CC BY
13
УДК 637.07:577.2 Ил. 3. Библ. 7.
ЯЙЦО ИЛИ КУРИЦА? К ВОПРОСУ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР-АНАЛИЗА
Минаев М.Ю.1, канд. техн. наук, Кузнецова О.А.1, канд. техн. наук, Солодовникова Г.И.1, Курбаков К.А.1, Фомина Т.А.2, канд. техн. наук, Зайцева Е.В.2
1 ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
2 ФГБУ «НЦБРП»
Ключевые слова: ПЦР, ДНК, видовая идентификация, ДНК курицы, меланж, качественное определение, количественное определение, валидация, сходимость
Реферат
Современный уровень развития методов аналитических исследований позволяет выявлять и идентифицировать в анализируемом образце компоненты, находящиеся в нем, в минимальном количестве. Одним из таких методов с высокой базовой чувствительностью является ПЦР-диагно-стика. Широкое применение данного метода для подтверждения соответствия требованиям технических регламентов, а также выявления фактов фальсификации поставило 2 важных вопроса: как различить компоненты одного происхождения (в первую очередь отличить мясо птицы и продукты его переработки от яйца и продуктов его переработки), и что считать преднамеренно внесенным компонентом, а что случайным попаданием (технологически неустранимой примесью). Рассматриваются результаты валидации чувствительности ГОСТ Р 52723-2007 относительно яичного белка и ДНК кур. А также обосновывается актуальность пересмотра в ГОСТ Р 52723-2007 интерпретации получаемых результатов, свидетельствующих о фальсификации продукции.
CHiCKEN OR EGG? THE QUESTiON OF PCR-ANALYSiS iNTERPRETATiON
Minaev M.Yu.1, Kuznetsova o.A.1, Solodovnikova G.I.1, Kurbakov A.K.1, Fomina T.A.2, Zaitseva E.V.2
1 The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
2 FGBU NTSBRP
Key words: PCR, DNA, species identification, chicken's DNA, egg, qualitative determination, quantitative determination, validation, convergence
Summary
The modern level of analytical methods allows to identify a minimum amount of components in the analyzed sample. One of these methods, with high sensitive base stew, is a PCR — diagnostics. Wide application of the method to prove compliance with the requirements of technical regulations, and identify facts of fraud have put two important issues: how to distinguish the components of one origin (primarily to distinguish between poultry meat and products of its processing from the egg and its processed products) and what is considered the intentional component, and that a random hit (technologically unavoidable impurity). The article discusses the validation results of the GOST R52723-2007 sensitivity relative to egg protein and chicken's DNA.
В последнее время государственные органы контроля усилили мониторинг выполнения требований технических регламентов предприятиями мясоперерабатывающей отрасли. В Кодекс административных правонарушений внесены изменения, связанные с ужесточением ответственности за невыполнение требований регламентов, а также недостоверную информацию, указанную в маркировке. Так, в соответствии со статьёй 14.43 п. 1: «Нарушение изготовителем, исполнителем (лицом, выполняющим функции иностранного изготовителя), продавцом требований технических регламентов... влечет наложение административного штрафа на граждан в размере от одной тысячи до двух тысяч рублей; на должностных лиц - от десяти тысяч до двадцати тысяч рублей; на лиц, осуществляющих предпринимательскую деятельность без образования юридического лица, - от двадцати тысяч до тридцати тысяч рублей; на юридических лиц - от ста тысяч до трехсот тысяч рублей». В тоже время выявленные нарушения могут быть отнесены к статье 14.7 п. 2: «Введение потребителей в заблуждение относительно потребительских свойств или качества товара (работы, услуги) при производстве товара в целях сбыта либо при реализации товара (работы, услуги), ... влечет наложение административного штрафа на граждан в размере от трех тысяч до пяти тысяч рублей; на должностных лиц - от двенадцати тысяч до двадцати тысяч рублей; на юридических лиц - от ста тысяч до пятисот тысяч рублей».
Основные требования к маркировке мясной продукции установлены ТР ТС 022/2011 «Пищевая продукция в части ее маркировки» и ТР ТС 034/2013 «О безопасности мяса и мясной продукции». Одним из основных методов видового подтверждения состава продукции, включенным в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технических регламентов, является ГОСТ 31719-2012 «Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)». Данный метод является качественным и основан на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет установить видовой состав исследуемой продукции и определить соответствие информации, вынесенной на этикетку. Однако данная методика является качественной, и в ней не указан предел обнаружения видоспец-ифичной ДНК. В итоге это сказалось на различной интерпретации результатов исследований. И первая, наиболее распространенная спорная ситуация: о чем говорит выявление присутствия ДНК кур в продукте, в составе которого есть меланж (или другие продукты переработки яйца), но не слова не говорится о мясе птицы? Маскируют ли недобросовестные производители таким образом факт фальсификации продукции?
На данный вопрос можно дать достаточно однозначный ответ. В ходе разра-
ботки ГОСТ Р 52723-2007, прогнозируя возможность возникновения вышеописанной ситуации, преднамеренно была занижена чувствительность метода, вследствие чего ДНК кур, привнесенная с меланжем (содержащегося не более 10 % в рецептуре продукта) в продукте не выявлялась.
За прошедшие 10 лет на российском рынке появилось множество решений в области ПЦР в реальном времени и возникла необходимость подтверждения заданной ГОСТ чувствительности метода выявления ДНК кур. Валидация метода была проведена на реактивах производства ЗАО «Синтол» и ООО «Био-ком», в качестве приборной базы использовались амплификаторы АНК-32 и ABI Prism 7000.
Для оценки чувствительности метода и определения цикла (Ct) отсечения положительного результата с использованием видоспецифических праймеров к гену ци-тохрома Б курицы была поставлена серия десятикратных разведений ДНК, выделенной образца куриной тушки (рисунок 1)
Из рисунка 1 видно, что предпоследнее успешно амплифицированное разведение соответствует 0,1% ДНК курицы. Расчетный Ct амплификации составил 31 цикл, что подтверждает чувствительность метода и интерпретацию положительного выявления в 0,1 %. Рассчитанные по результатам анализа метрологические характеристики эффективности ПЦР реакции и коэффициент корреляции, свидетельствуют о хорошей сбалансированности разработанной системы.
Рисунок 1. Кривые амплификации десятикратных разведений ДНК кур 1 — ДНК Курицы исходная; 2 — ДНК Курицы, разведение 10-1; 3 — ДНК Курицы, разведение 10-2; 4 — ДНК Курицы, разведение 10-3; 5 — ДНК Курицы, разведение 10-4
На следующем этапе были проведены сравнительные исследования идентификации ДНК кур и ДНК, выделенной из выделенной из разведенных 1/10 образцов меланжа. Полученные результаты представлены на рисунке 2.
Из рисунка 2 следует, что кривые амплификации ДНК, выделенной из разведенных 1/10 образцов меланжа вышли гораздо позднее 31 цикла, по которому отсекаются положительные результаты ПЦР. Таким образом, выделение ДНК птицы
привнесенного в продукт меланжем в количестве менее 10 % в рецептуре является отрицательным результатом, поскольку лежит ниже чувствительности метода.
На следующем этапе исследовалось влияние способа выделения ДНК на заданную чувствительность метода. Для изучения влияния метода выделения ДНК на конечный результат, разведенные 1/10 образцы меланжа были выделены на станции MagNA Pure LC2.0 Instrument. Результаты представлены на рисунке 3.
Результаты исследования (рисунок 3) показали, что метод выделения ДНК не повлиял на конечный результат, все образцы меланжа разведенного 1/10 дали отрицательный результат, т.е. находятся за установленной чувствительностью метода.
Проверка воспроизводимости метода, в т.ч. с использованием различных ам-плификаторов, проводилась лабораторией ПЦР диагностики ФГБУ «НЦБРП».
Для исследования использовались наборы СОРБ-ГМО-Б, выделение ДНК про-
Рисунок 2. Кривые амплификации 100%, 0,1 % ДНК кур и ДНК, выделенной из разведенных 1/10 образцов меланжа методом ЦТАБ. 1 — ДНК Курицы исходная; 2 — ДНК Курицы, разведение 10-3; 3 — ДНК образцов меланжа
15 10 15 20 25 30 35
Cjncl«
2017 | №4 ВСЕ О МЯСЕ
Рисунок 3. Кривые амплификации 100% ДНК кур и ДНК, выделенной на станции MagNA Pure LC2.0 Instrument из разведенных 1/10 образцов меланжа. 1 — ДНК Курицы исходная; 2 — ДНК образцов меланжа
водилось на станции MagNA Pure LC2.0 Instrument, используемый амплифика-тор - QTower и CFX-96 Biorad.
Результаты проверки показали сходи-мые результаты. В проведенных исследованиях на 2-х различных амплифика-торах получен отрицательный результат по показателю обнаружения ДНК кур в образцах меланжа, разведенного 1/10.
Полученные результаты дают основание утверждать, что метод, изложенный в ГОСТ 31719-2012 и МР 4.2.0019-11 является воспроизводимым, различные подходы к выделению ДНК и модели амплификато-ров оказывают статистически не значимое влияние на получаемый результат.
Исходя из результатов исследования, можно сделать вывод, что изложенный в ГОСТ 31719-2012 и МР 4.2.0019-11 метод выявления ДНК кур позволяет однозначно интерпретировать положительный результат анализа как факт присутствия в продукции именно ДНК кур, без привязки к содержанию продуктов переработки яйца.
Второй важный вопрос, связанный с интерпретацией результатов ПЦР исследований является выявление следовых количеств ДНК различных видов мяса, незаявленного в составе продукта. Проведенный институтом мониторинг мясной продукции показал, что незаявленные виды сырья содержатся, как правило, либо намного меньше 0,1 %, что говорит о непреднамеренном их внесении, либо
больше 1,0% что может рассматриваться как сознательное внесение ингредиента в рецептуру. В настоящий момент в российском законодательстве отсутствует понятие «технологически неустранимых примесей» для мясной продукции. При сложившихся обстоятельствах любое выявление ДНК сырья, не заявленного в маркировке, может расцениваться как факт нарушения требований технических регламентов, так и факт введения потребителя в заблуждение или его преднамеренный обман, за чем может следовать привлечение к административной ответственности.
Решением данного вопроса может служить внесение изменений в ГОСТ 31719-2012 в части установления предела обнаружения метода по основ-
ным видам мясного и растительного сырья, который может составить 2000 копий ДНК или около 0,1% мышечной ткани для животных компонентов и более низкий предел для растительных.
© КОНТАКТЫ:
Минаев Михаил Юрьевич а mminaev@inbox.ru Кузнецова Оксана Александровна а ok@vniimp.ru Солодовникова Галина Ивановна V 7 (495) 676-60-11 Курбаков Константин Андреевич а homo_ludens@vniimp.ru Фомина Татьяна Алексеевна а tfomina@lenta.ru Зайцева Елена Витальевна а zev_78@bk.ru
5. Lakzadeh L, Hosseinzadeh S, Shekarforoush SS et al.. Application of PCR and SYBR Green QRti-PCR Assays for the Identification and Quantification of Chicken Meat Under Different Cooking Conditions. Food Biotechnology 2013; 27:249-260
6. Ballin NZ, Vogensen FK, Karlsson AH. PCR amplification of repetitive sequences as a possible approach in relative species quantification. Meat Science 2012; 90: 438-443
7. Методические рекомендации МР 4.2.0019-11 «Идентификация сырьевого состава мясной продукции» (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 18 апреля 2011 г.) Metodicheskiye rekomendatsii MR4.2.0019-11 «Identify katsiya syr'yevogo sostava myasnoy produktsii» (utv. Federal'noy sluzhboy po nadzoru v sfere zashchity prav potrebiteley i blagopoluchiya cheloveka 18 aprelya 2011 g.)
