CC BY
24
УДК 631.4:632.911.2
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПРОРОСТКАМ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА*
Н.А. Куликова, О.И. Филиппова, И.В. Перминова
Проведена сравнительная оценка защитного действия гуминовых веществ угля и торфа по отношению к проросткам мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) (частичное снижение их угнетения) в условиях водного дефицита, вызываемого гиперосмотическим раствором ПЭГ-6000. Защитное действие гуминовых веществ усиливается при увеличении содержания в них фенольных фрагментов, что может указывать на их анти-оксидантную активность как основной механизм протекторной активности в данных условиях.
Ключевые слова: гуминовые вещества, защитное действие, водный дефицит.
Введение
Гуминовые вещества (ГВ) выполняют в биосфере ряд важных экологических функций: аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную [6]. В последнее время особую актуальность приобретает исследование защитной функции ГВ, так как установление механизма их протекторной активности позволяет не только более эффективно использовать существующие гуминовые стимуляторы роста растений в сельском хозяйстве, но и разрабатывать на их основе адаптогены, помогающие растениям противостоять неблагоприятным факторам окружающей среды.
Один из основных стрессоров, препятствующих получению высоких урожаев, — водный дефицит, возникающий во время засух [16]. По существующим расчетам, климатические зоны, в которых вероятно их возникновение, занимают около 47,5% суши Земли. В России площадь сухих и засушливых регионов с отношением осадков к потенциальной эвапотранспирации < 0,65 составляет более 610 км2 [2]. Часто выведение новых сортов, обладающих высоким уровнем осморегуляции, т.е. толерантных к засухе, оказывается малоперспективным в связи с их невысокой продуктивностью [4]. Поэтому проведение исследований, направленных на систематическое изучение защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях водного дефицита, весьма актуально.
Цель работы — сравнительная оценка защитного действия гуминовых веществ угля и торфа по отношению к проросткам мягкой пшеницы Ш-ticum aestivum Ь. в условиях водного дефицита и поиск связей между основными физико-химическими характеристиками ГВ и их протекторной активностью.
Объекты и методы исследования
В работе использовали гуминовые (ГК), фуль-вокислоты (ФК) и гиматомелановые (ГМК) кислоты, выделенные из угля и торфа, так как эти ка-устобиолиты являются основными источниками получения промышленных гуматов, предназначенных для применения в сельском хозяйстве в качестве регуляторов роста растений. Торфяные ГВ выделяли 0,1 М NaOH [8], разделяли на ГК (ГКТ и ГКТ1) и ФК (ФКТ) с помощью HCl (до рН 2) с последующим отделением фракции ФК на смоле Амберлит XAD-2. ГВ угля получали с помощью 0,1 М NaOH [12] с разделением на ГК (ГКУ) и ФК (ФКУ), как описано выше. ГМК (ГМКУ) экстрагировали этанолом из свежеосажденных гуминовых кислот. Препараты ГВ обессоливали методом электродиализа.
Элементный состав исследуемых ГВ (табл. 1) определяли на CHN-анализаторе Carlo Erba Stru-mentazione-1106 (Италия), их зольность — путем сожжения в кварцевой трубке (850°С, 40 мин). Содержание кислорода рассчитывали по разнице между массой навески и суммарным содержанием золы и СНЫ. Молекулярную массу ГВ (табл. 1) определяли с помощью эксклюзионной хроматографии, согласно существующей методике [19]. Фракционирование препаратов осуществляли на колонке, заполненнойгелемToyopearl-HW-50(S) (Япония); в качестве калибровочных веществ использовали полидекстраны с известной молекулярной массой. На основании получаемых гель-хроматограмм рассчитывали средневесовую молекулярную массу(М^) по программе GelTreat [17].
Определение структурно-группового состава ГВ (табл.2) проводили методом 13С ЯМР-спект-роскопии [3]. Все 13С ЯМР-спектры регистриро-
* Работа (в части выделения и характеристики гуминовых веществ) выполнена при поддержке РФФИ, проект № 16-04-01753А.
Таблица 1
Гуминовые вещества и их основные физико-химические характеристики
ГВ Содержание, % масс. Атомное отношение Mw, кД
C H N O H/C O/C C/N
Уголь
ГКУ 60,7 4,7 1,4 33,3 0,93 0,41 53 48,2
ФКУ 62,5 4,6 2,1 30,8 0,89 0,37 35 31,1
ГМКУ 42,7 2,8 3,3 42,2 0,82 0,50 15 20,5
Торф
ГКТ 54,6 4,2 2,3 37,9 0,92 0,52 28 17,2
ГКТ1 55,2 4,3 2,4 37,1 0,93 0,50 27 28,1
ФКТ 53,6 3,9 0,5 41,0 0,86 0,57 127 9,8
вали на ЯМР-спектрометре VXR-400 («Varian») на рабочей частоте 400 МГц. Содержание углерода различных типов определяли интегрированием соответствующих спектральных областей (ppm): 220—185 — кетонных и хинонных групп (Сс=о); 185—167 — карбоксильных и сложноэфирных групп (Ссоо); 167—145 — кислородзамещенных ароматических фрагментов (Сдг—о); 145—108 — водород-и углеродзамещенных ароматических фрагменов (CAr); 108—90 — алифатических фрагментов, дважды замещенных гетероатомами (Coco); 90—50 — метоксильных и кислородзамещенных алифатических фрагментов (CAik—o); 50—5 — углерод- и водо-родзамещенных алифатических фрагментов (CAik).
Гуминовые вещества, а также характеристики их основных физико-химических свойств (табл. 1 и 2) любезно предоставлены проф. И.В. Перминовой (химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова).
Оценку влияния гуминовых веществ на растения в условиях водного стресса проводили методом проростков с использованием в качестве тест-культуры пшеницы мягкой Triticum aestivum L. сорта Московская-39 [15]. Семена пшеницы, помещен-
ные в чашки Петри с предварительно внесенными туда испытуемыми растворами, ставили в термостат на 72 ч при температуре 24°. После этого измеряли длину корней и побегов проростков, на основании чего судили о стимулирующем или угнетающем действии растворов. Контроль — дистиллированная вода. Для создания водного дефицита использовали раствор по-лиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ-6000), являющегося гиперосмотическим. Рабочую концентрацию выбирали на основании предварительно проведенных экспериментов: она составила 100 г/л (осмотическое давление —0,15 МПА [18]). Защитное действие оценивали при постоянной концентрации ПЭГ-6000 и разных концентрациях ГВ в диапазоне 5—100 мг/л. Для оценки собственной физиологической активности ГВ параллельно тестировали их в тех же концентрациях, но без добавления ПЭГ-6000; рН всех растворов составлял 5,5 (в случае ГВ для его установления использовали 0,1 M HCl). Повторность пятикратная. Статистическая обработка включала в себя расчет среднего и стандартного отклонения; для оценки значимости различий использовали двухфакторный дисперсионный анализ (факторы — препарат и концентрация) с последующим расчетом НСР; поиск взаимосвязи между физико-химическими характеристиками ГВ и их протекторной активностью проводили с помощью корреляционного анализа. Расчеты осуществляли в программе MicrosoftR Office Excel 2003.
Результаты и их обсуждение
Проведенные эксперименты показали, что в физиологических условиях роста (т.е. без стресса) гу-миновые вещества не обладают выраженной стимулирующей активностью по отношению к проросткам пшеницы. Во всех случаях увеличение длины корней и побегов проростков в водных растворах ГВ не превышает 107% от контрольных величин и статистически значимо (а = 0,05) от них не отличается.
В условиях водного дефицита зафиксировано статистически значимое (а = 0,05) снижение длины побегов проростков до 80% от значений в контрольном варианте. В случае корней статистически значимого угнетения роста не наблюдается (93% от контроля). Это свидетельствует о том, что корни растений менее чувствительны к осмотическому стрессу, чем побеги. Известно, что продолжающийся при умеренном водном дефиците рост корней является результатом их быстрой осмотической адаптации, ко-
Таблица 2
Распределение углерода по структурным фрагментам, процент от его общего содержания
ГВ CC=O CCOO CAr—O CAr COCO CAlk—O CAlk
Уголь
ГКУ 5,7 19,0 12,8 49,9 1,1 0,9 10,5
ФКУ 5,8 19,8 11,3 31,5 3,9 7,4 20,3
ГМКУ 4,4 17,1 7,8 43,7 7,8 2,2 14,4
Торф
ГКТ 3,6 9,8 8,6 29,7 4,5 19,7 24,1
ГКТ1 2,3 12,8 6,7 32,2 4,3 19,7 22,0
ФКТ 1,7 11,3 4,6 20,9 5,7 35,4 20,4
Рис. 1. Влияние гуминовых веществ на длину побегов (а) и корней (б) проростков пшеницы в условиях водного дефицита,
создаваемого ПЭГ-6000 в концентрации 100 г/л
торая позволяет им частично восстановить тургор и поддерживать клеточные стенки в рыхлом состоянии [4]. В побегах, напротив, выраженное инги-бирование скорости роста обусловлено снижением растяжимости стенок растущих клеток, что связано с инактивацией Н+-АТФазы плазматических мембран и, как следствие, нарушением подкисле-ния клеточных стенок, что является необходимым условием возможности их растяжения при росте [4].
Внесение гуминовых веществ способствует адаптации растений к водному дефициту. При концентрациях ГВ 5—10 мг/л отмечается увеличение длины как побегов (рис. 1, а), так и корней (рис. 1, б). При дальнейшем повышении концентрации ГВ наблюдается снижение длины побегов до контрольных величин, а корней — либо рост, либо стабилизация положительного действия. Исключение составляют ФК торфа и ГК почвы, для которых не зарегистрировано значительное положительное влияние на рост корней в присутствии ПЭГ-6000 во всем диапазоне исследованных концентраций.
Результаты дисперсионного анализа показали, что значимое влияние на длину побегов проростков оказывает выбранный препарат ^ = 5,1; Fкриx(0,05) = 2,7), но не его концентрация ^ = 1,95; Fкриx(0,05) = 2,87). Поэтому для сравнения действия ГВ использовали величины, соответствующие среднему значению длины корней или побегов проростков в процентах от контроля (табл. 3).
Как видно из табл. 3, если в качестве основного тест-отклика рассматривать длину побегов проростков, то внесение ГВ не приводит к снижению негативного действия ПЭГ-6000 на растения (исключение — ГКУ). В то же время показано, что в данных условиях они способны значимо стимулировать рост корней. Это хорошо согласуется с результатами других исследователей, также отмечавших увеличение физиологической активности ГВ в стрессовой ситуации [1, 11, 20]. С другой стороны, наблюдаемое усиление роста корней хорошо
согласуется с установленным фактом, что одним из основных адаптивных механизмов выживания растений при водном дефиците является именно стимуляция роста корневой системы [5]. Известно, что в условиях снижения доступности воды у растений доля массы корней в биомассе растений повышается [4].
Величина положительного эффекта зависит от типа гуминовых веществ (табл. 3). Наиболее выраженное благоприятное действие отмечено для угольных ГВ, имеющих максимальное содержание углерода кетонных и хинонных групп (Сс=о) и углерода кислородзамещенных ароматических фрагментов (Саг—о) (табл. 2). Отсутствие эффекта во всем диапазоне концентраций наблюдается для ФК торфа, которая обладает минимальным содержанием угле-
Таблица 3
Влияние гуминовых веществ на длину побегов и корней проростков пшеницы в условиях водного дефицита, создаваемого ПЭГ-6000 в концентрации 100 мг/л
ГВ Длина, % от контроля
побеги корни
Контроль (без ГВ) 80 ± 3 93 ± 4
Уголь
CHA-Pow 89 ±4 120 ± 3
CFA-GL02 86 ± 4 111 ± 4
CHM-GL02 85 ±4 108 ± 3
Торф
PHA-T498 83 ±3 103 ± 3
PHA-T598 86 ±3 112 ± 4
PFA-T498 83 ± 3 103 ± 3
НСР(0,05) 7,0 8,0
Примечание. ± — стандартное отклонение, n = 5.
120
80 -1-1-1-1-
4 6 8 10 12 САг_0, %
• побеги »корни
Рис. 2. Зависимость длины корней и побегов проростков пшеницы в условиях водного дефицита, создаваемого ПЭГ-6000 в концентрации 100 г/л, от содержания углерода кислород-замещенных ароматических фрагментов (САг—о) в гумино-вых веществах
рода ароматических фрагментов (Са) (табл. 2). Сопоставление эффектов от внесения ГВ (табл. 3) и их физико-химических характеристик (табл. 1 и 2) показало, что существует положительная прямая корреляционная взаимосвязь между защитным действием гуминовых веществ и содержанием в них углерода кислородзамещенных ароматических фрагментов (Сдг—о) (рис. 2). Коэффициент корреляции (г) для пары «Сдт—о — длина корней» составляет 0,75 (значим при а = 0,10).
Выводы
Полученные результаты позволяют высказать предположение об усилении защитного действия гуминовых веществ по отношению к растениям в условиях водного дефицита при увеличении содержания в них фенольных фрагментов. Принимая во внимание тот факт, что наблюдаемый положительный эффект от внесения ГВ не может быть обусловлен их связыванием с ПЭГ-6000, который, как и они, представляет собой отрицательно заряженный полиэлектролит, можно предположить, что гуминовые вещества обладают способностью снижать негативное действие водного дефицита благодаря непосредственному влиянию на растения.
К настоящему времени известно, что снижение содержания воды в клетках при водном дефиците вызывает, с одной стороны, различные нарушения в структуре и функциях биополимеров (денатурация белков, подавление ферментативной активности), а с другой — нарушение целостности ли-пидного бислоя мембран [9]. Для извлечения воды из окружающей среды необходимо, чтобы водный
потенциал клеток корня был ниже, чем водный потенциал среды. Поэтому одним из основных способов адаптации растений к засухе является снижение внутриклеточного водного потенциала за счет повышения внутриклеточного осмотического давления (осморегуляция). Для этого растения вырабатывают несколько механизмов защиты, включая синтез осмолитов (пролин, глицин-бетаин, маннитол и др.), Хеа-белков, шаперонов, протеаз и убикви-тинов [9]. Однако индукция синтеза этих веществ — процесс высокоспецифичный, и прямого доказательства влияния ГВ на него в настоящее время не существует. Поэтому можно предположить, что природа защитного действия гуминовых веществ в условиях водного дефицита определяется, скорее всего, их влиянием на целостность мембранных структур. Действительно, водный дефицит, как и другие стрессы, наряду со специфическими ответными реакциями растительного организма, связанными с типом вызывающего их стрессора, приводит также к неспецифическим реакциям, а именно, к сверхпродукции активных форм кислорода (АФК) [7]. Избыточная продукция АФК вызывает повреждение липидной компоненты мембран вследствие процесса перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ), поэтому у растений синтезируется целый ряд антиоксидантов, обладающих способностью тушить АФК. Основными растительными антиоксидантами являются различные фенольные и полифенольные соединения, включая флавоно-иды, фенольные кислоты и стильбены [13]. Химическая структура ГВ (прежде всего, наличие фе-нольных радикалов) позволяет предполагать у них наличие антиоксидантых свойств, которые многократно освещены в литературе [10, 14]. Следовательно, можно предположить, что защитное действие ГВ обусловлено содержанием в их структуре фе-нольных компонентов, обеспечивающих антиок-сидантную активность. Однако для подтверждения высказанного предположения необходимо проведение дополнительных исследований, направленных на изучение мембранотропных свойств ГВ.
Проведенные эксперименты показали, что гу-миновые вещества способны частично снижать угнетение проростков пшеницы при водном дефиците, вызываемом гиперосмотическим раствором ПЭГ-6000. Защитное действие ГВ усиливается при увеличении содержания в них фенольных фрагментов, что может указывать на антиоксидантную активность этих веществ как основной механизм протекторной активности в условиях водного дефицита.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гу-миновые вещества. Строение, функции, механизм действия, протекторные свойства, экологическая роль // Киев, 1995.
2. Деградация и охрана почв / Под ред. Г.В. Добровольского. М., 2002.
3. Ковалевский Д.В., Пермин А.Б., Перминова И.В., Петросян В.С. Выбор условий регистрации количест-
венных 13C ЯМР-спектров гумусовых кислот // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. № 41.
4. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур: Учебник. М., 2010.
5. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений: Учебник. М., 2006.
6. Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере. М., 1993.
7. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. М., 2007.
8. Технический анализ торфа. М., 1992.
9. Физиология растений: Учебник для студ. вузов. М., 2005.
10. Aeschbacher M., Graf C, Schwarzenbach R.P., Sander M. Antioxidant properties of humic substances // Environ. Sci. Technol. 2012. Vol. 46.
11. Dunstone R.L., Richards R.A., Rawson H.M. Variable responses of stomatal conductance, growth, and yield to fulvic acid applications to wheat // Aust. J. Agricult. Res. 1988. Vol.39.
12. Fong S.S. Characterization of the coal derived humic acids from Mukah, Sarawak as soil conditioner // J. Braz. Chem. Soc. 2006. Vol. 17, N 3.
13. Fujita M, Fujita Y, Noutoshi Y.et al. Cross talk between abiotic and biotic stress responses: a current view from the points of convergence in the stress signalling networks // Curr. Opin. Plant Biol. 2006. Vol. 9.
14. Klein O.I., Kulikova N.A., Filimonov I.S. et al. Long-term kinetics study and quantitative characterization of the antioxidant capacities of humic and humic-like sub-stances//J. Soils Sedim.2016.Doi:10.1007/s11368-016-1538-7.
15. Klein O.I., Kulikova N.A., Konstantinov A.I. et al. Transformation of humic substances of highly oxidized brown coal by basidiomycetes Trametes hirsuta and Trametes maxima // Appl. Biochem. Microbiol. 2013. Vol. 49, N 3.
16. Krol A., Amarowicz R., Weidner S. Changes in the composition of phenolic compounds and antioxidant properties of grapevine roots and leaves (Vitis vinifera L.) under continuous of long-term drought stress // Acta Physiol. Plant. 2014. N36.
17. Kudryavtsev A.V., Perminova I.V., Petrosyan V.S. Size-exclusion chromatographic descriptors of humic substances // Anal. Chim. Acta. 2000. Vol. 407, N 1—2.
18. Michel B.E., Kaufmann M.R. The osmotic potential of polyethylene glycol 6000 // Plant Physiol. 1973. Vol.51.
19. Perminova I.V., Frimmel F.H., Kovalevskii D.V. et al. Development of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances // Water Res. 1998. N32.
20. Zhang X., Ervin E.H., Schmidt R.E. Plant growth regulators can enhance the recovery of Kentucky bluegrass sod from heat injury // Crop Sci. 2003. Vol. 43.
Поступила в редакцию 12.09.2017
PROTECTIVE ACTIVITY OF HUMIC SUBSTANCES IN RELATION
TO WHEAT SEEDLINGS UNDER WATER DEFICIENCY CONDITIONS
N.A. Kulikova, O.I. Filippova, I.V. Perminova
A comparative evaluation of the protective effect of humic substances (HS) derived from coal and peat towards the seedlings of soft wheat Triticum aestivum L. under water deficiency conditions. Experiments have shown that HS were able to reduce in part the inhibition of wheat seedlings under water deficit caused by hyperosmotic solution of PEG-6000. The protective effect of HS was shown to enhance when the content of phenolic fragments increases; the latter might indicate the antioxidant activity of HS was the main mechanism of the protective activity of HS under water deficiency conditions.
Key words: humic substances, protective activity, water deficiency.
Сведения об авторах
Куликова Наталья Александровна, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. общего земледелия и агроэкологии ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова, Ин-та биохимии РАН им.А.Н.Баха (Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН). E-mail: knat@darvodgeo.ru. Филиппова Ольга Игоревна, инженер-лаборант I категории каф. общего земледелия и агроэкологии ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: philolga@mail.ru. Перминова Ирина Васильевна, докт. хим. наук, вед. науч. сотр. каф. медицинской химии и тонкого органического синтеза химического ф-та МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: iperm@org.chem.msu.ru.
