CC BY
64
УДК 591.G5. 574.64. 577.336
ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК МЕТАБОЛІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ДЕЯКИХ ВОДНИХ ОРГАНІЗМІВ З УМОВАМИ ЛЮМІНЕСЦЕНТНОГО ЕКОТОКСИКОЛОГІЧНОГО БІОТЕСТУВАННЯ
О. С. ГОЙСТЕР1, Г. О. ХМЕЛЬНИЦЬКИЙ2
1 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
2 Національний університет біоресурсів та природокористування, Київ
E-mail: [email protected]
В огляді подано критичний аналіз методології біотестування токсичності водного середовища на основі таких тест-об’єктів, як дафнії та світні бактерії. Розглянуто деякі особливості обміну речовин водних організмів у токсичному середовищі з метою теоретичного обґрунтування закономірностей тісного зв’язку їхньої життєдіяльності з умовами люмінесцентного тестування.
Ключові слова: дафнії, світні бактерії, хемі-, біолюмінесценція, метаболізм, токсиканти.
Сильною стороною розвитку сучасної аналітичної біотехнології в Україні є глибокий аналіз природних явищ із суто наукових позицій та спрямованість на вирішення нагальних потреб сьогодення під час розроблення методів експресного виявлення речовин, токсичних для живих організмів. Одним із перспективних шляхів підвищення інформативності й достовірності аналітичного контролю загального забруднення об’єктів довкілля є біотестування. Аналітичними індикаторами у методах біотесту-вання виступають біологічні об’єкти та їхня реакція на дію хімічних агентів, яка є інтегральною оцінкою дії фізіологічно активних форм досліджуваної речовини.
Вплив хімічних речовин на організм дуже різноманітний і визначається не тільки хімічною природою та концентрацією речо-вини-забруднювача, а й спрямованістю її дії на ті чи інші системи та функції організму, особливостями метаболізму останнього, рівнем складності організації, резистентністю до токсичних речовин та іншими факторами. Чим складнішим є організм, тим більша кількість його життєвих функцій зазнає впливу токсиканта, причому різні функції мають неоднакові індикаторні характеристики. Реакція організму на дію
токсиканта з огляду на можливість її застосування в аналітичній практиці має бути високочутливою, мати досить чітку інтерпретацію, простий та зручний спосіб реєстрації.
Сьогодні для вирішення проблем аналізу токсичності природних систем гідним уваги виглядає поєднання біологічних та інструментальних методів на основі біо- та хемілюмінесценції. Для того щоб мати можливість чітко інтерпретувати та передбачати результати люміненесцентного аналізу, потрібні дослідження зв’язку «структура речовини — фізико-хімічні властивості — механізми впливу на біологічні системи — біологічний ефект — біотестування».
Успішне вирішення цього завдання дасть змогу проводити скринінг токсичності середовища з різним ступенем складності організації з використанням модельних ксе-нобіотиків і дозволить дати рекомендації щодо необхідності проведення подальшого хімічного аналізу для визначення основних забруднювачів та застосування заходів очищення від них середовища.
Метою цього огляду було створити теоретичне підґрунтя для глибшого і різнобічного вивчення метаболічних процесів тест-об’єктів, які використовують у сучасних методах біотестування.
Теоретичні аспекти токсикологічного тестування водних розчинів на основі Daphnia magna Straus
Загальні закономірності реагування гідробіонтів (водних організмів) на вплив токсичних речовин
Присутність гідробіонтів сприяє насиченню води вуглекислотою, поглинанню кисню, зсуву карбонатної рівноваги та рН середовища. З одного боку, в таких умовах розчинені іони можуть взаємодіяти один з одним з утворенням нерозчинних осадів або нейтральних (нетоксичних або малотоксичних) сполук. А з другого — катіони здатні утворювати з органічними речовинами, що їх виділяють гідробіонтми, комплексні сполуки типу хелатів, які нейтралізують і створюють буферність середовища [1].
Рис. 1. Морський мешканець Daphnia magna Straus (1) та морські світні бактерії (2)
Жива система характеризується множинністю реагуванння і містить такі компоненти, як гомеостатичне врівноваження, буферизація, системи депонування та зв’язування токсикантів тощо. Кінцева картина, що формується в результаті взаємодії гідробіонтів (та інших живих організмів) з токсикантами, не рівнозначна і зумовлена двома основними факторами: силою впливу токсиканта, яка залежить від його хімічної природи, біологічної активності, концентрації, тривалості й повторності впливу — з одного боку, та особливостями реагування живих організмів на цей вплив — з другого. Без сумніву, будь-яка речовина за достатньо високих концентрацій може впливати на гідробіонтів, виявляючи ушкоджувальний та пригнічувальний вплив. Токсикологічні дослідження на дафніях, проведені
Є. П. Щербань, показали, що небезпека для гідробіонтів зумовлена на перших етапах механічним засміченням фільтраційного апарату, осіданням на тілі та антенах ракоподібних, далі — накопиченням в організмі, що в кінцевому підсумку призводить до осідання на дно, припинення харчування і загибелі[2, 3].
Загальним принципом інтоксикації є різнорівневість ушкоджень та каскадність розвитку патологічного процесу. Встановлено, що для адаптивної відповіді на дію токси-кантів характерною є фазність, яка виявляється в існуванні мінімальної і максимальної ушкоджувальної дії їх та розвиткові компенсаторно-адаптивних реакцій [4].
На основі власних та літературних даних Карпевич [5] було визначено категорії концентрацій, які зумовлюють: 1 — забезпечення обміну; 2 — стимуляцію; 3 — адаптивні зміни; 4 — захисну реакцію; 5 — пригнічення; 6 — летальність. Було показано, що ток-сиканти в розчинах у низьких концентраціях (у межах десятих частин мг/л) справляють стимулювальний вплив на обмінні процеси дафній, а зі збільшенням концентрації на десятки мг/л виявляється захисна реакція особин (категорія 4) з поступовим згасанням генеративної функції (категорія 6). Токсичні речовини, навіть у дуже малих концентраціях, одразу спричиняють захисну реакцію організму (категорія 4) і відбувається вона в дуже вузькому діапазоні змін. Концентрації категорії 5, що призводять до летальності, можуть змінюватися в широкому діапазоні. Токсиканти у ще більших розведеннях, можливо, нейтралізуються нейтральними солями та іншими речовинами, розчиненими у природних водах (входять до складу екзомета-болітів), і втрачають свою токсичність.
В основі екологічної витривалості гідробіонтів у присутності токсичних речовин лежить фізіологічна толерантність (пластичність) окремих особин, що сприяє їхньому виживанню [6]. Пластичність цілих організмів базується на більшій пристосованості протеїнів, тканин і ензиматичних систем до зміни умов середовища. Саме за рахунок елімінації найбільш чутливих особин до даного токсиканта розширюється ефективність пристосування популяції. Таким чином, в основі стійкості водних організмів до токсикантів лежить відбір або здійснення генетичної адаптації.
Аналіз методології біологічного тестування на дафніях (гіллястовусих ракоподібних)
Основним видом організмів, який легко культивується в лабораторних умовах
2
в будь-яку пору року є Daphnia magna Straus (Crustacea:Cladocera) (рис. 1). Ще в 1933 р. Е. Науман [7] запропонував використовувати дафнію в ролі тест-об’єкта, або «датчика» сигнальної інформації про токсичність середовища.
D. magna належать до найбільш поширених представників зоопланктону. Популярність цих рачків як тест-об’єктів пов’язана, головним чином, з їхніми фізіологічними властивостями. За характером живлення вони є фільтраторами, чутливими до дії токсичних речовин, легко вводяться в культуру, доволі стійкі в лабораторних умовах (при культивуванні in vitro), дають цілий комплекс тест-реакцій і мають короткий життєвий цикл. Останнє дозволяє простежити наслідки токсичного впливу (навіть у малих концентраціях) протягом ряду поколінь [В].
Як критерій токсичності середовища запропоновано використовувати різні еколо-го-фізіологічні тести їхньої поведінки, такі як іммобілізація, подразливість, частота серцевих скорочень, дихальний ритм, інтенсивність споживання кисню [9]. Відомо також, що дафнії через зяброві мембрани постійно виділяють у навколишнє середовище продукти метаболізму — екзометаболі-ти, поглинаючи при цьому кисень і поживні речовини.
Біотестування із залученням таких гідробіонтів, як дафнії є загальноприйнятим і широко використовується для дослідження як токсичності різних хімічних речовин, так і якості водного середовища загалом [1G,11]. Біологічні тести на D. magna стандартизовані в багатьох країнах, у тому числі й в Україні. Вони охоплюють вимоги щодо стану культур та середовища для їх культивування, підготовки проб для біотестування та проведення гострих і хронічних дослідів [12-14].
У цілому біотестування ґрунтується на визначенні змін у виживаності та плодючості водних організмів внаслідок дії токсичних речовин, що містяться у дослідній воді, порівняно із цими показниками в контрольних умовах.
Короткочасне тестування дозволяє визначити гостру токсичну дію води на гіллястовусих ракоподібних за показником їх виживання. Гострий токсичний ефект у дафній може виявлятися комплексом симптомів, що спостерігаються візуально. До них належать: показники летальності (іммобілізація, осідання на дно посуду, судоми, смерть), рефлекторно-поведінкові реакції (невпорядковані рухи, обертання нав-
коло своєї осі), сповільнення частоти серцевого ритму, абортування яєць. Критерієм токсичності при цьому є загибель 5G% та більше піддослідних тварин протягом певного часу [15,16].
За більш тривалого тестування визначають хронічну дію за показником виживаності та плодючості тест-об’єктів. Критерії токсичності у хронічних біотестах суттєво відрізняються від таких у гострих дослідах. Вони ґрунтуються на морфологічних, гонадотропних, ембріотропних, біопродукцій-них та мутагенних ефектах, які виявляються тільки за поступового впливу хімічних речовин на організм тест-об’єкта, акумуляції їх in vivo. Реалізація методики хронічного біотестування в циклі робіт [2, 3, 17, 1В] підтверджує її перспективність і показує, що за безсумнівного кількісного різноманіття відгуків різних видів Cladocera на хронічний вплив малих доз різних за хімічною природою токсикантів суть їх завжди однозначна і призводить до зниження плодючості, порушення ембріогенезу, виникнення мутацій, скорочення тривалості життя. Не викликає сумнівів і той факт, що зниження плодючості дафній у ряду поколінь під впливом малих концентрацій токсикантів є універсальною реакцією і не залежить від хімічної природи речовин, а так само, як і експрес-реакції, є генетично детермінованим відгуком на ушкодження та кумуляцію хімічного впливу.
Слід зазначити, що величезний потенціал плодючості дафній дозволяє природній популяції швидко ліквідувати отримані ушкодження та в разі припинення впливу ушкоджувального фактора швидко повернутися до характерної для неї чисельності. Усі ці обставини належать вже не лише до біотестування як такого, а й до глибокого біологічного дослідження проблеми взаємодії гідробіонтів з токсичними речовинами на популяційному та індивідуальному (фізіолого-біохімічному) рівнях.
Деякі особливості метаболізму дафній у токсичному середовищі
Загалом резистентність водних безхребетних до впливу токсичних речовин залежить від величини депонованих в організмі вуглеводів, здатності переключати аеробний тип обміну на анаеробний в умовах дефіциту кисню, синтезувати нікотинамідні коензи-ми та накопичувати тіамін і АТФ; від пристосованості екскреторного апарату виводити отруйні продукти проміжного обміну або знешкоджувати їх.
Дафнії належать до оксифільних гідробіонтів і мають низьку резистентність до токсикантів. Найбільші біохімічні зсуви в їхньому організмі спостерігаються в перший період отруєння, коли мобілізуються захисні механізми організму, спрямовані на відновлення порушеного гомеостазу. Ця фаза супроводжується підвищеним споживанням кисню і синтезом гемоглобіну, збільшенням вмісту нікотинамідних коензимів, вітамінів та активності холінестерази, завдяки чому підтримується гомеостаз в організмі навіть в умовах тривалого впливу токсичних агентів. У разі хронічного отруєння в організмі створюються умови кисневої нестачі та асфіксії, які супроводжуються порушенням нейрогуморальної регуляції. Тварини стають нерухомими, сильно набухають, відбувається зміна іонного складу. Всі біохімічні реакції змінюють спрямованість у протилежний бік. Поступово депо глікогену, АТФ, тіаміну і т. д. вичерпуються, а накопичення токсичних для них продуктів проміжного і кінцевого обміну та акумуляція токсикантів зумовлюють перехід фізіологічних змін у патологічні, і ракоподібні гинуть.
Великий внесок в осмислення біохімічних процесів, які характеризують стан водних безхребетних на клітинному рівні, зробив Т. І. Біргер [19] ще в 70-х роках ХХ ст. Значна роль у вивченні метаболізму гідробіонтів у токсичному середовищі належить Н. С. Строганову [20], Б. А. Флерову [6], Л. П. Брагін-ському [15]; структури енергетичного балансу — Г. Є. Шульману [21], В. П. Гандзюрі [22]. Стійкість ліпідів і жирних кислот біомембран гідробіонтів до екстремальних факторів зовнішнього середовища дослідив Т. І. Регеранд [23].
Сукупність усіх літературних даних, що є на сьогодні, свідчить про те, що специфіка метаболітів, які тварини виділяють у середовище, визначається специфікою їхнього обміну речовин, який, у свою чергу, зумовлюється загальними властивостями генотипу. Це уможливлює припущення, що й характер впливу екзометаболітів принципово подібний до впливу метаболітів, які циркулюють у внутрішньому середовищі організму. Метаболіти створюють той хімічний фон, який визначає хід росту та розвиток організму і є основою для здійснення хімічної комунікації організмів у середовищі. Скинуті хітинові покриви (карапакси) містять велику кількість органічних і неорганічних речовин — продуктів метаболізму. В кінцевому підсумку вони також збагачують
хімічний фон водного середовища гідробіонтів [24, 25].
На думку С. С. Шварца [26], безперервне надходження води в організм гідробіонта призводить до того, що екзометаболіти сприймаються організмом як свої і виявляють такий самий морфологічний ефект, що й внутрішньотканинні метаболіти. Ракоподібним, окрім того, очевидно, не притаманна здатність виводити токсичні продукти проміжного обміну. Привертає увагу той факт, що під впливом токсикантів у них спостерігаються помітно виражені симптоми гіповітамінозу В1, збільшення вмісту тіамінази, зменшення суми нікотинамідних коензимів і накопичення піровиноградної кислоти як проміжного продукту вуглеводного обміну, яка може справляти на організм токсичний вплив.
Як відомо, прижиттєві й постлетальні метаболіти водних організмів відіграють не тільки трофічну роль, але й мають значну біологічну активність. Токсичні речовини гідробіонтів здатні суттєво знижувати вміст кисню та величину рН. Тому вплив цих речовин на ракоподібних пов’язаний як з порушенням фізіолого-біохімічних процесів, так і з умовами їхнього існування [27].
Експерименти з прісноводним рачком Polyphemus pediculus [28] свідчать, що речовини, виділені цими рачками у воду, впливають на обмінні процеси, ріст і розвиток, розмноження і поведінку окремих особин. Автором показано, що на всі відхилення у водному середовищі рачки реагують передусім зміною швидкості руху і, відповідно, швидкості обміну.
Хемілюмінесценція у живих системах
Процеси життєдіяльності організмів завжди супроводжуються дуже слабкою (спонтанною) хемілюмінесценцією (ХЛ). Це пов’язано з тим, що в результаті реакцій окиснення у біологічних системах формуються електронно-збуджені стани молекул продуктів. Малий квантовий вихід ХЛ в живих об’єктах пов’язаний з ефективною без-випромінювальною конверсією збудження [29]. Встановлено [30], що власне світіння тканин може бути зумовлено реакціями трьох типів:
1) реакцією так званих активних форм кисню (АФК): пероксиду водню (Н2О2), гіпохлориду (CIO-) та кисневих радикалів: супероксиду (О2-) і радикалу гідроксилу (НО*). Головним джерелом АФК в організмі є клітини-фагоцити;
2) реакціями ланцюгового (пероксидно-го) окиснення ліпідів у мембранних структурах клітин та ліпопротеїнах крові, які проходять за участю вільних радикалів ліпідів L*. та ліпопероксидів LOO*;
3) реакціями за участю оксиду азоту та супероксиду, в яких утворюється перокси-нітрит, який, у свою чергу, взаємодіючи з білком, зумовлює світіння.
Першим, хто виявив існування власного слабкого світіння клітин тварин і рослин, був російський учений О. Г. Гурвіч. Дуже слабке ультрафіолетове випромінювання клітин, яке індукує поділ навколишніх клітин, Гурвіч назвав мітогенетичними променями [31].
На сьогодні відомо багато хімічних реакцій, що супроводжуються світінням. Молекулярний механізм ХЛ було досліджено детально й описано в літературі [3G, 32]. Для реєстрації власного слабкого світіння (ХЛ) клітин та тканин рослин і тварин використовують високочутливі прилади — хемілюмі-нометри. У них світло ХЛ вимірюють за допомогою фотопомножувача, електричний сигнал від якого підсилюється, а потім обробляється і записується на ПК (рис. 2).
Рис. 2. Хемілюмінометр, приєднаний до комп’ютера для реєстрування та оброблення кривих хемілюмінесценції (on line) [30]
Спонтанній ХЛ притаманна низька інтенсивність, що є головною перешкодою для її широкого використання в аналітичних цілях. Однак у присутності певних сполук, які називаються «активаторами», світіння клітин і тканин можна підсилити на кілька порядків [33]. У біохімічних аналізах найчастіше вимірюють інтенсивність підсиленої люмінолом ХЛ. У літературі [34] є дані щодо ХЛ люмінолу за дії багатьох оксидан-тів. Окиснювальне перетворення люмінолу є багатостадійним, і початкові реакції різних оксидантів з ним неоднакові. Однак шлях перетворення гідропероксидного ключового продукту до електронно-збудженої амінофталевої кислоти один і той самий під час дії багатьох оксидантів [35]. Так, у разі стимуляції фагоцитів у процесі так званого респіраторного вибуху синтезуються сильні
окисники — супероксид-аніон-радикал, гідроксильний радикал, пероксид водню, а також сполуки з активним хлором, до яких належать гіпохлорид та органічні хлораміни. У випадку поліморфноядерних лейкоцитів (нейтрофілів) ХЛ зумовлена більшою мірою прямою початковою реакцією гіпохлориту з люмінолом; інтенсивність світіння збільшується внаслідок окиснення пероксидом водню продуктів перетворення люмінолу [36].
Високою інтенсивністю відзначається ХЛ, яка супроводжує реакцію окиснення люмінолу пероксидом водню у присутності каталізатора. Такими каталізаторами можуть бути іони металів змінної валентності (залізо, мідь, марганець), а також деякі комплекси, наприклад похідні гему, які також розкладають пероксид водню з утворенням радикалів (гідроксилу і супероксиду). У результаті люмінол перетворюється на продукт реакції — 3-амінофталат, що перебуває в електронно-збудженому стані [37].
Цікавою видається оцінка антиокисню-вальної активності води у скопиченнях гідробіонтів під час вимірювання ХЛ, що виникає в системі пероксид водню — люмінол-каталізатор. Пероксид водню розкладається на воду і молекулярний кисень, а звільнена при цьому енергія використовується для збудження люмінолу. Якщо в досліджуваній воді присутні речовини, які гальмують вільнорадикальний процес (інгібітори), то світловипускання знижується або зовсім припиняється. Ініціатори вільнорадикаль-ного процесу підсилюють інтенсивність світіння, що свідчить про збільшення швидкості хімічного окиснювального процесу. Люмінесценція водного середовища тісно пов’язана з присутністю у воді складного органічного субстрату — носія люмінесценції. Було показано, що світіння зоопланктону зумовлено речовинами, з яких складаються їхня оболонка та внутрішнє середовище. Не-забарвлені тканини тварин, які перебувають на стадії розкладання, також здатні світитися. Однією з причин світіння вод вважають розкладання залишків загиблих тварин [38,39].
Велику увагу сьогодні зосереджено на пошукові нових сполук, яким притаманна здатність вступати в хімічні реакції, які супроводжуються світінням, з хімічно активними продуктами життєдіяльності живих клітин, такими як вільні радикали і перок-сиди — хімічні активатори ХЛ.
Розглянуті літературні дані можуть бути підставою для вивчення якісного й кількісного
складу екзометаболітів водних організмів та їхньої здатності каталізувати розщеплення пероксиду водню з метою визначення токсичних речовин хемілюмінесцентним тестуванням. Перші спроби токсикологічного біотестування на основі активованої хемілюмінесценції екзометаболітів дафній здійснені під час визначення поверхнево-активних речовин, пестицидів та мікотоксинів [40, 41].
Використання біолюмінесцентних бактерій у методах екотоксикологічного біотестування
Зв’язок люмінесценції світних бактерій з метаболічною активністю
Зручність використання морських світних бактерій у процесі дослідження впливу факторів середовища зумовлена тим, що за відповіддю біолюмінесцентного сигналу на зовнішній вплив можна оцінити не тільки виживаність мікробних клітин, але і вплив того чи іншого чинника на їхню метаболічну активність.
Люмінесцентна реакція, пов’язана з метаболізмом переносників водню, жирних кислот і вуглеводів, може вважатися інтегральним показником метаболічної активності бактеріальної клітини. Наявність у клітинах світних бактерій достатньої концентрації всіх необхідних метаболітів (субстратів та індукторів) забезпечує високий рівень люмінесценції у вузькій ділянці спектра. Водночас накопичення у клітинах інгібіторів та репресорів у процесі життєдіяльності, а також вплив ряду зовнішніх факторів може призводити, поряд із загальним пригніченням метаболічних процесів, і до затухання світіння [42].
Вивчення внутрішньоклітинної організації світних бактерій, а також взаємозв’язок люмінесцентної реакції з клітинним метаболізмом триває. Передусім дослідження вчених було спрямовано на вивчення зв’язку біологічної люмінесценції з нормальним перебігом процесів у живому організмі [43-45]. Саме таким шляхом визначено ті ланцюги у клітинному метаболізмі, які є точками відгалужень реакцій, що спричинюють світіння.
На сьогодні відомо, що біолюмінесцент-на система бактерій тісно пов’язана з окис-нювальними процесами у клітині через ланцюг дихальних ензимів (дегідрогеназ, флавінових ензимів і цитохромів). На рівні дегідрогеназ і флавінів люмінесцентна реакція бактерій іде одним шляхом з диханням, конкуруючи за відновлені еквіваленти,
що їх постачає НАДН-дегідрогеназа. При цьому на люмінесценцію витрачається постійна частка енергії (10-4%) з окисню-вального каналу. Самостійною і специфічною люмінесцентна реакція стає тільки після відгалуження від флавінової ланки дихального ланцюга.
Живі організми, загалом, витрачають на біолюмінесценцію до 5-7% загальної кількості спожитого ними кисню. Енергія біолю-мінесценції не використовується організмом і необоротно губиться ним. Тому відкритими на сьогодні залишаються питання біологічної доцільності та причини виникнення біолюмінесценції в живих організмах.
Вивчення кореляції між біологічною люмінесценцією і станом клітини — одна з основних проблем біолюмінесценції. Адже інтенсивність і спектр її можуть слугувати критерієм стану або ступенем ураження окремих структур і функцій клітини.
Механізми впливу різних токсинів на конкретні ензиматичні процеси або структури у світних бактерій, насамперед енергетичні, вивчено вкрай фрагментарно. Достатня увага приділяється в літературі механізмові електронного збудження в біолюмінесцентній реакції бактерій. Адже аналіз біофізичних механізмів транспорту (перенесення) енергії, електронів, протонів у біолюмінесцентних реакціях є основою для розроблення ензиматичних біотестів [46, 47]. Важливу роль у поліпшенні умов внутрішньомолекулярного транспорту електронів відіграють тіолові сполуки. Було показано [48], що спирти (ацетон, етанол, метанол, ДМСО, ацетоніт-рил і формамід) у невеликих концентраціях збільшують інтенсивність бактеріальної люмінесценції, а за високих концентрацій пригнічують її.
На сьогодні встановлено, що кінетика інактивації біолюмінесценції відрізняється у різних груп токсинів. Однак для більшості токсинів, зокрема фенолів [49], характерним є необоротне гасіння свічення, при цьому суттєву роль відіграє гідрофобність молекули токсину (характерна також для Т-2 мікоток-сину). Доведено, що люцифераза і НАДН-дегідрогеназа мають гідрофобні зони, в яких можуть зв’язуватися ліпофільні ксенобіотики різної хімічної природи [50]. Більшість ліпофільних агентів діють безпосередньо на люциферазу, інгібуючи світіння через конкуренцію з її альдегідним субстратом. Пригнічення НАДН-дегідрогеназної активності багатьма гідрофобними сполуками здійснюється, як правило, за більш високих концентрацій речовин і може мати неспецифічну природу.
Загалом, як можливі параметри, на які передусім може бути спрямований вплив токсикантів, розглядаються такі: порушення бар’єрних властивостей мембрани, пряме інгібування люциферази або НАДН-дегідро-генази, що забезпечує відновлення флавіно-вого субстрату люциферази і цитохромів дихального ланцюга.
Перехід до безклітинних систем дозволяє внести ясність у питання про первинні мішені впливу токсикантів і відокремити мембранні ефекти від прямих взаємодій з ензиматичними системами, безпосередньо залученими у процес люмінесценції.
Дослідження в галузі механізму біологічної люмінесценції та структурно-функціональної організації люмінесцентної системи мікроорганізмів свідчать про тісний зв’язок закономірностей люмінесценції і життєдіяльності бактерій. Це дозволяє сподіватися, що біолюмінесценція стане
з часом тонким та ефективним фізичним методом вивчення біологічних процесів.
Бактеріальні біолюмінесцентні біотести
Біотести з використанням живих бактерій відрізняються від сучасних біотестів, які використовують інфузорії, дафнії, водорості та риб, лише тим, що як параметр життєдіяльності вимірюється біолюмінесценція.
До світних належить небагато видів бактерій. Це 12 видів, які належать до чотирьох родів: Vibrio, Photobacterium, Shewanella, Xenorharbdus. Більшість представників цієї групи є морськими видами, серед яких трапляються як вільноживучі, так і симбіотичні форми. Питання про шляхи інфікування люмінесцентними бактеріями морських тварин, що мають світлові органи, й досі є дискусійним. Усі світні бактерії виявляють характерну для грампозитивних видів ультраструктурну організацію [43-45].
Біотести на світних бактеріях відображають кількісну міру токсичності і часто перевершують відомі біотести за швидкодією, точністю, чутливістю і простотою, дозволяють контролювати одночасно значну кількість токсикантів [51].
Розроблення біолюмінесцентних біотес-тів відбувається у три етапи: підготовка тестової культури бактерій; власне вимірювання світіння бактерій у присутності або за відсутності аналізованих речовин; встановлення зв’язку між параметрами світіння і кількісними характеристиками токсичності середовища. Кожен з етапів має свої особливості, пов’язані з тим, яка культура бактерій використовується для аналізу. То-
му всі відомі на цей час біотести зручно класифікувати за способом приготування тестової культури (періодичної чи неперервної) або реагентів на основі бактерій. На прикладі поверхнево-активних речовин, фенолу та мікотоксину Т-2 [52-54] було показано, як виконують вимірювання в біотестах з використанням світних бактерій. !з тестової культури відбирають проби і в кюветі люмінометра реєструють світіння бактерій за відсутності аналізованої речовини — IG. Далі будують концентраційну криву: додають у кювету розчин токсину різних концентрацій та реєструють гасіння люмінесценції бактерій (I). !нгібуючий ефект визначається за величиною (I/IG),%. У разі збільшення концентрації токсину величина цього параметра зростає. За кривою розведення можна знайти концентрацію токсину, яка пригнічує світіння на 5G%. Слід зазначити, що у випадку використання малорозчинних у воді речовин (зокрема мікотоксинів), застосовують розчини їх в етанолі чи інших органічних розчинниках, і контролем слугує інтенсивність світіння у присутності розчинника.
Деякі недоліки, притаманні як періодичній культурі світних бактерій, так і неперервній, усуваються отриманням реагента на основі ліофільно висушених бактерій. Препарати ліофілізованих бактерій виробляють в !нституті біофізики СО РАН, !нсти-туті біоколоїдної хімії НАНУ та деяких зарубіжних фірмах [55]. Beckman Instruments продає ліофільно висушені світні бактерії у комплекті з біолюмінометром. Бактерії, відновлені в розчині NaCl, зберігають чутливість до мікотоксинів упродовж 5 год і для деяких токсинів вона вища, ніж у свіжій суспензії клітин.
Під час створення тест-системи на основі світних бактерій часто постає завдання підвищити чутливість бактеріальних клітин до низьких концентрацій тестованих сполук. Цього можна досягти зміною умов культивування, способу оброблення токсикантом, використанням специфічних чутливих мутантних штамів. Усі ці підходи застосовували у процесі створення тест-системи на різні феноли та їхні похідні, сульфо-похідні янтарної кислоти та гексахлоран-циклогексану (ГХЦГ) [56]. Біотести на основі мутантів застосовували також для з’ясування вуглеводної специфічності лек-тинів світних бактерій [57].
Припускають, що серед великої різноманітності мутантів можна вибрати штами, вибірково чутливі до певних речовин. Однак
успішних робіт у цьому напрямі поки що мало. Проте з’явилися праці, виконані з використанням рекомбінантних світних бактерій, де успішно експлуатується ідея про те, що випромінювальні ензими — люцифера-зи та їхні гени є вартими уваги та придатними для використання як маркери у моніторингу навколишнього середовища, а також для біохімічної діагностики в медицині.
Літературні джерела наповнені даними про розроблення нових напрямів біотесту-вання і одним з них є застосування як тест-об’єкта люмінесцентних рекомбінантних штамів різних бактерій (E. сoli, Pseudomonas, Rysobium та ін.) У роботі [5В] описали клонування та експресію генів люмінесцентної системи світних бактерій Vibrio harveyi, V. fischeri, Photobacterium leiognati в плазмідному векторі клітин різних мікроорганізмів. Було встановлено принципову можливість визначення міко-токсинів з допомогою біолюмінесцентного методу. В наступних дослідженнях було розроблено люциферазний біотест для виявлення зерна, ураженого фузаріозом [59]. Варто зазначити, що в люциферазних біотестах вплив токсичних речовин відбувається безпосередньо на люциферазу — ключовий ензим метаболізму світних бактерій. У випадку цілих бактеріальних клітин прямий вплив токсикантів на люциферазу обмежений клітинною стінкою і мембраною бактерій, які перешкоджають вільному проникненню сторонніх речовин у клітини [6G, 61], однак відбувається вплив на інші важливі процеси життєдіяльності клітини, так чи інакше пов’язані з біолюмінесценцією. Сумісне використання біолюмінесцентних біотестів in vivo та in vitro одночасно зможе гарантувати повне обстеження об’єктів довкілля на токсичність, незалежно від структури та фізико-хімічних властивостей речовин, токсичних як для цілого організму, так і для клітин і ензимів. А створення
і розроблення високочутливих біолюмінес-центних сенсорів з іммобілізованими бак-
ЛІТЕРАТУРА
1. Брагинский Л. П., Величко М. М., Щербань Э. П. Пресноводный планктон в токсической среде. — К.: Наук. думка, 19В7. — 179 с.
2. Щербань Э. П., Платонов Н. А. Биотестирование токсичности регулятора роста растений тримана-1 на ветвистоусых ракообразных // Гидробиол. журн. — 2GG1. — Т. 37, №4. — С. 39-45.
теріями та введенням lux-генів підвищить чутливість аналізу та можливість визначення токсичних речовин в експресному режимі [62-6В].
На сьогодні найширше застосування за кордоном має білюмінесцентна тест-система, розроблена фірмою Microbics Operations of Beckman Instruments, Inc. (США), відома під торговою маркою М^го^х. Цей прилад використовують у лабораторних і польових дослідженнях для контролю якості промислових і природних вод, визначення рівня токсичності новостворених хімічних сполук та фармацевтичних препаратів. У Росії інститут біофізики, Красноярськ) розроблено аналогічну тест-систему (на основі світних ліофілізованих бактерій Photobacterium phosphoreum), яка отримала фірмовий знак Мікробіосенсор. !нший варіант люмінесцентної тест-системи на основі світних ліофілі-зованих бактерій V. Fisceri та генетично модифікованого штаму E. сoli розроблено в Московському державному університеті під назвою Еколюм. Порівняно з Мікроток-сом біотест-система Еколюм не має такого обмеження, як проведення вимірювань за зниженої (15 °С) температури; окрім того зменшено кількість підготовчих операцій, що дозволяє економити час і кошти.
Викладений вище критичний аналіз даних літератури ще раз наголошує на важливості подальшого пошуку шляхів вдосконалення відомих аналітичних систем для експресної оцінки токсичності середовища. Зроблено перші кроки у з’ясуванні питання про взаємозв’язок метаболічних процесів водних організмів (як тест-об’єктів) з умовами люмінесцентного біотестування. Використання в екології біо- та хемілюмінесцентних сенсорів, які відповідають таким вимогам практики, як чутливість аналізу та простота виконання, продемонстровано під час контролю рівня мікотоксинів, зокрема Т-2 токсину, що свідчить про перспективність застосування їх на практиці.
3. Мельничук С. Д., Щербань Э. П., Лохановс-кая В. И. Оценка токсичности гербицидов на основе глифосфата методом биотестирования на ветвистоусых рачках // Там же. — 2GG7. — Т. 43, №1. — С. В4-96.
4. Грубінко В. В. Ытегральна оцінка токсичного ураження у біологічних системах // Наук. записки Тернопільськ. пед. ін-ту, 2GG5. — Т. 26, №3. — С. 111-114.
5. Карпевич А. Ф. Избранные труды. — К., 199В. — Т. 1. — С. 616-62G.
6. Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных / Под ред. Б. А. Флерова. — Л.: Наука, 199G. — 144 с.
7. Nauman E. Daphnia magna Straus als Versuchtiere // Kgl. Fysiog. Saliskap, Lund forhunde. — 1933. — V. 3, N2. — Р. 25-34.
В. Романенко В. Д., Крот Ю. Г., Сиренко А. А., Соломатина В. Д. Биотехнология культивро-вания гидробионтов. — К., 1999. — С. 95-117.
9. Методи гідроекологічних досліджень поверхневих вод / За ред. В. Д. Романенко. — К.: Логос, 2GG6. — С. 34G-364.
1G. Крайнюкова А. Н. Использование биотестирования при оценке состояния компонентов окружающей среды и контроля источников их загрязнения в условиях Украины // Актуальные проблемы водной токсикологии. — Борок, 2GG4. — С. 61-79.
11. Rand G. V., Wells P. G., McCarty L. S. Introduction to Aquatic Toxicology // Fundamentals of Aquatic Toxicology.sec.ed. — 2GG3. — P. 3-67.
12. КНД 211.14.G54-97. Методика визначення гострої летальної токсичності води на ракоподібних Daphnia magna Straus.
13. ISO 1G7G6:2GGG. Water quality — determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus.
14. Исакова Е. Ф., Колоскова Л. В. Метод биотестирования с использованием дафний // Методы биотестирования вод. — Черноголовка, 19ВВ. — С. 5G-57.
15. Брагинский Л. П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Straus и других ветвистоусых ракообразных // Гидробиол. журн. — 2GGG. — Т. 36, №5. — С. 5G-7G.
16. Брагинский Л. П., Игнатюк А. А. Визуально фиксируемые реакции пресноводных гидробионтов как экспресс-индикаторы токсичности водной среды // Там же. — 2GG5. — Т. 41, №4. — С. В9-116.
17. Brita T. A., Muyssen J. T. Multi-generation cadmium acclimation and tolerance in Daphnia magna Straus // Environm. Pollution. — 2GG4. — V. 13G, Issue 3. — P. 3G9-316.
1В. Vesela S., Ondruska V., Kuca K., Patocka J. Freshwater microcrustacean Daphnia magna Straus as an early screen model to compare toxicity of acetylcholinesterase inhibitors // J. Appl. Biomed. — 2GG6. — N4. — Р. 1G5-11G.
19. Биргер Т. И. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде. — К.: Наук. думка, 1979. — 1В9 с.
2G. Реакции гидробионтов на загрязнение / Под ред. Н. С. Строганова — М.: Наука, 19В3. — 247 с.
21. Биоэнергетика гидробионтов / Под. ред. Г. Е. Шульмана, Г. А. Финенко. — К.: Наук. думка, 199G. — 24В с.
22. Гандзюра В. П. Структура энергетического баланса гидробионтов в токсической среде // Гидробиол. журн. — 2004. — Т. 40, №1. — С.108-115.
23. Регеранд Т. И., Нефедова З. А. Метаболизм липидов водных беспозвоночных под воздействием солей алюминия и железа // Прикл. биохим и микробиол. — 2005. — Т. 41, №2. — С. 220-227.
24. Новиков М. А., Харламова М. Н. Трансабиотические факторы в водной среде // Журн. общей биологии. — 2000. — Т. б1, №1. — С.22-46.
25. Задереев Е. С. Химические взаимодействия среди планктонных ракообразных // Там же. — 2002. — Т. 63, №2. — С. 159-167.
26. Шварц С. С., Пястолова О. А. Влияние экзометаболитов на рост и развитие природных организмов // Взаимодействие между водой и живым веществом. — М.: Наука, 1979. — С. 42-47.
27. Кирпенко Н. А., Курейшевич А. В., Медведь
В. А. К вопросу о метаболитных взаимоотношениях гидробионтов // Материалы междунар. конф. «Озерные экосистемы», Минск, 17-22 сентября 2007. — С. 19-20.
28. Буторина Л. Г. Об особенностях химической куммуникации пресноводного ракообразного Polyphemus pediculus (L) Cladocera / Проблемы химической коммуникации животных. — М.: Наука, 1991. — С. 31-44.
29. Кудряшева Н. С. Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции. Ав-тореф. дис. ... д-ра физ.-мат. наук / Ин-т биофизики РАН. — 2004. — 40 с.
30. Владимиров Ю. А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соросов-ский образовательный журн. — 1999. — №6. — С. 25-32.
31. ГурвичА. Г. Митогенетическое излучение. — М.: Госмедиздат, 1934. — 124 с.
32. Part B, De Luca M., Erlou W. Bioluminescence and Chemiluminescence. — Acad. Press: New York, 1986. — 659 p.
33. Владимиров Ю. А. Активированная хеми-люминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях // Соросовский образовательный журн. — 2001. — №1. — С. 16-23.
34. Carlson R, Lewis S. W, Lim K. F. Seeing the light: using chrmiluminescence to demonstrate chemical fundamentals// Aust. J. Chem. — 1999. — V. 14. — P. 51-53.
35. Mereny G, Lind J., Ericsen T. E. Oxidation potential of luminol: is the autoxidation of singlet organic molecules an outher-sphere electron transfer // J. Phys. Chem. — 1990, 94. — P. 743-753.
36. РощупкинД.И.,Белакина Н. С.,МуринаМ.А. Усиленная люминолом хемилюминесцен-
ция полиморфноядерных лейкоцитов кролика: природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола // Биофизика. — 2GG6. — Т. 51, №1. — С. 99-1G6.
37. Фархутдинов Р. Р., Бикмухаметова Х. С., Фахитов Р. Г. Метод регистрации хемилюми-несценции крови в клинической практике // Сов. медицина. — 19В6. — №3. — С. В6-В9.
3В. Синельников В. Е. Люминесцентный анализ природных и загрязненных вод. — Обнинск, 196В. — С.67-69.
39. Алексеева В. М. Люминесцентно-микроскопические исследования жировых и ли-поидных веществ гидробионтов. — Изд-во АН СССР, Сер. биол. — 1967. — №4. — С. 56-6G.
4G. Левковець І. А., Івашкевич С. П., Назаренко В. І., Стародуб М. Ф. Застосування хемілюмінесцентного методу для визначення чутливості Daphnia magna Straus до різних типів токсичних речовин// Укр. біохім. журн. — 2GG2. — Т. 74, №6. — С. 12G-124.
41. Гойстер О. С., Стародуб Н. Ф., Хмельницкий Г. О. Оценка токсичности Т-2 микотоксина для Daphnia magna Straus методом возбужденной хемилюминесценции // Гид-робиол. журн. — 2GG3. — №5. — С. В5-91.
42. Лесняк Д. В., Попова Л. Ю. Конфликт: индукция-ингибирование люминесценции трансгенных бактерий в изучении экспрессии lux-генов // Биофизика. — 2GG2. — Т. 47, №6. — С. 1G59-1G63.
43. Чумакова Г. И., Гительзон И. И. Светящиеся бактерии. — М.: Наука, 1975. — ЮВ с.
44. Гительзон И. И., Родичева Э. К., Медведева С. Е. Светящиеся бактерии. — Новосибирск: Наука, 19В4. — 27В с.
45. Данилов В. С., Егоров Н. С. Бактериальная биолюминесценция. — М.: Изд-во МГУ, 199G. — 152 с.
46. Кудряшева Н. С., Кратасюк В. А., Есимбе-кова Е. Н. Физико-химические основы био-люминесцентного анализа. — Красноярск, 2GG2. — 154 с.
47. Немцева Е. В., Кудряшева Н. С. Механизм электронного возбуждения в биолюминес-центной реакции бактерий // Успехи химии. — 2GG7. — Т. 76, №1. — С. 1G1-112.
4В. Суковатая И. Е. Каталитическая активность бактериальной люциферазы из Photobacterium leiognathi в водно-органических смесях // Матер. ХХХVI между -нар. науч.конф. «Студент и научно-техн. прогресс»: Биология. — Новосибирск, 1999. — 125с.
49. Исмаилов А. Д., Погосян С. И., Митрофанова Т. И. и др. Ингибирование бактериальной биолюминесценции хлорфенолами // Прикл. биохим. и микробиол. — 2GGG. — Т. 36, №4. — С. 469-473.
5G. Jablonski E., Deluca M. Studies of the control of luminescence in Beneckea harveyi: properties of the NADH and NADH:FMN oxidoreductases // Biochemistry. — 197В. — V. 17, N4. — Р. 672-67В.
51. Кацев А. М. Использование светящихся бактерий для биотестирования в экологии и медицине // Матер. !Х Укр. біохім. з’їзду, Харків. — Укр. біохім. журн. — 2GG6. — Т. 77, №2. — С.^-т.
52. Кацев А. М. Черноморские светящиеся бактерии и их прикладное значение // Прикл. биохим. и микробиол. — 2GG2. — Т. 3В, №2. — С. 217-22G.
53. Кацев А. М., Стародуб Н. Ф. Влияние поверхностно-активных веществ на интенсивность люминесценции бактерий // Укр. біохім. журн. — 2GG3. — Т. 75, №2. — С. 94-9В.
54. Кацев А. М., Гойстер О. А., Стародуб Н. Ф. Изучение влияния микотоксина Т-2 на интенсивность биолюминесценции светящихся бактерий // Там же. — 2GG3. — Т. 75, №3. — С. 99-1G3.
55. Родичева Э. К., Кузнецов А. М., Медведева С. Г. Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий для экологического мониторинга // Вестник ОХОГУ ONLINE, 14 марта 2008.
56. Масленникова И. Л., Голястая Н. В. Исследование общетоксических и мутагенных свойств поллютантов микробиолюминес-центным методом // Прикл. биохим. и микро-биол. — 2GG7. — Т. 43, №4. — С. 455-461.
57. Выдрякова Г. А. Углеводная специфичность лектинов светящихся бактерий // Там же. — 2GG6. — Т. 42, №4. — С. 413-417.
5В. Кратасюк В. А., Егорова О. И., Кудряшева Н. С., Львова Л. С. Влияние фузариотокси-нов на бактериальную биолюминесцент-ную систему in vitro // Там же. — 199В. — Т. 34, №2. — С. 2G7-2G9.
59. Кратасюк В. А., Егорова О. И., Есимбеко-ва Е. Н. и др. Люциферазный биотест для определения степени поражения фузарио-зом зерна пшеницы // Там же. — 199В. — Т. 34, №6. — С. 6ВВ-691.
6G. Nicaido H. Mollecular basis of bacterial out-her membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Rev. — 2GG3. — V. 67, N4. — P. 593-656.
61. Воробьева Е. В., Красикова Н. Н. Некоторые особенности состава наружной мембраны морской граммотрицательной бактерии Chryscobacterium indoltheticum CIP Ю316Вт // Биол. мембраны. — 2GG7. — Т. 24, №2. — С. 132-141.
62. Choi S. H., Gu M. B. A portable toxicity biosensor using freese-dried recombinant luminescent bacteria // Biosens. аnd Bioelectron. — 2GG2. — V. 17, N5. — P. 433-44G.
63. Kim B. C., Gu M. B. A bioluminescent sensor for high throughput toxicity classification // Biosens. and Bioelectron. — 2003. — V. 18, N8. — P. 1015-1021.
64. Пузырь А. П., Позднякова И. О., Бондарь В.
С. Создание люминесцентного биочипа с использованием наноалмазов и бактериальной люциферазы // Физика твердого тела. — 2004. — Т. 46, №4. — С. 740-742.
65. Immonen I., Karp M. Bioluminescence-based bioassays for rapid detection of nisin in food // Biosens. and Bioelectron. — 2007. — V.
22, N9-10. — P. 1982-1987.
66. Yoo S. K., Lee J. H., Yun S. S. et al. Fabrication of a bio-MEMS based cell-chip
for toxicity monitoring // Ibid. — 2007. — V. 22. — P. 1586-1592.
67. Esimbecova E. N., Kratasyuk V. A. Diskshaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: correlation between activity and composition // Enz. and Microb. Technol. — 2007. — V. 40. — P. 343-346.
68. Деребин Д. Г., Алешина Е. С. Влияние солей на свечение биосенсора на основе природного и рекомбинантного штамма люминес-цирующих бактерий. // Прикл. биохим. и микробиол. — 2008. — Т. 44, №3. —
С. 324-329.
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ ОРГАНИЗМОВ С УСЛОВИЯМИ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ
О. С. Гойстер1, Г. А. Хмельницкий2
1Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
2Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев
E-ma.il: [email protected]
В обзоре дан критический анализ методологии биотестирования токсичности водной среды с использованием таких тест-объектов, как дафнии и светящиеся бактерии. Рассмотрены некоторые особенности обмена веществ водных организмов в токсичной среде с целью теоретического обоснования закономерностей тесной связи их жизнедеятельности с условиями люминесцентного биотестирования.
Ключевые слова: метаболизм, дафнии, светящиеся бактерии, хеми-, биолюминесценция, токсиканты.
CORRELATION BETWEEN METABOLIC ACTIVITY OF SOME AQUEOUS ORGANISMS AND CONDITIONS OF LUMINESCENT ECOTOXICOLOGICAL BIOTESTING
O. S.Gojster1, G. O. Khmelnitsky2
1Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2National University of bioresources and exploitation of natural resources of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
A critical review of methodology for biotesting of environmental toxicity based on water fleas and luminescent bacteria was carried out. Some peculiar properties of aqueous organisms’ metabolism in toxic environment were shown to establish a theoretical dependence of their activity on luminescent testing conditions.
Key words: metabolism, Daphnia magna, luminous bacteria, chemi-, bioluminescence, toxins.
