CC BY
43
Биомедицина • № 2, 2013, C. 76-82
2. Крыжановский Г.Н. Современная патофизиология как экспериментальная, фундаментальная и интегративная медико-биологическая наука // Вест. Рос. АМН. 1997. № 5. С. 60-62.
3. Bormann I. In Bolk: Hand der
vergleichenden Anatomie der Wirbeltierer 3, 1937.
4. Laguesse E. Structure du pancreas introhepatique cher les poissons // C. R. Acad., 1891. C. 112, 440.
5. Lazarow A, Cooperstein J. Studies on the isolated islet tissue of fish // Biol. Bull. 1951. Vol 100. No 3. P. 191-198.
Modelling of pancreas pathology in fish
G.I. Pronina, N.Yu. Koryagina, A.O. Revyakin, G.D. Kapanadze,
O.I. Stepanova, O.V. Baranova, Yu.B. Lvov
The peritoneum injection of alloxan in doses 50 to 300 mg/kg thresh to juvenile carp causes pancreas pathology. The content of glucose in blood increases in fish of experimental group, the structure of the islets of Langergans is broken.
Key words: pathology modeling, carp, pancreas, the islets of Langergans, alloxan (C4H2N2O4).
Защитные эффекты фармакологического прекондиционирования морфином на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD
Э.Р. Шайхутдинова1,2, О.Н. Хохлова2, Г.А. Слащева2, А.Н. Мурашев2
1 - Пущинский Государственный естественно-научный институт, Пущино
2 - Лаборатория биологических испытаний Филиала Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино
Контактная информация: Шайхутдинова Эльвира Рауильевна, shai78@rambler.ru
Изучена эффективность фармакологического прекондиционирования морфином на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD в сравнении с ишемическим прекондиционированием, а также влияние этих защитных механизмов на размер инфаркта в зависимости от длительности тестовой ишемии.
Ключевые слова: острый инфаркт миокарда, морфин, ишемическое и фармакологическое прекон-диционирование, крысы CD.
В 1986 г. С.Е. Murry с соавт. обнаружили кардиопротективный феномен, названный ишемическим прекондициони-рованием (ИПК). Суть его заключается в том, что после серии кратковременных периодов ишемии сердце приобретает повышенную устойчивость к повреждающему действию длительного нарушения коронарного кровотока, что проявляется в уменьшении объема зоны некроза. В последующие годы было выяснено, что инициирование адаптационных механизмов ИПК возможно с помощью правильно подобранных фармакологических подходов, имитирующих защитные эффекты прекондиционирования миокарда без использования ишемических стимулов. Так, морфин может мимикрировать защитный эффект ИПК [9]. В 1996 г. было показано, что и ИПК, и фармакологическое пре-кондиционирование морфином повышает устойчивость сердца к повреждающему действию длительного нарушения коронарного кровотока [3, 7, 8].
Т акже большой теоретический и практический интерес представляет исследование противоишемической эффективности прекондиционирования в зависимости от длительности тестовой ишемии [6]. Для этого были выполнены эксперименты, в которых инфаркт-лимитирующий эффект ишемического и фармакологического прекондиционирования морфином изучался при продолжительностях последующей ишемии 25 и 40 мин.
В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение защитных эффектов фармакологического прекондицио-нирования морфином на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD в сравнении с ишемическим прекондиционирова-нием, а также эффективности этих механизмов в зависимости от длительности тестовой ишемии.
Материалы и методы
В экспериментах были использованы животные SPF-статуса, полученные из Питомника лабораторных животных ФИБХ РАН, г. Пущино. Животные содержались в стандартных условиях (температура 21±3°C, влажность 30-70%, 12-час период освещения, корм и вода — ad libitum). Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с требованиями Институтской Комиссии ФИБХ РАН по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных.
На аутбредных самцах крыс Sprague-Dawley (300-350 г) под уретановым наркозом (1,5 г/кг, внутрибрюшинно) моделировали острый инфаркт миокарда окклюзией левой коронарной артерии (ЛКА) с последующей реперфузией, при искусственной вентиляции легких с частотой дыхания 60-65 в мин и дыхательным объемом 10 мл на 1 кг массы тела (Rodent Ventilator UGO BASILE 7025). Среднее артериальное давление (СрАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) в течение эксперимента измеряли электроманометром через катетер, введенный в бедренную артерию. Регистрация и обработка сигнала производилась с помощью программного обеспечения «HemoDynamics» версия 1.1. (ИБК РАН, Россия). Введения веществ осуществляли через катетер, имплантированный в бедренную вену.
Для оценки защитных свойств морфина в сравнении с ишемическим преконди-ционированием животных подвергали 25мин окклюзии ЛКА с последующей 2-час реперфузией. За 30 мин до окклюзии крысы получали три 5-мин инфузии морфина (20 мкг/кг/мин), разделенные 5-мин периодами (группа ФПК-«фармакологическое прекондиционирование»), или три 5-мин коронароокклюзии, разделенные меж-
ду собой 5-мин эпизодами реперфузии (группа ИПК — «ишемическое прекон-диционирование»). Контролем служили животные, у которых моделировали окклюзию-реперфузию без дополнительных вмешательств.
При исследовании эффективности фармакологического и ишемического прекондиционирования в зависимости от длительности тестовой ишемии использовали те же схемы экспериментов, но окклюзия ЛКА длилась 40 мин. Каждая экспериментальная группа включала 8 животных.
Определение размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта производили с помощью методики «двойного окрашивания» 2% метиленовым синим и 1% трифенилтетразолием хлоридом (ТТХ). После окончания реперфузии вокруг коронарной артерии вновь затягивали лигатуру и внутривенно вводили раствор метиленового синего до визуализации границы между кровоснабжаемыми и ишемизированными отделами. Далее сердце быстро удаляли, отмывали в физиологическом растворе и разрезали в поперечном направлении на пять срезов одинаковой толщины. Полученные срезы инкубировали в течение 15 мин в растворе
ТТХ при температуре 37°C и рН 7,4, затем фиксировали 5 мин в 10% формалине. После этого изображения базальных поверхностей срезов фотографировали цифровой камерой SONY DXC-107AP, соединенной с фотографическим устройством микроскопа OLYMPUS SZ40. Компьютерную обработку изображений осуществляли с использованием программы Image TOOL. Общую площадь инфаркта вычисляли по пяти срезам и представляли в процентном отношении от площади зоны риска. Затем таким же способом как и в случае зоны инфаркта вычисляли площадь анатомической зоны риска от общей площади левого желудочка для данного сердца.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 7 for Windows. Данные представляли в виде «среднее ± стандартное отклонение», изменения исследуемых показателей считали статистически значимыми при Р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Показатели системной гемодинамики, а именно СрАД и ЧСС животных во время проведения эксперимента представлены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели системной гемодинамики в экспериментальных группах
СрАД, мм.рт.ст. ЧСС, уд/мин
Группы исходно конец окклюзии конец реперфузии исходно конец окклюзии конец реперфузии
25 мин окклюзии ЛКА
Контроль 84,3±4,2 64,5±5,8* 48,0±3,5* 291,8±11,5 364,9±19,0* 401,5±14,2*
ФПК 83,8±2,5 56,5±3,9* 56,3±6,8* 319,9±17,4 338,6±28,4 373,4±15,9*
ИПК 79,0±2,5 60,0±2,4* 52,8±6,8* 291,1±16,8 317,6±13,0 318,6±23,1#
40 мин окклюзии ЛКА
Контроль 77,3±3,5 58,6±3,6* 53,3±3,2* 296,1±11,2 415,3±28,9* 441,5±25,6*
ФПК 83,5±2,1 69,6±3,4* 70,3±3,5*, * 326,1±17,1 379,3±23,0 358,6±12,5*
ИПК 75,9±5,3 59,3±4,1* 60,1±4,4*, * 270,7±6,3 357,9±14,2* 368±10,0*, *
Примечание: исходно — после имплантации артериального катетера; конец окклюзии — 25-я или 40-я мин после окклюзии ЛКА; конец реперфузии — в конце эксперимента;
* — Р<0,05 относительно исходных данных, # — Р<0,05 — относительно контрольной группы.
Исходно эти параметры достоверно не различались во всех группах. При 25мин окклюзии ЛКА во всех трех группах к концу окклюзии наблюдалась гипотензия, а рефлекторная тахикардия на снижение АД была обнаружена только в контрольной группе. К концу реперфу-зионного периода в контроле сохранялась гипотензия и тахикардия по сравнению с исходными значениями. В группе «фармакологическое прекондиционирование» (ФПК) к концу эксперимента АД оставалось сниженным и возрастала частота сердцебиений, в группе «ишемическое прекондиционирование» (ИПК) также наблюдалось гипотензия, ЧСС же оставалась на исходном уровне и статистически значимо отличалась от величин контрольной группы на 120-й мин реперфузии. При 40-мин окклюзии ЛКА среднее АД в группах снижалось к концу окклюзии и оставалось сниженным до конца эксперимента, у контрольных животных величи-
при этом возникала как в контроле, так и в группе «ИПК» на протяжении всего окклюзионно-реперфузионного периода, причем на 120-й мин реперфузии частота сердцебиений у контрольных животных была достоверно выше, чем в двух других группах. При фармакологическом прекондиционировании морфином повышение ЧСС было менее выражено во время эксперимента. То есть ишемическое и морфиновое прекондиционирование уменьшило частоту развития тахикардий в реперфузионный период и предотвратило снижение артериального давления по сравнению с контролем при 40-мин окклюзии ЛКА (табл. 1).
Определение анатомической зоны риска не выявило отличий в группах, ее размер составил с 33,0± 1,7 до 39,3±3,2% от общей площади левого желудочка, что свидетельствует об одинаковом объеме миокарда, подвергшегося ишемии (табл. 2).
Таблица 2
Размер анатомической зоны риска, выраженный в процентах от общей поверхности левого желудочка
Группы 25 мин окклюзии ЛКА 40 мин окклюзии ЛКА
Контроль 35,0±2,6% 39,3±3,2%
ФПК 33,1±2,1% 36,6±1,9%
ИПК 36,3±2,8% 35,5±1,6%
на этого показателя в конце реперфузии В то же время, размер зоны инфаркта была достоверно ниже, чем в группах был различным в зависимости от усло-с прекондиционированием. Тахикардия вий эксперимента (рис., табл. 3). Так,
при 25-мин окклюзии ЛКА применение морфина в группе «ФПК» приводило к статистически достоверному снижению размера инфаркта до 33,3±2,7% (относительно контроля 42,9±2,7%). Ишемическое прекондиционирование также оказывало инфаркт-лимитирующее действие и уменьшало зону инфаркта еще более эффективно (14,1 ±4,1 %, Р<0,05).
Исследование защитного действия прекондиционирования при более длительной 40-мин ишемии ЛКА выявило достоверное увеличение зоны инфаркта в сравнении с 25-мин окклюзией во всех экспериментальных группах. В контрольной группе размер инфаркта
составил 55,2±2,5% (Р<0,05 относительно 25-мин окклюзии ЛКА). В группе «ИПК» зона инфаркта достоверно увеличивалась вдвое, с 14,1±4,1% до 30,6±3,3%, защитный эффект прекон-диционирования при этом сохранялся. Морфин также оказывал кардиопро-тективное действие, размер инфаркта составлял 45,1±1,8% (Р<0,05 относительно контроля).
Сравнивая эффекты фармакологического и ишемического прекондицио-нирования при 25- и 40-мин окклюзии, можно заметить достоверную разницу в размерах инфаркта миокарда между этими группами. Эти результаты подтверждают, что опыты, выполненные
□ контроль
0 фармакологическое прекондиционирование ЗИ/ЗР. “о И ишемическое прекондиционирование
60 -|
50 -40 -30 -20 -10 -0 .
25-минутная окклюзия ЛКА 40-минутная окклюзия ЛКА
Рис. Защитные эффекты фармакологического и ишемического прекондиционирования при разной продолжительности окклюзии левой коронарной артерии (ЛКА). Зона инфаркта (ЗИ) выражена в процентах от зоны риска (ЗР).
* — Р<0,05 относительно контроля при 25-минут-ной окклюзии ЛКА;
# — Р<0,05 относительно контроля при 40-минут-ной окклюзии ЛКА;
Д — Р<0,05 относительно группы «ишемическое прекондиционирование».
Таблица 3
Данные для построения рисунка
Группы Контроль ИПК ФПК
Mean SEM Mean SEM Mean SEM
25-мин окклюзия ЛКА 42,9 2,7 14,1 4,1 33,3 2,7
40-мин окклюзия ЛКА 55,2 2,5 30,6 3,3 45,1 1,8
с применением фармакологических агентов, нельзя считать воспроизведением классического феномена прерывистой ишемии, поскольку ишемическими стимулами мы воспроизводим именно ишемию клеток, а фармакологическими препаратами — лишь их гипоксию [2]. Возможно, при фармакологических подходах запускаются определенные пути защиты, действующие на эффекторы, которые активизируют внутриклеточные сигнальные процессы и приводят к изменениям в метаболизме, облегчающим выживание миоцитов в условиях длительной ишемии. Например, известно, что основные механизмы защиты миокарда с помощью морфина связаны с активацией АТФ-зависимых К+-каналов [4]. При ишемическом же преконди-ционировании реализуются все возможные арсеналы, обеспечивающие толерантность сердца к ишемии — от изменения эффективности и скорости метаболических реакций, использующих АТФ, до образования целого ряда эндогенных триггеров, взаимодействующих с рецепторами кардиомиоцитов и далее активирующих разные пути проведения внутриклеточного сигнала, в которых участвуют медиаторы и вторичные посредники ишемического прекондиционирования ^-изоформа протеинкиназы С и АТФ-зависимые К+-каналы), или прямо влияющих на
активность ферментов [1]. Тем не менее, в литературе имеются сообщения о более эффективном кардиопротек-тивном действии морфина. Так, в экспериментах Schultz с соавт. [7] было показано, что морфиновое преконди-ционирование почти полностью воспроизводит эффект ишемического. Трудно сказать, в чем причина различий между результатами наших исследований и подобными данными. Возможно, это связано с использованием крыс разных линий, применением разных средств для наркоза [5].
Выводы
Таким образом, в результате наших исследований было показано, что фармакологическое прекондициониро-вание морфином оказывает инфаркт-лимитирующее действие как при 25мин, так и при более длительной 40-мин окклюзии ЛКА, но защитный эффект морфина в схеме, идентичной ишемическому прекондиционированию, оказывается слабее.
Список литературы
1. Писаренко О.И. // Кардиология. 2005. № 9. С. 62-72.
2. Сидоренко Г.И, Гурин А.В. // Кардиология. 1997. № 10. С. 4-15.
3. Ela C.,Barg J, Vogel Z, et al. // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997. V. 29. Р. 711-720.
4. Fryer RM, Hsu A.K, Nagase H, et
al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. v. 294(2), P. 451-457.
5. Jugdutt BI, Joljart MJ,Khan MI. // Circulation. 1996. V. 94. P. 94-101.
6. Riess M.L, Stowe D.F, Warltier D.C. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003. V. 286. P. 1603-1607.
7. Schultz JE, Hsu A.K, Gross GJ. // Circ. Res. 1996. V. 78. P. 1100-1104.
8. Schultz JJ, Hsu A.K, Gross GJ. // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997. V. 29. P. 2187-2195.
9. Wang T.L, Chang H, Hung C.R., et
al. // Cardiovasc. Res. 1998. V. 40. P. 557-563.
Protective effect of pharmacological preconditioning by morphine on acute myocardial infarction in CD rats
E.R. Shaykhutdinova, O.N. Khokhlova, G.A. Slashcheva, A.N. Murashev
The peritoneum injection of alloxan in doses 50 to 300 mg/kg thresh to juvenile carp causes pancreas patEfficiency pharmacological preconditioning with morphine on model of an acute myocardial infarction at CD rats in comparison with ischemic preconditioning and also influence of these protective mechanisms on the infarct size depending on duration of a test ischemia is studied.
Key words: morphine, ischemic and pharmacological preconditioning, CD rats.
EHOMeg^HHa № 2, 2013
82
