чего плазму со взвешенными в ней лейкоцитами подвергали изопикни-ческому центрифугированию на градиенте плотности урографин - полиглюкин. При этом получали две фракции лейкоцитов: интерфазный слой содержал моноядерные лейкоциты, представленные лимфоцитами и моноцитами, осадок - полиморфноядерные гранулоциты. Клетки отмывали 0,15 М раствором
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕЛОВАНИЙ
е»с»с>^
Таблица. Зависимость активности катепсинов L и Н в плазме и клетках крови больных тромбофлебитом от уровня лейкоцитоза
Активность катепсина L в плазме, нмоль/ч х л Активность катепсина Н в плазме, нмоль/ч х л Активность катепсина L в ПМЯЛ, нмоль/ч х 106 клеток Активность катепсина Н в ПМЯЛ, нмоль/ч х 106 клеток Активность катепсина L в МЯЛ, нмоль/ч х 106 клеток Активность катепсина Н в МЯЛ, нмоль/ч х 106 клеток
Контрольная группа, n = 25 4,15 ± 2,87 5,37 ± 4,57 12,29 ± 7,01 2,63 ± 1,19 23,4 ± 12,9 12,69 ± 3,09
Группа 1, n = 25 5,17 ± 1,79 4,02 ± 1,72 12,22 ± 6,84 4,9 ± 2,18 23,51 ± 12,71 12,14 ± 3,64
Группа 2, n = 15 4,83 ± 1,6 2,84 ± 1,66*,** 25,60 ± 19,19*** 5,69 ± 3,74* 31,44 ± 12,18*** 16,86 ± 4,11
Примечание: *статистически значимые отличия от группы 1 (р < 0,05); **статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05).
хлорида натрия, пропускали через капроновый фильтр и подсчитывали в камере Горяева. Активность катепсинов L и Н изучали спектрофлуориметриче-ским методом по Barrett & Kirschke [8] с измерением продукта реакции, образующегося при расщеплении специфических флюорогенных субстратов. Статистическая значимость полученных результатов рассчитывалась с использованием U-критерия Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
При изучении активности ЛЦП - катепсинов L и Н в плазме и различных фракциях лейкоцитов периферической крови больных тромбофлебитом вен нижних конечностей в зависимости от лейкоцитоза нами были обнаружены следующие тенденции. Среднее значение содержания лейкоцитов у здоровых доноров оказалось равным 5,6 ± 0,9 х 109/л, у пациентов группы 1 -6,7 ± 1,3 х 109/л, у пациентов группы 2 - 10,1 ± 1,6 х 109/л.
В плазме крови пациентов группы 2 наблюдалось снижение активности катепсинов L и Н по сравнению с активностью катепсинов в плазме пациентов группы 1, причём снижение активности катепсина Н явилось статистически значимым (см. таблицу). Полученные данные согласуются с полученными нами ранее результатами изучения концентрации циста-тина С в плазме крови больных тромбофлебитом [6]. Снижение активности ЛЦП в данном случае может быть связано с повышением уровня их внутриклеточного ингибитора цистатина С.
Изучая активность катепсинов L и Н в полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных тромбофлебитом, мы обнаружили, что активность катепсина L повышалась в группе 2 по сравнению с группой 1 (см. таблицу). Данное отличие оказалось статистически значимым. Активность ка-тепсина Н в гранулоцитах имела однонаправленную тенденцию, т. е. повышалась у пациентов группы 2 по сравнению с группой 1, но это повышение оказалось статистически незначимым.
При исследовании активности изучаемых нами ка-тепсинов в моноядерных лейкоцитах больных тромбофлебитом вен нижних конечностей мы получили следующие данные. Активность катепсина L повышалась у пациентов группы 2 (см. таблицу) по сравнению
с пациентами группы 1. Это повышение оказалось статистически значимым. Активность катепсина Н повышалась в моноядерных лейкоцитах пациентов группы 2 по сравнению с пациентами группы 1. Но данное повышение оказалось статистически незначимым.
Проведённое ранее исследование изменений сосудистой стенки при экспериментальном моделировании венозного тромбоза в динамике показало, что уже через 30 мин. после проведения операции в просвете вен наблюдалось краевое стояние лейкоцитов без их миграции в стенку сосуда [4]. На пятые сутки после экспериментально вызванного нарушения венозного кровотока в формирующемся тромбе отмечалось сохранение структуры значительной части эритроцитов, среди которых чётко определялись прослойки фибрина и лейкоциты, количество которых увеличивалось по направлению к месту прикрепления тромба. В стенке вены определялась выраженная полиморфноклеточная воспалительная инфильтрация с наличием лимфоцитов, гистиоцитов, сегментоядерных нейтрофилов. В мышечной оболочке венозной стенки определялись очаговые скопления клеток воспалительного ряда - лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, макрофагов.
Возможно, повышение активности изучаемых нами катепсинов может свидетельствовать об их участии в механизме активации лейкоцитов и в патогенезе тромбофлебита вен нижних конечностей.
Выводы
1. Активность катепсинов L и Н в плазме крови больных тромбофлебитом снижается в зависимости от уровня лейкоцитоза, что может быть связано с увеличением активности эндогенного ингибитора ЛЦП цистатина С.
2. Активность катепсинов L и Н в полиморфноядерных и моноядерных лейкоцитах повышается, что может свидетельствовать об участии лизосомаль-ных цистеиновых протеиназ лейкоцитов в патогенезе тромбофлебита.
Литература
1. Богачёв В.Ю. Об участии лейкоцитов в патогенезе первичных форм хронических заболеваний вен нижних конечностей / В.Ю. Богачёв [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2011. - № 3. - С. 71 - 75.
журнал «Земский Врач» № 6(17)-2012
39
2. Клиническая лабораторная диагностика: Национальное руководство. В 2-х томах / под ред. В.В. Долгова. - Т 1.
3. Коровин М.С. Роль лизосомальных цистеиновых протеиназ в опухолевой прогрессии / М.С. Коровин, В.В. Новицкий, О.С. Васильева // Бюл. Сиб, медицины. - 2009. - № 2. - С. 85-91.
4. Небылицин Ю.С. Структурные изменения сосудистой стенки при экспериментальном моделировании венозного тромбоза/Ю.С. Небылицин[и др.] // Медицинский журнал. - 2007. - №4. - С. 82-86.
5. Поярков И.В. Некоторые патогенетические аспекты венозного тромбоза конечностей // Науки о человеке: Сборник статей по материалам пятого конгресса молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» / под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевич. - Томск, 2004.
6. Фомина Н.В. Изменение концентрации цистатина С в сыворотке крови больных тромбофлебитом глубоких вен нижних конечностей / Н.В. Фомина. М.А. Фомина, А.И. Арапова // Сборник научных трудов по материалам Всероссийской научно-практической конференции «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева». - Рязань, 2012. - С. 336-339.
7. Швальб П.Г. Патология венозного возврата из нижних конечностей / П.Г Швальб, Ю.И. Ухов: монография. - Рязань, 2009. - 152 с.
8. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett, H. Kirschke // in Enzymol. - 1981. - Vol. 80. - P 535-561.
9. Conus S. Cathepsins and their involvement in immune responses / S. Conus, S. Hans-Uwe // Swiss medical weekly. - 2010. - Р 1-12.
10. Liu J. Increased serum cathepsin S in patients with atherosclerosis and diabetes / J. Liu [et al.] // Atherosclerosis. - 2006. - 186. - P 411-419.
11. Suzanne PM. Lutgens. Cathepsin cysteine proteases In cardiovascular disease / PM. Suzanne Lutgens [et al.] // The FASEB Journal. - Vol. 21, October 2007, P 3029-3041.
12. Vasiljeva O. Emerging roles of cysteine cathepsins in disease and their potential as drug targets / O. Vasiljeva [et al.] // Curr. Pharm. Des. - 2007. - Vol. 13.- P 387-403.
Dependence of lysosomal cysteine proteases activity in plasma and blood cells on leukocytosis grade in patients with thrombophlebitis
N.V. Fomina1, M.A. Fomina1, A.A. Tsaregorodtsev2, S.A. Isakov1
1I.P. Pavlov Ryazan State Medical University
2Regional Cardiology Health Center, Ryazan
The paper explores the dependence of lysosomal cysteine proteases (cathepsins L and H) activity in plasma and various leukocytes on leukocytosis grade in patients with leg vein thrombophlebitis. Study shows significant cathepsin L activity raise in polymorphonuclear and mononuclear leukocytes, as well as significant decline of plasma cathepsin H activity in patients with leukocytosis.
Keywords: lysosomal cysteine proteases, polymorphonuclear leukocytes, mononuclear leukocytes, leg vein thrombophlebitis.
—--------е»с»о^э--------—
Рецензия
на статью «Зависимость активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в плазме и клетках крови больных тромбофлебитом от уровня лейкоцитоза» (авторы - Н.В. Фомина, М.А. Фомина, А.А. Царегородцев, С.А. Исаков)
Представленные на рецензирование материалы могут быть отнесены к фундаментальным исследованиям в области биохимии.
Статья посвящена изучению изменения активности лизосомальных цистеиновых протеиназ - катепсинов L и Н в плазме и отдельных фракциях лейкоцитов у больных тромбофлебитом вен нижних конечностей в зависимости от уровня лейкоцитоза.
Актуальность данной статьи не вызывает сомнения, так как до сих пор не сформирована чёткая концепция участия лейкоцитов и ферментов, содержащихся в них, в патогенезе тромбофлебита вен нижних конечностей.
Рецензируемая статья содержит восемь машинописных страниц, включающих в таблицу с экспериментальными данными и список литературы. Результаты, представленные в данной статье, представляют научный интерес, так как впервые дана оценка изменению активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в плазме и отдельных фракциях лейкоцитов у больных тромбофлебитом.
Установлена зависимость между снижением активности катепсинов в плазме от количества лейко-
цитов в периферической крови, а также установлена зависимость между повышением активности ка-тепсинов в клетках крови от лейкоцитоза.
В своих исследованиях авторы использовали достаточно современную спектрофлюориметрическую методику определения активности катепсинов.
В целом статья содержит ряд элементов научной новизны и практической ценности.
ручная статья «Зависимость активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в плазме и клетках крови больных тромбофлебитом от уровня лейкоцитоза» соответствует всем требованиям, предъявляемым к работам такого рода. Данная статья может быть рекомендована к публикации в журнале «Земский врач».
Рецензент:
Заведующий кафедрой факультетской терапии с курсами эндокринологии, общей физиотерапии, клинической фармакологии, профессиональных болезней и военно-полевой терапии, к.м.н., доцент О.М. Урясьев
