CC BY
67
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Является ли исследование мазков кала информативным методом диагностики лёгочного ангиостронгилёза у собак?
Цели: описать метод изготовления мазка кала и установить чувствительность и специфичность его исследования как метода обнаружения паразитических личинок в сравнении с методом седиментации по Берманну в качестве «золотого стандарта».
Методы: мазки кала готовили из образцов, полученных диагностической лабораторией Королевского ветеринарного колледжа для анализа методом седиментации по Берманну. Затем мазки давали опытному и неопытному лаборантам для исследования на наличие личинок, при этом на осмотр мазка давали не более пяти минут.
Результаты: было исследовано 186 образцов кала, в 28 из которых после седиментации по Берманну был обнаружен Angiostrongylus vasorum. Чувствительность исследования мазков опытным лаборантом была 61 %, а специфичность - 100 %. Соответствующие показатели у неопытного лаборанта были 54 и 95 %.
Клиническая значимость: исследование мазка фекалий - эффективный и дешёвый вспомогательный метод диагностики ангиостронгилёза у собак, легко выполнимый в обычной клинике. Он позволяет быстро обнаружить инвазию и обойтись без ненужных дополнительных исследований. Дальнейшее исследование методом седиментации по Берманну рекомендуется независимо от положительного или отрицательного результата исследования мазка.
K. Humm and S. Adamantos
Journal of Small Animal Practice (2010) 51, 200-203 DOI: 10.1111/j.1748-5827.2010.00905.x
ВВЕДЕНИЕ
Лщю8Ьгощу1ш уазотш - паразит рода метастронгилид, частая причина респираторных заболеваний и геморрагического диатеза у собак. Собачьи (домашние собаки и лисы) являются дефинитивными хозяевами Л. уазотш, промежуточными хозяевами которого служат брюхоногие моллюски (слизни и улитки) [11]. Личинки первой стадии ^1) попадают в кишечник заражённых собак после инкубационного периода разной длительно-
сти (по экспериментальным данным, от 33 до 76 дней) [1, 12, 15].
Лщю8Ьгощу1ш уа8огпш эндемичен во многих областях Европы, включая юг Великобритании. Согласно недавно опубликованным клиническим данным, его распространённость в северной Англии и Шотландии возрастает [7, 19]. По данным предыдущих исследований, в группу повышенного риска развития заболеваний вследствие инвазии входят собаки моложе года [4, 9]. По данным литературы, в Великобритании болезнь наиболее распростра-
нена у стаффордширских бультерьеров и кавалер-кинг-чарльз-спание-лей, хотя для других стран такой закономерности не описано [4, 9].
Окончательный диагноз инвазии Л. уанотш обычно ставится по результатам исследования кала методом седиментации по Берманну или исследования жидкости после бронхоальвеолярного лаважа; исследование кала методом флотации менее достоверно [16]. Такие методы, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), вестерн-блот или иммуно-ферментный анализ (ИФА), прошли аттестацию, однако готовых тест-систем пока нет в продаже [3, 5-8, 17]. Так как заражённые животные могут болеть в тяжёлой форме, диагноз инвазии Л. уазогпш желательно ставить быстро; вместе с тем многие из доступных в настоящее время методов позволяют получать результат лишь через один-два дня. Анализ мазков кала можно сделать быстро прямо в клинике, кроме того, он может использоваться для подтверждения диагноза ангио-стронгилёза, хотя недостаточно подробно описан в литературе [13, 18]. Целью данного исследования было описание способа изготовления мазков кала, подходящего для использования на практике, и оценка чувствительности и специфичности исследования мазков на наличие личинок паразита по сравнению с методом седиментации по Берманну.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На наличие Л. уа&отш исследовали образцы кала, полученные диагностической лабораторией Королевского ветеринарного колледжа для анализа методом седиментации
по Берманну на протяжении 15 месяцев. Методом седиментации исследовали все образцы с использованием уже описанной стандартной методики [20]. Результат считали положительным при обнаружении любого количества личинок Л. уаяо-гиш. Число личинок на грамм исследованного образца кала записывали. Из оставшегося кала готовили мазки по стандартизированной методике: образец кала объёмом с чечевицу смешивали с каплей водопроводной воды на предметном стекле пальцем в перчатке. Затем мазок рассматривали под микроскопом с десятикратным увеличением при опущенном конденсоре. Каждый мазок давали для исследования опытному и неопытному лаборантам. Опытный лаборант просмотрел около 50 мазков кала на Л. уазотиш до начала участия в исследовании. В качестве неопытных лаборантов приглашали студентов-ветеринаров последнего курса с небольшим опытом исследования мазков кала. Каждый мазок рассматривали разные студенты. Перед исследованием мазков студентам показывали фотографии личинок Л. уазотиш и волос под микроскопом, а также видео живых личинок Л. уазотиш. На рассмотрение мазка лаборантам давали не более пяти минут. Если лаборант сообщал, что видит паразитических личинок, мазок классифицировали как положительный. Если мазок определялся как положительный до истечения 5 минут, записывали время, потребовавшееся для этого заключения. В остальных случаях лаборант должен был сообщить о положительном или отрицательном результате по истечении 5 минут.
Чувствительность и специфичность исследования мазков вычисляли по результатам седиментации по Берманну. Вычисляли также положительную и отрицательную прогностическую ценность. Прогностическая ценность является мерой вероятности того, что собака болеет или не болеет ангиостронгилёзом при данном результате анализа [14].
Количество личинок на грамм фекалий, обнаруженное методом
седиментации по Берманну, сопоставляли с вероятностью обнаружения личинок при исследовании мазков кала.
РЕЗУЛЬТАТЫ
За период исследования в диагностическую лабораторию Королевского ветеринарного колледжа было направлено 186 образцов кала для анализа методом седиментации по Берманну, 28 из них (15%) были положительными (в них был обнаружен A. vasorum). За период исследования не было обнаружено личинок других метастронгилид. Число личинок на грамм фекалий в положительных образцах варьировало от 0,13 до более 1000. Из 28 образцов, положительных по результатам анализа седиментационным методом, 17 были признаны положительными по результатам исследования мазка опытным лаборантом, а 15 - неопытным лаборантом. Ни один из 158 образцов, отрицательных по результатам седиментационного метода, не был оценён как положительный по результатам анализа мазка опытным лаборантом, однако неопытные лаборанты выдали 8 положительных результатов. Чувствительность исследования мазков кала опытным лаборантом была 61 %, а специфичность - 100 %. Чувствительность исследования неопытными лаборантами была 54 %, а специфичность - 95 %. Положительная прогностическая ценность результатов опытного лаборанта была 100 %, а неопытного - 65 %. Отрицательная прогностическая ценность результатов опытного лаборанта была 93 %, а неопытного - 92 %.
Медианное время, необходимое для правильного заключения о положительном результате исследования мазка, составило 29 секунд (диапазон от 1 секунды до 2 минут 24 секунд) для опытного лаборанта и 1 минута 10 секунд (диапазон от 10 секунд до 5 минут) - для неопытного. Опытный лаборант правильно классифицировал все образцы с концентрацией личинок не менее 66 на грамм фекалий как положительные. Наибольшая концентрация
личинок, не выявленная опытным лаборантом, составила 24 на грамм фекалий. Однако по результатам исследования мазков неопытными лаборантами не было определено каких-либо граничных значений. Наименьшая концентрация личинок, обнаруженная неопытным лаборантом, была 16 на грамм фекалий, а наибольшая необнаруженная - более 1000 на грамм фекалий.
ОБСУЖДЕНИЕ
Идеального метода диагностики ангиостронгилёза у собак не существует. У заражённых собак могут проявляться самые разнообразные клинические симптомы, в том числе коагулопатии, респираторного или неврологического заболевания. Учитывая количество дифференциальных диагнозов и возможную тяжесть болезни, быстрая диагностика позволяет избежать ненужных исследований, снизить смертность и заболеваемость, а также дать соответствующий прогноз владельцу.
Седиментация по Берманну - распространённый метод диагностики A. vasorum. Так как обычно анализ выполняется в сторонней лаборатории и смесь выдерживается в течение ночи [20], результат удаётся получить только через сутки-двое после получения образца. Исследование жидкости бронхоальвеолярного лаважа легко провести при возможности цитологического анализа в клинике. Однако эта методика не подходит для собак с тяжёлыми дыхательными нарушениями; часто цитологические образцы отправляют в сторонние лаборатории, что замедляет диагностику. Эффективным методом представляется исследование крови с помощью ПЦР или ИФА, поскольку исследования показали многообещающие результаты при минимальной инвазивно-сти этих методов [7, 17].
К сожалению, готовые диагностические наборы для анализа крови пока не выпускаются. Учитывая эти сложности, мы изучили применимость метода исследования мазков фекалий в качестве вспомогательного средства диагностики инвазии
A. vasorum у собак. Этот метод неинвазивен, быстр и очень дёшев. Кроме того, для него достаточно очень малого количества фекалий, в отличие от метода седиментации, требующего не менее 5 г [20].
По результатам данного исследования, чувствительность обнаружения паразитических личинок в мазках опытным лаборантом составила 61 %, а неопытным - 54 % по сравнению с методом седиентации по Берманну. По-видимому, концентрация личинок - важный фактор, определяющий вероятность их обнаружения опытным лаборантом. Все образцы с концентрацией личинок не менее 66 на грамм фекалий были определены как положительные, а все образцы с меньшей концентрацией - как отрицательные. У неопытных лаборантов данного соотношения не обнаружено. Вероятно, это обусловлено разной способностью опытных и неопытных лаборантов распознавать личинки и неравномерностью их распределения в мазке. Значимость повышения частоты обнаружения личинок при их большей концентрации неизвестна, так как неизвестно взаимоотношение концентрации личинок и тяжести клинических признаков. Было бы интересно продолжить исследования в этой области. Положительная предсказательная ценность результатов опытного лаборанта была намного выше, чем неопытного (100 % по сравнению с 65 %). Если опытный лаборант оценивал образец как положительный, результат исследования седиментационным методом был всегда положительным. Положительный результат неопытного лаборанта оказывался неправильным в 35 % случаев. Таким образом, интерпретировать положительный результат исследования мазка фекалий неопытным человеком следует с осторожностью.
Отрицательная предсказательная ценность результатов была высокой как у опытного, так и у неопытного лаборанта (93 и 92 % соответственно). Следовательно, если мазок оценивался как отрицательный, вероятность отрицательного результата седиментационного анализа по
Берманну была также высокой. Причиной высокой предсказательной ценности отрицательного результата была низкая частота встречаемости A. vasorum в исследованных образцах. Если бы распространённость была выше, предсказательная ценность положительного и отрицательного результата была бы другой, хотя чувствительность и специфичность остались бы прежними [14]. В данном исследовании важное значение придавалось риску получения ложноположительного результата при анализе мазков кала неопытными лаборантами. Один неопытный лаборант выдал положительный результат при исследовании мазка кала с концентрацией личинок 24 на грамм (ниже предела обнаружения опытного лаборанта). Этот случай был расценён как ложноположительный результат (за личинку был принят волосок) с положительным результатом исследования седимен-тационным методом.
Следует отметить, что в данном исследовании не проводили окончательную идентификацию A. vasorum в мазке, а просто определяли присутствие паразитических личинок. В кале собак могут присутствовать другие личинки L1, включая Crenasoma vulpis, Oslerus osleri и Filaroides species [16].
В лаборатории Королевского ветеринарного колледжа видовое определение проводили путём микроскопического исследования личинок, обнаруженных методом седиментации при 40-кратном увеличении, на характерные признаки A. vasorum (изогнутый хвост и дорсальный гребень) [2, 10, 15, 16]. Исследование мазков фекалий было предложено в качестве метода экспресс-диагностики для практикующих врачей, и мы не предполагали видовое определение. Если наличие паразитических личинок сопровождается соответствующими клинически признаками, подозрение на ангиострон-гилёз оправдано. Следует отметить, что в данном исследовании не обнаружены личинки L1 других видов, кроме A. vasorum.
Использование метода седиментации по Берманну в качестве «зо-
лотого стандарта» можно поставить под сомнение. Известно, что концентрация личинок может значительно варьировать в разные промежутки времени [12], поэтому некоторые авторы предлагают собирать кал для седиментационного анализа в течение трёх последовательных дней для повышения достоверности [9]. Показано, что по достоверности ИФА превосходит седиментацион-ный анализ в качестве средства диагностики для собак с клиническими проявлениями болезни [17].
Возможно, это обусловлено (по крайней мере, частично) наличием 33-76-дневного инкубационного периода, который должен завершиться для появления личинок в кале. Учитывая распространённость метода седиментации по Берманну для диагностики ангиостронгилёза и отсутствие готового метода, который может считаться истинным «золотым стандартом», мы предположили, что его использование с этой целью в рамках данного исследования оправдано.
Для исследования использовали образцы, направленные в лабораторию Королевского ветеринарного колледжа, кроме того, седиментацию проводили до исследования мазков, таким образом, образцы хранились перед анализом несколько дней. Это могло снизить чувствительность исследования мазков, поскольку живые личинки обнаруживались нечасто. По опыту авторов, живые личинки часто встречаются в свежих образцах кала, и их легче обнаружить благодаря подвижности. Таким образом, чувствительность анализа свежих мазков кала может оказаться выше, чем по результатам данного исследования. Ограничение времени осмотра мазка пятью минутами также могло снизить чувствительность, так как более длительное исследование мазка могло повысить частоту обнаружения личинок. Вероятно, это менее применимо к опытным лаборантам, так как максимальная длительность исследования мазка до констатации положительного результата была 2 минуты 24 секунды, т. е. меньше предоставлявшегося времени. Нескольким
опытным лаборантам потребовалось пять минут, чтобы сделать заключение о положительном результате.
Последним осложняющим фактором является то, что исследование основывается на результатах анализа образцов, направленных в лабораторию Королевского ветеринарного колледжа. Возможно, что врачи в клиниках исследовали кал сами и отправляли пробы в лабораторию для седиментационного анализа только при отрицательном результате. Это также могло снизить чувствительность анализа мазков кала в данном исследовании, так как пропорция образцов с легко об-наружимой концентрацией личинок будет ниже, чем в среднем по популяции, с которой имеет дело практикующий врач.
В заключение можно сказать, что анализ мазков кала может служить вспомогательным средством диагностики инвазии Л. уазотиш. Этот метод обладает удовлетворительной чувствительностью и хорошей специфичностью, которые повышаются с опытом лаборанта. Исследование мазка кала следует проводить лишь при подозрении на ангио-стронгилёз и наличии у животного соответствующих клинических признаков.
При получении отрицательного результата анализа мазка следует применить другой метод, например седиментацию по Берманну. При положительном результате также рекомендуется исследовать образец другим методом для постановки окончательного диагноза с видовым определением личинок. Это особенно важно при отсутствии классических клинических признаков или при недостаточном опыте исследователя в связи с посредственной прогностической ценностью положительного результата, определённой в данном исследовании. Учитывая минимальный риск нежелательных явлений и низкую стоимость лечения животных с инвазией Л. уаяо-тиш лицензированными препаратами, это следует учитывать при нали-
чии у животных болезни в период ожидания результатов подтверждающего исследования, независимо от результата исследования мазка. Быстрота изготовления мазка фекалий позволяет быстро диагностировать ангиостронгилёз и быстро назначить соответствующее лечение, избегая ненужных и, возможно, дорогих исследований и лекарств.
Благодарности
Выражаем большую благодарность диагностической лаборатории Королевского ветеринарного колледжа за помощь в сборе образцов, многим студентам Королевского ветеринарного колледжа, принявшим участие в исследовании, а также департаменту эпидемиологии за рекомендации по статистическому анализу.
Литература
1. Barcante J.M., Barcante T.A., Ribeiro V.M., Oliveira-Junior S.D., Dias S.R., Negrao-Correa D. & Lima W.S.
(2008). Cytological and parasitological analysis of bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of Angiostrongylus vasorum infection in dogs // Veterinary Parasitology 158, 93-102.
2. Bolt G., Monrad J., Koch J. & Jensen A.L. (1994). Canine angiostrongylosis: a review // Veterinary Record 135, 447-452.
3. Caldeira R.L., Carvalho O.S., Mendonca C.L., Gra-effteixeira C., Silva M.C., Ben R., Maurer R., Lima W.S. & Lenzi H.L. (2003). Molecular differentiation of Angiostrongylus costaricensis, A. cantonensis, and A. vasorum by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism // Mem4rias do Instituto Oswaldo Cruz 98, 1039-1043.
4. Chapman PS., Boag A.K., Guitian J. & Boswood A. (2004). Angiostrongylus vasorum infection in 23 dogs (1999?2002) // Journal of Small Animal Practice 45, 435-440.
5. Cury M.C., Guimaraes M.P, Lima W.S. & Vitor R.W. (2002). Western blot analysis of the humoral response of dogs experimentally infected with Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) // Veterinary Parasitology 106, 83-87.
6. Denk D., Matiasek K., Just F.T., Hermanns W., Baik-er K., Herbach N., Steinberg T & Fischer A. (2009). Disseminated angiostrongylosis with fatal cerebral haemorrhages in two dogs in Germany: a clinical case study // Veterinary Parasitology 160, 100-108.
7. Helm J., Gilleard J.S., Jackson M., Redman E. & Bell R.
(2009). A case of canine Angiostrongylus vasorum in Scotland confirmed by PCR and sequence analysis // Journal of Small Animal Practice 50, 255-259.
8. Jefferies R., Morgan E.R. & Shaw S.E. (2009). A SYBR green real-time PCR assay for the detection of the nematode Angiostrongylus vasorum in definitive and intermediate hosts // Veterinary Parasitology 166, 112-118.
9. Koch J. & Willesen J.L. (2009). Canine pulmonary angiostrongylosis: an update // Veterinary Journal 179, 348-359.
10. McGarry J.W. & Morgan E.R. (2009). Identification of first-stage larvae of metastrongyles from dogs // Veterinary Record 165, 258-261.
11. Morgan E.R., Shaw S.E., Brennan S.F, De Waal TD., Jones B.R. & Mulcahy G. (2005). Angiostrongylus vasorum: a real heartbreaker // Trends in Parasitology 21, 49-51.
12. Oliveira-Junior S.D., Barcante J.M., Barcante T.A., Dias S.R. & Lima W.S. (2006). Larval output of infected and re-infected dogs with Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) Kamensky, 1905 // Veterinary Parasitology 141, 101-106.
13. Patteson M.W., Gibbs C., Wotton PR. & Day M.J. (1993). Angiostrongylus vasorum infection in seven dogs // Veterinary Record 133, 565-570.
14. Petrie A. & Sabine C. (2000). Diagnostic tools. In: Medical Statistics at a Glance. Blackwell Science Ltd, Oxford, UK. pp 90-92.
15. Prestwood A.K., Greene C.E., Mahaffey E.A. & Burgess D.E. (1981). Experimental canine angiostrongylosis // Journal of the American Animal Hospital Association 17, 491-497.
16. Traversa D. & Guglielmini C. (2008). Feline aelurostrongy-losis and canine angiostrongylosis: a challenging diagnosis for two emerging verminous pneumonia infections // Veterinary Parasitology 157, 163-174.
17. Verzberger-Epshtein I., Markham R.J., Sheppard J.A., Stryhn H., Whitney H. & Conboy G.A. (2008). Serologic detection of Angiostrongylus vasorum infection in dogs // Veterinary Parasitology 151, 53-60.
18. Willesen J.L., Bjornvad C.R. & Koch J. (2008). Acute haemoabdomen associated with Angiostrongylus vasorum infection in a dog: a case report // Irish Veterinary Journal 61, 591-593.
19.Yamakawa Y, McGarry J.W., Denk D., Dukes-Mce-wan J., Macdonald N., Mas A., McConnell F., Tatton B., Valentine E.G., Wayne J., Williams J.M. & Het-zel U. (2009). Emerging canine angiostrongylosis in northern England: five fatal cases // Veterinary Record 164, 149-152.
20. Zajac A.M. (1994). Fecal examination in the diagnosis of parasitism. In: Veterinary Clinical Parasitology. 6th edn. Eds R. L. K. M. W. Sloss and A. M. Zajac. Iowa State University Press, Ames, IA, USA. pp 3-93.
