CC BY
28
Л.В. Шуленина, В.Ф. Михайлов, B.C. Калистратова, A.A. Иванов, A.C. Самойлов
Замедление вакциной «Гриппол» радиационно-индуцированного развития опухолей молочной железы у крыс: роль микроРНК
ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, г. Москва
L.V. Shulenina, V.F. Mikhailov, V.S. Kalistratova, A.A. Ivanov, A.S. Samoilov
The "Grippol" vaccine in rats, shows growth inhibition in radiation-induced mammary tumors: the role of microRNA
State Scientific Research Center n.a. A. I. Burnazyan — Federal Medical Biophysical Center
of Federal Medical Biological Agency, Moscow
Ключевые слова: вакцина «Гриппол», крысы, ради- Keywords: vaccine "Grippol", rats, radiation
ационный канцерогенез, молочная железа, кост- carcinogenesis, mammary gland, bone marrow, the
ный мозг, опухолевый супрессор р53, микроРНК. tumor suppressor p53, microRNA.
На модели белых аутбредных крыс-самок, подвергавшихся острому облучению в дозе 2,5 Гр, исследовали возможность повышения вакциной «Гриппол» резистентности к радиационно-индуцированному развитию опухолей и участие микроРНК (ш\В) в механизмах реализации такого действия вакцины. Установлено, что при введении вакцины «Гриппол» за 2 недели до облучения латентный период появления опухолей молочной железы достоверно удлинялся. Повторное введение вакцины «Гриппол» через 2 недели и через 6 месяцев после облучения животных не приводило к усилению защитного действия. Молекулярные исследования показали, что в опухолях молочной железы, образующихся спонтанно, а также после радиационного воздействия, снижается транскрипционная активность гена р53 и многократно увеличивается экспрессия зрелых т^В^-12^5Ъ, Ш-7г, miR-21. Эти изменения способствуют снижению эффективности функционирования р53-зависимой системы поддержания стабильности генома. В костном мозге крыс достоверное снижение экспрессии р53 и miR-34c наблюдали лишь в период, предшествующий появлению каких-либо опухолей у крыс (75-е сутки). Иммунизация животных предотвращала в этот период развитие дисбаланса зрелых miR, модулирующих работу р53-системы. На 315-е сутки после облучения в костном мозге, в отличие от молочной железы, изменений экспрессии р53, mdm2, mdm4 и определяемых нами miR не наблюдалось. На 550-е сутки в костном мозге крыс, подвергавшихся радиационному воздействию, обнаружена высокая
On the model of white outbred female rats, exposed to acute radiation in the dose of 2.5 Gy, we studied the option to inhibit radiation-induced mammary tumors growth, using "Grippol" vaccine based on the miRNAs mechanisms. It has been proven that the introduction of the «Grippol» vaccine two weeks prior the exposure, postpones the tumor development. Repeated administration of the "Grippol" vaccine in 2 weeks and 6 months after the exposure does not provide the mentioned "shielding effect". Molecular studies have shown that it is common for spontaneous and radiation-induced mammary gland tumors, have decreases transcription activity in gene p53 and increases expression of mature miR-125b, let-7i, miR-21. These changes worsen the function of p53-dependent system that maintains genome stability. Significant reduction p53 and miR-34c expression in bone marrow was observed only during the period prior to any tumor formation in rats (75 days after radiation). Immunization of animals prevented imbalance in mature microRNA, modulating thep53-system work during this period. The changes of p53, mdm2, mdm4 expression and microRNA were not observed in 315 days after irradiation in rats' bone marrow, yet they were present in mammary gland tumors. High expression of miR-125b, miR-21, miR-16-2, let-7i was found in the bone marrow of rats on 550 days after radiation exposure. The presented results demonstrate the importance of the balance indicators of p53-dependent genome stability systems to reduce the risk of radiogenic carcinogenesis.
экспрессия miR-125b, miR-21, miR-16-2, Ш-71. Представленные результаты свидетельствуют о значимости баланса показателей функционирования р53-зависимой системы сохранения стабильности генома для снижения риска развития радиационного канцерогенеза.
Применение технологий, связанных с использованием ионизирующей радиации, постоянно расширяется, поэтому важной проблемой остается снижение риска развития поздних эффектов облучения у лиц, пострадавших от радиационные аварий, вторичные опухолей, развивающихся при применении широко используемой в онкологической практике лучевой терапии, а также опухолей после облучения в малых дозах.
Известно, что различные вакцины оказывают профилактическое и лечебное действие в отношении опухолей [6; 7; 9; 24], однако нет данных о влиянии вакцин на радиа-ционно-индуцированный онкогенез. Перспективным в качестве препарата двойного назначения (противоинфекционного и противоопухолевого) является широко применяемая гриппозная вакцина. Десятки миллионов граждан РФ иммунизированы вакциной «Гриппол». Она содержит поверхностные гли-копротеины (гемагглютинин и нейраминида-зу), выделенные из очищенных вирусов гриппа типа А и В, и кроме того имеет в своем составе водорастворимый высокомолекулярный иммуностимулятор — Г4-оксидированное производное поли-1,4-этиленпиперазина (по-лиоксидоний). Наблюдения за результатами вакцинации населения свидетельствуют о безвредности, хорошей переносимости и высокой профилактической эффективности препарата, поэтому вакцина «Гриппол» разрешена к широкому применению в эпидемиологической практике [11].
Ранее было доказано, что вакцина «Гриппол» обладает противолучевым действием [8], однако оставался неизученным принципиальный вопрос о влиянии этой вакцины на спонтанное и радиационно-индуцированное развитие опухолей.
Эффективное функционирование клеток в организме осуществляется с помощью внутриклеточных программ, активность которые определяется экспрессией генов, участву-
ющих в реализации этих программ. Для развития новообразований необходимо подавление системы сохранения стабильности генома, подконтрольной р53.
р53 — центральный элемент сети, обрабатывающей входящие сигналы от различные путей, чувствительные к генотоксическо-му и цитотоксическому стрессу, он блокирует распространение клеток с поврежденным геномом и индуцирует их апоптоз. Как транскрипционный фактор р53 вызывает усиление экспрессии генов — ингибиторов прохождения клеточного цикла и проапоптотических генов. Поддержание оптимальной активности р53, направленной на сохранение стабильности генома, осуществляется взаимодействием онко-супрессора с его ингибиторами шёш2, шёш4, а также экспрессией микроРНК (ш1И), являющихся ключевыми медиаторами р53-ответа на стресс [16]. Таким образом, количественное определение указанные показателей может быть полезно не только для выявления изменений, характерных для опухолей, но и для оценки молекулярные нарушений, возникающих на стадиях, предшествующих появлению новообразований.
Цель работы — исследование возможности повышения вакциной «Гриппол» резистентности к радиационно-индуцированному развитию опухолей и участия ш1И в механизмах реализации такого действия вакцины.
Материалы и методы
Животные. Белые аутбредные (беспородные) крысы-самки в возрасте 3,5 месяца и с исходной средней массой тела 175±20 г быши выбраны в качестве модели для исследования влияния вакцины «Гриппол» на спонтанное и радиационно-индуцированное возникновение опухолей. Известно, что рак молочной железы у крыс сравним с раком молочной железы у человека по многим параметрам, таким как высокая частота гормональной зависимости и патологическая прогрессия в сторону от гипер-
плазии протоков к появлению карциномы протоков. В этой связи крысы являются широко используемой моделью для исследования риска и механизма развития опухолей молочной железы. Наблюдение за развитием опухолей осуществляли в течение 22 месяцев, в период, когда, по литературным данным, появление спонтанных опухолей молочной железы у крыс отчетливо проявляется [2]. В ходе длительного эксперимента крысы содержались на стандартной лабораторной диете, имели свободный доступ к воде и быши ограничены в спаривании. Все технические манипуляции с животными проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики» [10].
Облучение животных. Животных подвергали на установке «ИГУР» тотальному равномерному воздействию гамма-излучения 137Св в дозе 2,5 Гр (мощность дозы — 1,138 Гр/ мин).
Иммунизация животных. Для иммунизации животные использовали вакцину «Гриппол» производства ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ. Быши вытолнены два варианта экспериментов, различающиеся по схеме иммунизации. В первом варианте крыс иммунизировали однократно подкожно в дозе 0,2 мл за 2 недели до облучения. Повторный эксперимент провели с интервалом в 3 месяца. Второй эксперимент позволял по результатам первого эксперимента набирать материал для проведения молекулярно-генетических исследований в наиболее отдаленные сроки, предшествующие появлению радиогенных опухолей.
Во втором варианте крыс иммунизировали трехкратно: за 2 недели до облучения, через 2 недели и через 6 месяцев после облучения.
Для каждого варианта иммунизации крыс, а также для молекулярно-генетических исследований животные были разделены на 4 группы, рандомизированные по массе тела:
• 1-я группа — необлученные, неиммунизи-рованные;
• 2-я группа — необлученные, иммунизированные;
• 3-я группа — облученные, неиммунизиро-ванные;
• 4-я группа — облученные, иммунизированные.
В эксперименте всего исполызовалосы 600 крыс (12 выборок по 40—50 животные).
Оценка противоопухолевого действия вакцины «Гриппол». Опухоли молочной железы определяли палыпаторныш методом, без морфологического исследования. Критерием оценки бластомогенной эффективности внешнего облучения и противоопухолевой активности вакцины, как и развития спонтанных опухолей, служил латентный период — срок появления опухолей молочной железы. Дополнителыно для оценки качества жизни крыс в ходе эксперимента исследовали массу тела, посколыку стабилыное повышение массы тела крыс с увеличением возраста служит признаком здоровыя.
Оценка роли микроРНК, регулирующих р53-зависимую систему сохранения стабильности генома, в опухолях молочной железы и костном мозге крыс, иммуни-зированныгх вакциной «Гриппол», после облучения. Во втором эксперименте, проведенном по первому варианту введения вакцины «Гриппол» крысам, иммунизированным однократно в дозе 0,2 мл за 2 недели до облучения, оценивали эффективносты функционирования р53-зависимой системы сохранения ста-билыности генома в радиочувствителыные органах: костном мозге и молочной железе. Для этого на 75-е, 315-е и 550-е сутки после радиационного воздействия в тканях этих органов методом полимеразной цепной реакции в реалыном времени (ПЦР РВ), способным количественно оцениваты изучаемый показателы, определяли транскрипционную активносты генов р53, mdm2, mdm4, а также экспрессию зрелые miR let-7i, miR-16-2, miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145. Из задней конечности животного извлекали болышеберцовую и малоберцовую кости, полученную суспензию клеток костного мозга растворяли в модифицированной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с рН 7,2 с содержанием в 0,1 мл 0,5—2*106 клеток. Из ткани молочной железы крыс получали го-могенат (0,2 г ткани/1 мл тризола).
Выделение тоталыной РНК проводили тризолыным методом с исполызованием набора «Trizol RNA Prep 100» (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) из выделенной РНК проводили с помощыю набора лиофилизирован-
ных реагентов для проведения реакции обратной транскрипции «GenePak RT Соге» («Лаборатория Изоген»), Обратная транскрипция для зрелыгх miR miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i осуществлялась со шпплькообразныши праймера-ми («stem-loop»-праймерами) с использованием набора «GenePak RT Соге» («Лаборатория Изоген»), специально изготовленного по нашему заказу, содержащего 100 ед, обратной транскриптазы M-MLV («Promega», США), 20 ед, ингибитора РНКаз RNasin («Promega»), дезоксинуклеотидтрифосфаты и оптимизированную буферную систему, но без добавления случайныгх гекса- и нанонуклеотидных прайме-ров, Праймеры и условия проведения ПЦР РВ взяты для miR-34c-3p, let-7i, miR-21 из работы [21], для miR-16-2 - из [19], miR-145 - из [22], miR-125b-5p - из [27], p53 - из [18], mdm2 - из [4], mdm4 - из [5], В качестве референсного гена использовали GAPDH [3] и U6 (малый ядерный рибонуклеопротеин) в случаях, когда значения порогового цикла (Ct) для гена U6 изменялись в опытных группах по сравнению с контролем в пределах менее двух циклов, Все методики быши адаптированы к нашим условиям, Амплификацию проводили на приборе «DT Prime 5М3» («НПО ДНК-Технология», Россия), Расчет экспрессии исследуемыгх генов и miR осуществляли с использованием метода AACt, Для каждой пробы ПЦР РВ проводили не менее двух раз,
Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием пакета статистических программ STATISTICA 7,0 и включала определение медианы (Ме) и 25 и 75% квартилей, Для расчета значимости различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, Данные считали достоверными при р<0,05,
Результаты исследования и их обсуждение
Динамика образования опухолей молочной железы. Результаты наблюдения за появлением первых опухолей молочной железы и изменением массы тела в различных экспериментальных группах животных после иммунизации вакциной «Гриппол» представлены в табл. 1.
Влияние вакцины «Гриппол» на время появления опухолей молочной железы у крыс представлено на рис. 1.
Наблюдение за развитием опухолей в течение 22 месяцев позволило установить, что у необлученных животных при однократном (А) и трехкратном (В) введении вакцины «Гриппол» первые опухоли появляются на 14-м и 20-м месяце соответственно. У неим-мунизированных животных первые опухоли были зафиксированы раньше: на 12-м и 17-м месяце от начала эксперимента. Частота появления опухолей за весь период наблюдения составила для спонтанных опухолей 0,2, а для облученных животных — 0,7.
Появление первой опухоли у иммунизированных облученных животных при А-варианте введения вакцины «Гриппол» было отмечено через 8 месяцев после облучения, тогда как у контрольных облученных животных опухоли появились раньше — через 5 месяцев после облучения. В другой серии у иммунизированных животных появление опухолей выявлено через 9 месяцев после облучения, в то время как у неиммунизированных крыс — через 6 месяцев. Аналогичная закономерность отмечалась и во втором варианте эксперимента (В): у иммунизированных облученных крыс первая опухоль появилась на 7-м месяце, тогда как у неиммунизированных — через 2 месяца.
Таким образом, иммунизация молодых крыс вакциной «Гриппол» приводит к увели-
Таблица 1 Время появления первых опухолей молочной железы и средняя масса тела крыс к 22-му месяцу наблюдения в эксперименте с однократным (А) и трехкратным (В) введением вакцины «Гриппол»
Группа Количество животных, n Время появления первой опухоли молочной железы (месяцы) Средняя масса тела (г)
А В А В
1-я 90 50 12 17 320,6
2-я 90 50 14 20 342,4
3-я 110 50 5 2 350,0
4-я 110 50 8 7 306,4
а> 18
i
• Med
an ^ 25-75%
Биоконтроль «Гриппол» Облучение Облучение + «Гриппол»
Рис. 1. Влияние вакцины «Гриппол» на время появления первых опухолей молочной железы после облучения крыс в дозе 2,5 Гр.
Примечание: * - различия между группами статистически значимы (р<0,05)
чению латентного периода выхода радиогенных опухолей молочной железы, появляющихся у животных.
Состояние повышенной противоопухолевой резистентности под влиянием иммунизации является временным, и к моменту окончания эксперимента выход опухолей у вакцинированных и невакцинированных животных сравнивается.
Масса тела животных на протяжении всего эксперимента увеличивалась. Различия между группами были статистически незначимыми (таблица), однако средняя масса тела иммунизированных животных была несколько выше, чем неиммунизированных.
Влияние вакцины «Гриппол» на функционирование р53-зависимой системы сохранения стабильности генома. Механизм действия ш1И заключается в том, что они, связываясь с мРНК генов-мишеней, ингиби-руют синтез их белков. М1И семейства ш1И-34, а также ш1И-16-2 и ш1И-145 сами являются мишенями транскрипционного фактора р53, который активирует их экспрессию. Эти ш1И взаимодействуют с мРНК генов, связанных с клеточным циклом, репарацией ДНК, процессами дифференцировки, и способствуют остановке клеточного цикла и апоптотиче-ской гибели клеток с поврежденным геномом, выступая как онкосупрессоры. Некоторые из них при гиперэкспрессии могут превращаться в ш1И с онкогенными свойствами, способствующие онкотрансформации и подавлению ак-
тивности р53-зависимой системы сохранения генома. Так, при раке предстательной железы высокие концентрации разных членов семейства 1е1-7 приводят к ингибированию активности каспаз и предотвращают апоптоз, а высокий уровень зрелых ш1И-34 в некоторых опухолях способен усиливать процессы инвазии и метастазирования. М1И-125Ь напрямую взаимодействует с мРНК р53 и блокирует синтез этого белка, а также контролирует около 20 генов-мишеней в р53-сигналинге [20]. В клетках человека установлено прямое действие ш1И-125Ь на мРНК р53. Для клеток грызунов ш1К-125Ь-опосредованный апоп-тоз осуществляется не за счет воздействия на мРНК р53, а непосредственным подавлением других мишеней в р53-сети, в том числе, регуляторов апоптоза и регуляторов клеточного цикла, таких как Вак1, Вс1-2 и циклин С. Транскрипционные факторы, активирующие пролиферативные процессы, например АР-1, №-кВ, воздействуют на промотор гена ш1г-21 и стимулируют его транскрипцию. Зрелая ш1И-21 ингибирует р53-сигналинг, блокируя клеточные программы, направленные на сохранение стабильности генома. Гиперэкспрессия ш1И-21 наблюдается в большинстве злокачественных новообразований, включая лейкозы и опухоли молочной железы [23]. Таким образом, количественное определение указанных показателей может быть полезно не только для выявления изменений, характерных для опухолей, но и для оценки молекулярных нарушений, возникающих на стадиях, предшествующих появлению новообразований.
Мы исследовали р53-систему сохранения стабильности генома в двух радиочувствительных органах крыс — костном мозге и молочной железе — в динамике после острого облучения в дозе 2,5 Гр, используя показатели, характеризующие функциональную активность этой системы [12]. Результаты представлены в табл. 2, 3 и на рис. 2, 3.
В табл. 2 показаны изменения содержания мРНК генов р53, шёш2, шёш4 и экспрессии зрелых ш1И-16-2, ш1И-21, ш1И-34с, ш1И-125Ь, ш1И-145, М-71 в опухолях молочной железы на 315-е и 550-е сутки после острого облучения крыс в дозе 2,5 Гр.
На 315-е сутки наблюдается снижение транскрипционной активности гена р53 в
20
16
14
Q) 12
10
8
6
4
2
группах «Облучение + опухоль молочной железы» и «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» в 30 и 10 раз соответственно по сравнению с контрольной группой (рис. 2А). Содержание мРНК гена шёш2, белковый продукт которого является ингибитором р53, также снижается в молочной железе крыс этих групп, однако только в 5 раз, что, по-видимому, обеспечивает содержание шёш2, достаточное для контроля над белком р53. Поскольку время жизни мРНК и белков р53 и шёш2 находится в пределах от 5—10 до нескольких десятков минут, изменение содержания мРНК этих генов быстро отражается на уровне белка, поэтому данные результаты свидетельствуют о возможном снижении активности р53 в молочной железе у облученных животных. Изучение экспрессии зрелых ш1И, модулирующих работу р53-зависимой системы, демонстрирует дисбаланс их содержания в радиогенных опухолях молочной железы. В опухолях существенно увеличивается экспрессия ш1И с онкогенными свойствами. М1И-125Ь растет в группе «Облучение + опухоль молочной
железы» в 49 000 раз, а в группе «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» — в 3800 раз, ш1И-21 — в 21 и 7 раз соответственно (р<0.05). Высокий уровень М-71, увеличение которого в группе «Облучение + опухоль молочной железы» достигает 20 000 раз, а в группе «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» — в 600 раз, показывает, что в радиогенных опухолях молочной железы крыс эта ш1И подавляет активность каспаз и ингибирует апоптозы. Следует отметить, что увеличение ш1И-21, ш1И-125Ь и М-71 количественно в группе «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» было менее выражено, чем в группе «Облучение + опухоль молочной железы». Наблюдались увеличение экспрессии ш1И-34е и тенденция к росту зрелых ш1И-16-2, ш1И-145.
На 550-е сутки эксперимента в опухолях, возникших у интактных и облученных крыс, также наблюдался дисбаланс экспрессии ш1И (табл. 2, рис. 2В). Увеличивалась экспрессия зрелых ш1И-21, М-71, ш1И-125Ь, обладающих онкогенными свойствами. В опу-
Таблица 2 Содержание (Ме) мРНК генов р53, mdm2, 1ш1т4 и зрелых ш1К-145, шШ-16-2, ш1К-125Ь, ш1К-34е, ш1К-21, 1еЬ71 в молочной железе крыс-самок после гамма-облучения в дозе 2,5 Гр
315-е сутки после облучения
р53 1ш1и|2 1ш1и|4 ш1К-125Ь ш1К-34е Ш1К-145 Ш1К-16-2 1еЬ71 ш1К-21
Биоконтроль 1,19 (0,64-1,56) 0,97 (0,66-1,20) 1,0 (0,54-1,60) 1,00 (1,00-4,60) 1,08 (0,47-3,20) 1,12 (0,88-2,60) 1,00 (0,15-3,50) 1,26 (0,59-7,30) 1,10 (0,53-2,00)
п 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Облучение + опухоль молочной железы 0,04* (0,040,10) 0,20* (0,200,20) 0,20 (0,09-16,1) 49667,00* (32768,00161368,6) 48,50* (5,28-90,5) 3,73 (3,73-27,9) 8,57 (0,03-55,70) 19961,9* (7069,8432128,20) 21,86* (20,39-401,20)
п 5 5 4 3 3 5 3 4 5
Облучение + опухоль молочной железы + «Гриппол» 0,10** (0,07-0,1) 0,22** (0,17-0,40) 0,5 (0,44-0,50) 3821,00 0,66 (0,50-2,00) 5,66 (2,14-7,00) 4,29 (0,061910,00) 588** (388,002702,00) 7,21 (2,93-11,70)
п 5 4 3 1 5 5 3 5 5
550-е сутки после облучения
Биоконтроль + опухоль 0,06* (0,04-0,069) 0,32* (0,23-0,406) 0,54 (0,35-0,57) 8,57 (2,30-104) 4,24 (0,32-17,0) 2,23 (0,44-18) 90,51 (0,09-256) 955,43* (724,08-9410) 38,05* (1,93-163)
п 6 6 3 3 6 6 3 5 6
Облучение + опухоль молочной железы 0,11 (0,04-1,36) 0,27 (0,13-0,57) 1,46 (1,28478,00) 37642,0* (1,90127523,00) 57,99* (36,76676,00) 22,6* (13,0042,00) 103,9* (73,521097,00) 24117,0* (18820,00 -1956712,00) 745,3* (349,00-4871, 60)
п 5 6 4 4 6 5 5 6 6
Примечания: значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане группы «Биоконтроль», условно принятой за 1,0; 25 и 75% квартили указаны в скобках; п — величина выборки; * — различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы» и «Биоконтроль» для данного показателя статистически значимы (р<0,05); ** — различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» и «Биоконтроль» для данного показателя статистически значимы (р<0,05).
Рис. 2. Изменение содержания мРНК генов р53, mdm2, mdm4 и экспрессии зрелых miR-16-2, miR-21, miR-34с, miR-125b, miR-145, в опухолях молочной железы крыс на 315-е (А) и 550-е (В) сутки после острого облучения в дозе 2,5 Гр (значения нормированы к медиане группы «Биоконтроль», принятой за 1,0, и величины показателей на диаграмме представлены в логарифмической шкале).
Примечания: * - различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы» и «Биоконтроль» для данного показателя статистически значимы (р<0,05); ** - различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» и «Биоконтроль» для данного показателя статистически значимы (р<0,05); *** - различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» и «Облучение + опухоль молочной железы» для данного показателя статистически значимы (р<0,05)
А p53 ** B
1 000 000- p53
miR-21*д-10 000- 1 000 000 miR-21*-^10 000—
/ /Ч 100- / А, 10Д-
let-7i*,** Г—я^^Г /ХЛ ИЛ \ —7 mdm4
/ let-7i* Л\- ГтК \ —/ mdm4
\ \ .________ '^'J/ \ \ ^Tjic1/ j^J
miR-16-2 <С у miR-125b* - ; - ^Й"-..
miR-16-2* У miR-125b*
miR-145 miR-34c*
miR-145* miR-34c*,***
—•— Биоконтроль ------- облучение + опухоль молочной железы —•— Биоконтроль •--■--- Облучение + опухоль молочной железы —♦—«Гриппол» + опухоль молочной железы
- -о- -облучение +опухоль молочнойжелезы + «Гриппол» — с^ Облучение + опухоль молочной железы + «Гриппол»
холях облученных крыс отмечалось возрастание экспрессии микроРНК-супрессоров опухолей ш1И-34с, ш1И-16-2 и ш1И-145.
Таким образом, в радиогенных и спонтанных опухолях выявлены качественно одинаковые изменения ш1И-21, 1е1-71, показывающие снижение активности р53-системы, характеризующие опухоли молочной железы. Однако в опухолях молочной железы у облученных животных экспрессия ш1И-125Ь и М1И-21, обладающих онкогенными свойствами, а также 1е1-71 была более высокой, чем в спонтанных опухолях.
Другой радиочувствительной тканью является костный мозг, где после острого лучевого воздействия в сублетальных дозах у крыс появление злокачественных новообразований маловероятно, в отличие от тканей молочной железы — органа, в котором образование спонтанных и радиационно-индуцированных опухолей — достаточно частое событие. Проведение исследований по сопоставлению влияния ионизирующей радиации в молочной железе и костном мозге полезно для оценки антиканцерогенных возможностей р53-зависимой системы и определения маркеров, способных выявить различия в функционировании р53-системы в этих органах в длительной временнуй динамике после облучения.
Результаты исследований показывают, что на 75-е сутки после облучения в костном мозге наблюдается снижение функциональной активности р53-системы (табл. 3, рис. 3А). Уменьшаются содержание мРНК гена р53 и экспрессия зрелой ш1И-34с, являющейся мишенью транскрипционного фактора р53. При введении вакцины «Гриппол» содержание ш1И-34с восстанавливается и не отличается от уровня биоконтроля. Восстановление этого показателя важно, поскольку было выявлено, что в клетках с отсутствующим геном р53 введение представителей семейства ш1И-34 приводит к восстановлению апоптотической гибели клеток с поврежденным геномом. На 315-е сутки в костном мозге, в отличие от молочной железы, все исследуемые нами показатели нормализуются и достоверно не отличаются от величин биоконтроля (данные не приведены). На 550-е сутки (рис. 3В, 3С) в группах «Облучение», «Облучение + опухоль молочной железы», «Биоконтроль + опухоль молочной железы» наблюдается увеличение экспрессии зрелых ш1И-21, М-71, ш1И-16-2, ш1И-125Ь. В отличие от молочной железы, на 550-е сутки в костном мозге не наблюдается снижения транскрипции гена р53. Введение «Гриппола» за 2 недели до облучения на 550-е сутки, как и на 315-е сутки, не вызывало изменений показателей в костном мозге по сравнению с со-
Таблица 3 Содержание (Ме) мРНК генов р53, mdm2, 1ш1т4 и зрелых ш1К-145, ш1К-16-2, ш1К-125Ь, ш1К-34е, ш1К-21, 1еЬ71 в костном мозге на 75-е сутки после гамма-облучения крыс-самок в дозе 2,5 Гр
р53 шёш2 шёш4 ш1И-125Ъ ш1И-34е ш1И-145 ш1К-16-2 Ы-71 ш1И-21
Биоконтроль 1,05 (0,17-1,63) 1,25 (0,28-2,56) 1,00 (0,75-2,46) 1,0 (0,26-5,41) 1,00 (0,50-1,41) 1,02 (0,39-2,56) 1,10 (0,28-6,07) 1,37 (0,41-4,66) 1,09 (0,61-4,39)
п 8 8 7 8 8 8 8 8 8
Биоконтроль + «Гриппол» 0,27 (0,11-0,98) 0,26 (0,15-0,48) 1,32 (0,50-2,83) 0,87 (0,38-1,23) 0,34 (0,24-1,20) 0,44 (0,13-1,00) 0,52 (0,26-0,91) 0,24 (0,16-0,62) 0,79 (0,54-1,19)
п 8 8 5 7 8 7 8 8 8
Облучение 0,02* (0,01-0,07) 0,06 (0,04-0,12) 2,29 (2,14-4,00) 0,50 (0,02-1,48) 0,04* (0,02-0,25) 0,23 (0,08-3,48) 0,35 (0,15-2,05) 0,20* (0,06-2,17) 1,73 (0,45-33,51)
п 7 8 6 7 8 7 8 8 8
Облучение + «Гриппол» 0,02** (0,01-0,04) 0,04** (0,03-0,07) 0,68 (0,16-2,46) 0,12 (0,002-2,64) 0,51 (0,22-0,77) 0,27 (0,04-2,46) 0,59 (0,22-1,54) 0,85 (0,34-4,93) 0,37 (0,18-3,44)
п 10 10 7 8 10 7 10 8 11
Примечания: значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане группы «Биоконтроль», условно принятой за 1,0; 25 и 75% квартили указаны в скобках; п - величина выборки; * - различия между опытными группами и группой «Биоконтроль» для данного показателя статистически значимы (р<0,05); ** - различия между группами «Облучение» и «Облучение + "Гриппол"» статистически значимы (р<0,05).
ответствующими группами без «Гриппола» как у облученных, так и у контрольных животных за исключением шёш4, экспрессия которого в группе «Облучение + "Гриппол"» была выше в 2,5 раза, чем в группе «Облучение».
Следует учесть, что вакцина «Гриппол» оказывает противоопухолевое воздействие не только на клеточном, но и на организменном уровне. Известно, что интерферон-а обладает выраженным противоопухолевым эффек-
том, ингибирует действие ростовых факторов и успешно применяется в онкологической практике. Установлено, что на 5-е сутки после иммунизации увеличивается содержание интерферона-а в крови у мышей, на 14-е сутки - у собак, а у людей - на 7-е и 56-е сутки [1]. Очевидно, что иммунизация вакциной «Гриппол» вызывает цепь реакций, включая гуморальные изменения, которые приводят к подавлению пролиферативной активно-
Рис. 3. Изменение содержания мРНК генов р53, mdm2, mdm4 и зрелых miR-16-2, miR-21, miR-34с, miR-125b, miR-145, в костном мозге крыс на 75-е (А) и 550-е сутки (В и С) после острого облучения в дозе 2,5 Гр (значения нормированы к медиане группы «Биоконтроль», принятой за 1,0, и величины показателей
представлены в логарифмической шкале).
Примечания: * - различия между группами «Облучение» и «Биоконтроль» статистически значимы (р<0,05); ** - различия между группами «Облучение + "Гриппол"» и «Биоконтроль» статистически значимы (р<0,05); *** - различия между группами «Облучение» и «Облучение + "Гриппол"» статистически значимы (р<0,05); **** - различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы» и «Биоконтроль» статистически значимы (р<0,05); ***** - различия между группами «Облучение + опухоль молочной железы + "Гриппол"» и «Биоконтроль»
статистически значимы (р<0,05)
сти клеток, склонных к образованию опухоли. Важно, что обнаруженное через несколько месяцев после облучения ингибирование экспрессии miR-34c, уровень которой зависит от активности р53, у вакцинированные живот -ных устраняется, что способствует активации программ, направленных на гибель клеток с поврежденным геномом.
p53 представляет собой центральный регулятор, который может использовать многочисленные кодирующие и не кодирующие белок гены для достижения опухолевой супрессии. В этой связи экспериментальное изменение функционирования одиночного р53-индуцированного белок-кодирующего гена редко способствует остановке опухолевого роста в условиях in vitro или in vivo [15]. Следовательно, одна р53-индуцированная miR способна воздействовать на более чем один кодирующий ген и может иметь существенный терапевтический потенциал [17]. Однако оценка эффектов одной р53-индуцированной miR осложнена, так как несколько miR могут воздействовать на одну и ту же мРНК белок-кодирующего гена, что приводит к фенотипической компенсации. N. Bandi и E. Vassella показали, что синергиче-ский эффект miR-15a/16 и miR-34a быш необходим для остановки клеточного цикла в клеточных линиях рака легкого, поскольку их согласованное действие способствовало ингибиро-ванию экспрессии большего числа генов, чем при действии каждой микроРНК в отдельности [13]. Таким образом, совместная работа р53-связанных miR и их генов-мишеней имеет значение для опухолевой супрессии и требует в будущем экспериментальной валидации функционирования комплекса нескольких микроРНК, которые могут быть критичны для оценки и понимания их причастности к функционированию р53. Однако, очевидна возможность применения miR для нормализации р53-системы и снижения риска развития онкотрансформации в различные органах после радиационного воздействия.
В представленной работе мы оценили влияние введения вакцины «Гриппол» на транскрипцию р53, mdm2, mdm4 и экспрессию комплекса miR, принимающих участие в функционировании р53-системы. Установлена возможность ограниченного по времени влияния иммунизации на активность р53 в клет-
ках. Следует обратиты внимание на возможность влияния на внутриклеточную систему защиты генома через выборочное изменение содержания индивидуалыные miR. Лечебное применение miR относится к РНК-терапии. В отличие от применения коротких интерферирующих и коротких шпилыкообразных РНК, которые нацелены на один транскрипт, исполы-зование miR значителыно сложнее, посколы-ку miR может повлияты на сотни транскрип-тов, вызвав значителыные изменения функционирования различные внутриклеточные сиг-налыные цепей. На сегодняшний дены в экс-перименталыной разработке в качестве терапевтических средств находятся десятки miR, однако они пока не получили широкого применения в клинике. Создание препаратов для miR-терапии вполне возможно, тем более что уже существуют наработки для коротких интерферирующих РНК, по структуре сходных с miR [14; 26]. Эти РНК и аналогичным образом «миметики» miR могут быты стабилизированы через химические модификации, однако часто требуется привлечение транспортных носителей для обеспечения доставки соединений в различные ткани в условиях in vivo [25]. Существуют крупные компании, занимающиеся разработкой препаратов, влияющих на активность miR. Исследование различных miR, принимающих участие в функционировании р53-зависимой системы сохранения стабилыно-сти генома, может способствоваты персонифицированной профилактической и медицинской помощи применителыно к предотвращению отдаленные эффектов лучевого поражения.
Заключение
Суммируя все изложенное, можно отме-титы, что облучение крыс в нелеталыной дозе обусловливает ускоренное появление опухолей молочной железы и влияет на конечный резулытат — выеод опухолей на протяжении всего срока наблюдения. Иммунизация животные вакциной «Гриппол» приводит к заметному увеличению латентного периода спонтанных и радиационно-обусловленных опухолей молочной железы, благоприятно сказывается на показателе массы тела животного, однако не влияет на конечный выход опухолей. На 75-е сутки после облучения в костном мозге наблюдается снижение функционалыной ак-
тивности р53-системы. Эти изменения способствуют сохранению клеток с поврежденным геномом, что повышает риск развития канцерогенных изменений в клетках при действии генотоксических факторов. На 315-е сутки в клетках костного мозга функционирование р53-системы восстанавливается, в то время как в молочной железе низкий уровень функциональной активности р53-системы, определяемой по снижению экспрессии р53 и увеличению содержания ш1И-125Ь, ш1И-21 и способного проявлять онкогенные свойства 1еГ71, может приводить к развитию опухолей. Эти изменения обнаруживаются в более поздние сроки и в спонтанных опухолях. У старых крыс такие же изменения молекулярных показателей выявлены и в костном мозге. Различия между костным мозгом, где не обнаруживается онкотрансформации, и молочной железой заключаются в том, что в костном мозге не наблюдается снижения транскрипции гена р53.
Выводы
1. Иммунизация молодых экспериментальных животных вакциной «Гриппол» увеличивает латентный период радиационно-индуцированных опухолей молочной железы, способствует сохранению массы тела животного к концу эксперимента.
2. М1И, подавляющие активность р53-зависимой системы поддержания стабильности генома, являются важным звеном развития как спонтанных, так и радиогенных опухолей молочной железы крыс. Изменения экспрессии некоторых ш1И, способствующие выживанию клеток с поврежденным геномом, выявляются и на стадии до появления опухолей.
3. Позитивное влияние вакцины «Гриппол» на молекулярно-генетические показатели противоопухолевой резистентности наблюдается в течение как минимум трех месяцев после иммунизации крыс.
4. Иммунизация вакциной «Гриппол» способна замедлять процесс развития опухолей, воздействуя на молекулярно-генетическую систему формирования противоопухолевой резистентности.
Коллектив авторов выражает благодарность Раевой Н.Ф., Нисимову П.Г., Тищенко Г.С., Парфеновой И.М. за неоценимую помощь в выполнении исследований.
Литература
1. Бабаянц A.A., Дешевой Ю.Б., Пине-гин Б.В. и др. Интерфероногенная активность вакцины Гриппол // Иммунология. 2008. № 5. С. 278-280.
2. Москалев Ю.И., Стрельцова В.Н. Лучевой канцерогенез в проблеме радиационной защиты. М.: Энергоиздат, 1982.
3. Олигонуклеотидная последовательность прай-меров для гена GAPDH (крысы) // The Journal of Biological Chemistry. Доступ: http: // www.jbc.org/content/suppl/2011/11/28/ M111.287128.DC1/jbc.M111.287128-2.pdf (дата обращения: 29.04.2012).
4. Олигонуклеотидная последовательность праймеров для гена mdm2 ( крысы) // Nature.com. Доступ: nature.com/onc/ journal/v31/n9/extref/onc2011309x10 (дата обращения: 29.04.2012).
5. Олигонуклеотидная последовательность праймеров для гена mdm4 ( крысы) // IDT Integrated DNA Technologies. Доступ: https://eu.idtdna.com/site (дата обращения: 29.04.2012).
6. Патент РФ№2180593 «Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики генитального герпеса, хронической папилломы вирусной инфекции и профилактики рака шейки матки (варианты)» / Айламазян Э.К., Киселев О.И., Киселев В.И. и др. М., 2002.
7. Патент РФ№2196568 «Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дисплазий и рака шейки матки и папил-ломатоза гортани, а также способ профилактики и лечения этих заболеваний на ее основе» / Киселев В.И., Киселев О.И., Киселев М.В. М., 2003.
8. Патент РФ № 2312675 «Способ профилактики радиационного поражения» / Иванов A.A., Дешевой Д.Б., Иванова А.С. и др. М., 2007.
9. Патент РФ № 22350338 «Способ повышения противоопухолевой резистентности» / Иванов A.A., Насонова Т.А., Добрынина О.А. и др. М., 2011.
10. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил
лабораторной практики» // Российская газета, 2010, 22 окт,
11, Хаитов Р,М,, Некрасов А,В,, Горбунов М,В, Вакцинация «Грипполом» детей // Вакцинация, 2001, Т, 17, № 5, С, 1-5,
12, Шуленина Л,В,, Михайлов В,Ф,, Ле-дин Е,В, и др, Оценка эффективности р53-зависимой системы сохранения стабильности генома по содержанию микроРНК и мРНК крови онкологических больных // Медицинская радиология и радиационная безопасность, 2015, T, 60, № 1, С, 5-14,
13, Bandi N,, Vassella E, MiR-34a and miR-15a/16 are co-regulated in non-small cell lung cancer and control cell cycle progression in a synergistic and Rb-dependent manner // Molecular Cancer, 2011, Vol, 10, No, 55, Р, 1-11,
14, Burnett J,C,, Rossi J, J, RNA-based therapeutics: current progress and future prospects // Chemistry & Biology, 2012, Vol, 19, No, 1, Р, 60-71,
15, Concepcion C,P,, Han Y,-Ch,, Mu P, et al, Intact p53-dependent responses in miR-34-deficient mice // PLoS Genetics, 2012, Vol, 8, No, 7, Р, 1-12,
16, Deng C,, Sui C, Noncoding RNA in oncogenesis: A new era of identifying key players // International Journal of Molecular Sciences, 2013, Vol, 14, P, 18319-18349,
17, Kasinski A,L,, Slack F,G, miRNA-34 prevents cancer initiation and progression in a therapeutically-resistant K-ras and p53-induced mouse model of lung adenocarcinoma // Cancer Research, 2012, Vol, 72, No, 21, Р, 5576-5587,
18, Ke X,, McKnight R,A,, Wang Z,-M, et al, Nonresponsiveness of cerebral p53-MDM2 functional circuit in newborn rat pups rendered IUGR via uteroplacental insufficiency // American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 2005, Vol, 288, P, 1038-1045,
19, Lardizabal M,N,, Nocito A,L, Daniele S,M, Reference genes for real-time PCR quantification of microRNAs and messenger RNAs in rat models of hepatotoxicity // PLoS One, 2012, Vol, 7, No, 5, Р, 1-14,
20.Le M.T., Shyh-Chang N., Khaw S.L. et al. Conserved regulation of p53 network dosage by microRNA-125b occurs through evolving miRNA-target gene pairs // PLoS Genetics. 2011. Vol. 7. No. 9. P. 1-11.
21. Li R., Qian N., Tao K. et al. MicroRNAs involved in neoplastic transformation of liver cancer stem cells // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2010. Vol. 29. No. 169. P. 1-10.
22.Li R., Yan G., Li Q. et al. MicroRNA-145 protects cardiomyocytes against hydrogen peroxide (H2O2)-induced apoptosis through targeting the mitochondria apoptotic pathway // PLoS One. 2012. Vol. 7. No. 9. P. 1-9.
23.Pan X., Wang Zh-X., Wang R. Micro-RNA-21. A novel therapeutic target in human cancer // Cancer Biology & Therapy. 2010. Vol. 10. No. 12. P. 1224-1232.
24.Patent USA No. 7393527 "Method for limiting the growth of cancer cells using an attenuated measles virus" / Russell S.J., Fielding A., Peng K. 2008.
25.Siegwart D.J., Whitehead K.A., Nuhn L. et al. Combinatorial synthesis of chemically diverse core-shell nanoparticles for intra-cellular delivery // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. Vol. 108. No. 32. P. 12996-3001.
26.Shukla S., Sumaria C.S., Pradeepkumar P.I. Exploring chemical modifications for siRNA therapeutics: a structural and functional outlook // Medicinal Chemistry. 2010. Vol. 5. P. 328-349.
27. Yang Y., Kai G., Pu X.D. et al. Expression profile of microRNAs in fetal lung development of Sprague-Dawley rats // International Journal of Molecular Medicine. 2012. Vol. 29. P. 393-402.
Контакты:
Шуленина Лилия Викторовна,
ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна,
научный сотрудник.
Тел. раб.: 8(499)190-94-40.
E-mail: shulenina2010@mail.ru
