CC BY
25© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 Г.Г.Миллер, А.Я.Мухачев, \А.Ф.Быковский
ВЗАИМОСВЯЗЬ КЛЕТОЧНОГО МИКРОВЕЗИКУЛЯРНОГО ТРАНСПОРТА С ПЕРСИС-ТЕНЦИЕЙ ПАТОГЕНОВ IN VITRO И IN VIVO
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва
В обзоре представлена информация и доказательства роли микровезикул, происходящих из клеток про- и эукариотов, в инициации и развитии персистентного состояния у различных патогенов человека и животных. Информация о других свойствах микровезикул, в том числе их роли в различных соматических патологиях, межклеточном взаимодействии и внутриклеточном транспорте биологически активных макромолекул, а также в происхождении жизни и эволюционном прогрессивном или редукционном процессе освещается только справочно.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 63—70
Ключевые слова: микровезикулярный транспорт, про- и эукариоты, персистенция, патогены человека и животных
G.G.Miller, A.Ya.Mukhachev,\A.F.Bykovsky
INTERCONNECTION BETWEEN CELL MICROVESICULAR TRANSPORT AND PATHOGENS PERSISTENCE IN VITRO AND IN VIVO
Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
This review presents an information and proof evidence toward to the role of microvesicles, originating from the different sources pro- and eucaryotes in the initiation and development of persistence of several human and animal pathogens. Also an information about another properties of microvesicles, as well as the reference of role in the different somatic pathology, intercellular interaction and in the intracellular transport of biologically active macromolecules as well as life origin and evolutionary events.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015,No. 4, P. 63—70
Key words: microvesicular transport, pro- and eucaryotes, persistence, human and animal pathogens
В 2013 году трем ученым из США и Германии J.Rothman, R.Schekman и T.Sudhoff была присуждена Нобелевская премия по физиологии с формулировкой «За открытие машинерии, регулирующей везикулярный трафик — главную транспортную систему в клетках про- и эукариотов» [48]. Работы лауреатов инициировали мощную волну научного интереса, что реализовалось более чем в 3600 публикациях, вышедших за последние 5 — 6 лет, в основном посвященных определяющей роли микровезикул в межклеточных коммуникациях, сигнальной роли и как возможного источника биомаркеров различных патологических состояний, включая онкологию, в клетках про- и эукариотов, отражая, тем самым, единую универсальную систему жизнедеятельности живых организмов.
Для выработки единого языка общения и привлечения дополнительного внимания к этой проблеме S.Mathivanan, R.Simpson, H.Kalra с соавторами из Австралии учредили в 2010 году сайт www.Exocarta.org и журнал для сверхбыстрых публикаций в течение месяца «J.Extracellular Vesicles», принимающего все сообщения, касающиеся экстрацеллюлярных везикул (eMVs), в том числе ранее не опубликованные [45]. Общее определение для всей группы микровезикул предлагает обозначать их как «экстрацеллюлярные микровезикулы (eMVs) — класс окруженных липидной бислойной мембраной органелл, секретируемых различными типами клеток и обладающих множеством функций» [25, 36, 44]. Но при этом возникли две проблемы, требующие немедленного решения.
Первая проблема — в оформлении международной терминологии для класса eMVs, выработанной на основе структурных исследований в электронном микроскопе. Вначале eMVs идентифицировались по источнику происхождения. Например, экзосомы — мембранные везикулы эндоцитозного происхождения, eMVs (40 — 100 нм в диаметре); эктосомы — шед-
динг-микровезикулы, SMVs (50 — 500 нм), которые слущиваются в процессе шеддинга непосредственно с плазматической мембраны клеток, они же внешние мембранные везикулы (OMVs); производные дендритных клеток — дексосомы, DSs (30 — 100 нм); большие мембранные везикулы MVs (50 — 1000 нм), экзосомы раковых клеток — тексосомы/онкосомы (60 — 150 нм), а из простаты — простатосомы (50 — 100 нм). Это привело к возникновению более 16 различных номенклатур: эпидидимосомы, аргосомы, экзосомы и экзосомо-подобные везикулы, апоптотические блебы (blebs) (самые крупные везикулы до 1000 нм), микрочастицы, на-ночастицы, микровезикулы, шеддинг-микровезикулы, эктосомы, промининосомы, простатосомы, археосомы, онкосомы, тексосомы. Определенные экскретируемые микровезикулы
— биологически активные органеллы клеток эукариотов, обозначены как протеасомы [27]. Все это нуждается в упорядочении и в принятии какого-то консенсуса. При его выработке предлагается учитывать три основных механизма, с помощью которых везикулы освобождаются из клеток: экзоцитозное слияние внутриклеточных мультивезикулярных телец, результирующее в «экзосомах»; почкование везикул непосредственно с плазматической мембраны
— «эктосомы» и большие апоптотические блебы (blebs) [46].
Вторая проблема заключается в получении изолированных и очищенных eMVs для корректного исследования их свойств. Несмотря на то, что ученые значительно продвинулись в понимании природы микровезикул, большая часть исследований получена на кросконтамини-рованных препаратах из-за большой вариабильности в их размерах и внутренней композиции [47]. Разнообразие морфотипов микровезикул вначале затрудняло их интерпертацию как единого биологического феномена. На этом основании ряд исследователей отказывался обсуждать функции микровезикул, не содержащих генетического материала [3, 17]. С применением метода протеомного анализа композиционного состава микровезикул наиболее убедительные данные были получены на прокариотических моделях в основном грамнегативных бактерий [21]. Но уже имеются единичные сообщения и о грампозитивных бактериях. У последних были описаны микровезикулы 20 — 130 нм с содержанием от 90 до 143 белковых компонентов [28, 21]. В обоих случаях им приписывают транспортную функцию [15]. Однако методом ПЦР удалось документировать ДНК внутри мембрано-производных микровезикул только у грамнегативных (Neisseria gonorrhoeae), но не у грампозитивных бактерий [21]. В настоящее время все же наиболее предпочтителен метод иммунноаффинной ловушки с моноклональными антителами к мембранному белку eMVs. Но уверенности в получении чистого монопрепарата здесь тоже недостаточно. Поэтому сегодня, как и в начале пути, преимущественным методом индикации, идентификации и процессинга eMVs остаются морфологические методы высоко разрешающей трансмиссионной, сканирующей, конфокальной микроскопии, а также эти же методы с применением иммунных меток, без чего сегодня не обходится ни одна публикация в мировой литературе.
Коротко напомним несколько примеров из уже известных и доказанных свойств микровезикул, таких как осуществление межклеточных коммуникаций [35, 41, 46], участие в механизмах своевременной доставки биомолекул в нужное место [28]. Нарушения этих процессов приводят к болезням ЦНС и эндокринной системы (например, инсулина при инсулинзави-симом транспорте глюкозы в мышечную и жировую ткани). Секреция цитокинов иммунными клетками и других иммунологических молекул, управляющих врожденным и адаптивным иммунитетом [18]. На систему везикул транспорта (TVs) действуют различные токсины. Например, ботулотоксин, расщепляющий компоненты синаптического комплекса, что приводит к блокированию медиаторов, параличу и смерти. Последние годы увенчались важнейшими находками, доказывающими наличие у микровезикул киллерных свойств по отношению к своему же источнику происхождения, наподобие аутоиммунного процесса у многоклеточных организмов [15, 34]. Показан антибиопленочный эффект микровезикул в системе нейтрофил
— биопленка S.aureus, который обсуждается с позиций присутствия в их составе функционально активных энзимов нейтрофилов, разрушающих биопленочную мантию, но не свободные бактериальные клетки [15]. Значительное повышение количества протеасом в плазме онкологических больных позволяет рассматривать их в качестве опухолевых маркеров [14]. Другие уже многочисленные на сегодня исследования позволяют оценивать определяющее функциональное значение микровезикул без преувеличения для всего древа жизни и влияние везикуло-опосредованных процессов на всю биологию [17]. Необходимо также включить микровезикулы в обсуждение их участия в двунаправленной микроэволюции (прогрессивной и редукционной) [29].
Иначе говоря, микровезикулы — это основная разновидность внутри- и межклеточного транспорта у про- и эукариотов в норме и патологии, которая пока совершенно недооценена [20].
Ниже мы хотели бы обсудить примеры формирования, процессинга и функционирования
микровезикул разных категорий и везикуло—опосредованных процессов, индуцирующих различные персистентные состояния в системах про- и эукариотов. При описании наших исследований мы будем сохранять собственную номенклатуру микровезикул, употреблявшуюся на протяжении более 40 лет, поскольку к настоящему времени все эти данные уже были опубликованы именно в таком виде.
Микровезикулы при различных соматических заболеваниях (нанобактерии). Пока шла интенсивная работа по изучению секреторного аппарата клеток про- и эукариотов и механизмов внутриклеточного микровезикулярного транспорта в 70-х — 80-х годах прошлого столетия, мало кто задумывался об ожидающих нас глобальных перспективах этих исследований. Поэтому параллельно широко разрабатываемая проблема мельчайших форм жизни, названных «нанобактерии», а в зарубежной литературе «Nanobes» [25, 26], выделилась в отдельное направление в биологии. Термин впервые ввел R.Morita в 1988 г. [32]. Однако основателем считается R. Folk [25, 43], опубликовавший серию работ с использованием структурного анализа в электронном микроскопе, посвященных условиям образования мельчайших наночастиц (10 — 150 нм диаметром, окруженных оболочкой), распространения и роли в физиологических и патологических состояниях (в первую очередь, формировании персистирующего состояния), а также как источника биоразнообразия и участия в эволюционных событиях [32]. С определенного момента стало очевидно, что эти мельчайшие формы сопровождают популяции практически всех известных на сегодня биологических систем про- и эукариотов как in vitro, так и in vivo [4, 30]. Более того, наноструктуры как самостоятельные частицы многократно «уличены» в причастности к разнообразным соматическим патологиям, поскольку были обнаружены непосредственно в патологическом материале (крови, синовиальной жидкости больных артритом, моче, почечных и желчных камнях, мягких тканях, теле матки и плаценты [30 — 32]. В то же время, безгеномным наночастицам значения не предавали и в номенклатуру не включали [17]. Тем не менее, с 1990-х годов подробному анализу мельчайших организмов, имеющих простейшее клеточное строение с содержанием генетического материала или лишенным его, посвящено огромное количество публикаций. Была предпринята попытка определить минимальный набор генов, обеспечивающий жизнеспособность минимальных образований, производных от полноразмерного генома — источника их происхождения [16].
С тех пор наше понимание о спектре и значении всех мельчайших структур живой природы настолько продвинулось, что мы можем с определенной долей уверенности считать «Nanobes» составным компонентом номенклатуры микровезикул. Интересно отметить, что исследователи, разрабатывавшие проблему «Nanobes», не обратили на эти работы чрезвычайной важности должного внимания и рассматривали эти образования как самостоятельную биологическую стуруктуру.
Микровезикулы, производные от вирионов (виросомы, МиФ). Вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты и доминантные компоненты биосферы [49]. Будучи сами нанометрового размера, они являются источником формирования еще более мелких наноструктур (микровезикул 10 — 100 нм в диаметре), окруженных оболочкой и содержащих или не содержащих генетический материал. Такие структуры суммарно мы назвали виросомами или МиФ — минимальными формами вирусов [2], поскольку оболочка и тех, и других композиционно представляет собой вирусом — модифицированную клеточную мембрану. За более чем 40-летний опыт работы в области структурного анализа в сфере наших интересов оказывались практически все известные на сегодня биологические модели клеток про- и эукариотов в системах in vitro и in vivo. На этих основаниях была выявлена закономерность, что МиФ обильно образуются преимущественно в долго живущих клетках, инфицированных или трансформированных нелитическими агентами [3]. К ним относятся, в первую очередь, все онкогенные и медленные вирусы — то есть те РНК-геномные вирусы, которые персистируют в этих клетках и созревают путем почкования на наружной клеточной мембране [2, 3, 6]. Прежде всего, это семейство Retroviridae, подсемейство Orthoretrovirinae (роды от Alfa- до Gammaretovirus), представители которых пронизывают жизнь всех существующих на Земле видов от дрожжей и дрозофилы до приматов и человека [10]. Мы не наблюдали виросом, производных от ДНК-геномных вирусов эукариот, если только это не были мембрано-производные безгеномные микровезикулы. В то же время, для прокариотов фрагменты ДНК-геномного материала были документированы в микровезикулах, производных от клеточной стенки как грамнегативных, так и грампозитивных бактерий [21, 28, 34], указывая, тем самым, на абсолютную универсальность этих наноструктур, что сегодня уже бесспорно.
У эукариотов виросомы, как правило, не продуцируются клетками при острых инфекциях РНК- и ДНК-геномными литическими вирусами типа гриппозной, парагриппозной, корона-вирусной, респираторно-синцитиальной (хотя эти последние также созревают на клеточной поверхности путем почкования и высвобождаются во внеклеточное пространство), а также
5. ЖМЭИ 4 № 14-2015
65
полиомиелитной, поксвирусной, аденовирусной, парвовирусной и другими. Такую ситуацию логично объяснить быстрой гибелью остро инфицированных клеток после попадания в них вируса, чаще всего по механизму вирусом индуцированного апоптоза. И это единственные микровезикулы — аппоптозные микровезикулы — блебы.
Вторым способом формирования МиФ является почкование микровезикул размером 10 — 50 нм непосредственно с поверхности вирусной частицы. В зависимости от величины микровезикулы в них локализуются разноразмерные фрагменты вирусного генома. Такая картина более всего типична как для онкогенных, так и для медленных вирусов [3]. Важнейшей моделью для изучения функциональности МиФ является ВИЧ-инфекция. С помощью метода высокоразрешающей трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что мембрана микровезикул в вирус-продуцирующих клетках композиционно представлена типичными компонентами зрелых вирионов — гликопротеинами gp 120, осмиофильным слоем подлежащего под мембраной матриксного белка p17 — предшественника белка сердцевины вириона р24, являющегося главным антигеном вируса. У части микровезикул, равно почкующихся с клеточной поверхности или с поверхности зрелых внеклеточных вирионов, внутреннее содержимое может быть представлено также фрагментами нуклеокапсида р24. Нельзя исключить присутствия и других компонентов вириона, отвечающих за его репликацию и репродукцию, например молекулы обратной транскриптазы, которая топографически ассоциирована с нуклеокапсидом. Эти сведения и поднимают вопрос о роли морфотипов МиФ в патогенезе ВИЧ-инфекции. Прежде всего, нет препятствий для их связывания с клеткой, благодаря наличию на оболочке главного фьюжн-белка gp 120. Этот белок известен способностью индуцировать слияние клеток с образованием нежизнеспособных симпластов и последующей их гибелью. Возможно, что описанный феномен служит одним из ответов на вопрос, почему при ВИЧ-инфекции большинство быстро погибающих СD4+ Т-лимфоцитов не содержат вируса [42]. Другой важнейшей задачей будет решение вопроса о функциональности МиФ, содержащих фрагменты РНК-генома ВИЧ и их дальнейшей судьбе. Есть три предположения на этот счет: МиФ не функциональны вообще; их единственной функцией является слияние клеток и усиление раннего апоптоза; МиФ, содержащие фрагменты генома, проникают в клетку и вызывают инфекционный процесс, отличный от такового при инфекции полноценным вирусом. Для последнего предположения необходимо доказать функциональную способность отдельных доменов фрагментарного РНК — генома ВИЧ, поскольку известно, что размер доменов генома не так важен, как их взаимная ориентация (третичная структура) [10]. Кроме этого, надо иметь в виду, что ретровирусы обязательно включают в состав своего генома фрагменты хозяйских ДНК и РНК и переносят их из клетки в клетку. Если даже часть перечисленных компонентов наполняет микровезикулы из ВИЧ-инфицированных клеток, то самое малое, что можно предположить — это то, что мы еще не все знаем о патогенезе ВИЧ-инфекции, до самого смелого предположения, что может иметь место появление нового мор-фотипа (фенотипа, генотипа) вируса с непредсказуемыми свойствами.
Образование безгеномных виросом ВИЧ мы наблюдали также после обработки вирус-ин-фицированных клеток препаратом в лечебных дозах, с которых началась клиниче-
ская терапия ВИЧ-инфекции в начале эпидемии [9]. Первым обнадеживающим эффектом было снижение в крови вирусной нагрузки р24 в ИФА до неопределяемых значений и улучшение состояния больных. Было известно, что обладает иммуномодулирующими свойствами, стимулируя иммунные реакции, а также подавляет репликацию мРНК, но не затрагивает процессинг и сборку вирусных белков [10]. В результате после обработки интерфероном вирусная популяция морфологически была представлена только безгеномными микровезикулами диаметром 160 нм, но с сохранением интактной композиции оболочки зрелого вириона. Способность микровезикул любой композиции проникать обратно в клетку-донора мы описали выше. Сопоставив этот процесс с быстрой прогрессией иммунодефицита на фоне интерферонотерапии, можно еще раз убедиться в функциональности виросом. Впоследствие стало очевидно, что любая стимуляция клеток иммунной системы при ВИЧ-инфекции фатальна для пациентов, что в итоге вынудило клиницистов отказаться от лечения этим препаратом [9].
Микровезикулы в клетках при гепатите С. На протяжении всего периода изучения вируса гепатита С мы все больше утверждаемся во мнении, что он не является классическим вирусом в сегодняшнем понимании на следующих основаниях. Прежде всего, почти за 35-летнюю историю его изучения и наличия высокопрецизионной техники для ультраструктурного анализа, он так и не был идентифицирован морфологически, по-видимому, из-за того, что не имеет многих характерных признаков каких-либо известных вирусов. В единственной публикации более 30 лет тому назад были продемонстрированы всего две сферические частицы около 60 нм в диаметре со слабо осмиофильным внутренним содержимым (только у одной из
них), не соответствующим классической плотности молекул РНК [24]. Зато они вполне укладываются в нашу номенклатуру МиФ или в категорию микровезикул (eMVs), что теперь выглядит более точно, обладая всеми соответствующими признаками. Они способны экскрети-роваться из клеток и снова реадсорбироваться и проникать внутрь клеток, то есть персистировать в различных состояниях. В случае функциональности они могут быть причиной и хронической инфекции, и цирроза печени или онкологического процесса [40, 41]. Соответствуют концепции зависимой регулируемой продукции [23] (здесь имеется в виду нерегулярное документирование признаков наличия этого «агента» у пациентов при динамическом наблюдении). Отличаются «неразборчивостью» агента в тропизме к тканям; вариабиль-ностью генотипов, наличием общих аминокислотных последовательностей с различными независимыми группами как растительных, так и животных вирусов [37]; наличием общей нерешенной для eMVs проблемы — отсутствием надежных методов лабораторного тестирования при попытках их изолирования из-за кросконтаминации при дифференциальном центрифугировании или из-за разброса по плотности (от 1,04 г/см до 1,24 г/см) в градиентной очистке, различающимся, к тому же, по биохимическим характеристикам; отсутствием устойчивых лабораторных моделей клеточных культур или животных для корректного изучения патогенеза, что является препятствием для создания вакцин или эффективных лечебных препаратов. Важно также отметить, что для этого «агента» определена строгая потребность в ко-факторах [5, 7]. Очевидным, по нашему мнению, является только тот факт, что печеночные патологии в отсутствие уверенно документированных других видов вирусов гепатита, развиваются в результате персистенции специфических микровезикул как минимум двух видов (т.е. как содержащих генетический материал, так и без него). Понимание перечисленных признаков может быть основой для поиска места этих структур в семействе вирусов гепатитов. Похоже, что в рассматриваемой проблеме эволюционные процессы могут быть двунаправленными — как прогрессивными, так и редукционными. Здесь, наверное, уместно вспомнить работы В.Г.Тимофеева-Ресовского о микроэволюциях, представляющих собой совокупность эволюционных процессов, протекающих внутри отдельных или смежных популяций вида [29, 33]. И тогда это будет только вопрос терминологии, если микровезикулы, персистирующие в клетках печени при данной патологии, можно будет описать действительно как новый структурный морфотип — этиологический агент гепатита С. Из этого следует, что если все сказанное верно, то это открывает путь для новых подходов к созданию специфических лечебных препаратов (возможно комплексной таргетной терапии), однако не вызывает такого оптимизма в отношении создания вакцины.
Микровезикулы, производные специализированных клеток эукариотов (протеасомы). Некоторым видам микровезикул, именуемых протеасомами (например, продуцируемых нейтро-филами), приписывают киллерные или бактерицидные функции [15, 20]. Нейтрофил-производные протеасомы представлены сетевидными структурами из нуклеиновых кислот и ферментов, освобождаемых из клеток во внеклеточное пространство в процессе шеддинга. Авторами открыт и расшифрован механизм уничтожения патогенов, используемый активированными нейтрофилами. Благодаря наличию в протеасомах нуклеиновых кислот и ферментов феномен получил название «нейтрофильных ловушек» (NETs). Процесс шеддинга про-теасом происходит регулярно как в трансформированных, так и в нормальных клетках и является регулируемым. Более того, как показано с помощью конфокальной микроскопии, покидая одну клетку, они быстро проникают как в свою, так и в клетку другой тканеспецифич-ности, что доказывает их участие в межклеточных коммуникациях. Получены также доказательства влияния протеасом на снижение экспрессии анти-апоптозного гена-регулятора bcl-2 и bcl-xl, а также c-myc и survivin в клетках-реципиентах [14]. По-другому ведут себя секрети-руемые из клеток 26S протеасомы, осуществляющие контролируемый протеолиз и процессинг регуляторных белков. Эти наноструктуры играют ключевую роль во всех клеточных процессах: дифференцировке, апоптозе, проведении сигналов, иммунных реакциях, продвижении клетки по фазам клеточного цикла [23]. Недавно появились сообщения о передаче от клетки к клетке функционально активных молекул микро-РНК через экзосомы. Оказалось, что с про-теасомной популяцией в клетке ассоциирован набор малых РНК размерами 20 — 300 нуклео-тидов, включающий в себя РНК-транскрипты ретротранспозона Alu [14]. Из этого можно сделать вывод, что протеасомы могут играть роль переносчиков генетической и негенетической инфрмации, независимо от тканеспецифичности.
Микровезикулы, производные от ЦТЛ (мембраносомы, МС). Впервые в нашей лаборатории в начале 80-х годов были описаны структуры, названные мембраносомами (МС) и образующиеся в результате гипертрофированного шеддинга с поверхностной мембраны цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов (ЦТЛ, Т-киллеров) уже через 30 минут после их контакта с опухолевой клеткой мишенью [1, 19]. По своей ультраструктуре — это сложные образования вариабильных
размеров с линейным диаметром от 10 до 100 нм. Их процессинг происходит из клеточных микросом, формирующихся на ГЕРЛ-комплексе с рибосомами снаружи. Они покрыты липидно-белковой мембраной, по определению включающей в свой состав мембранный холестерин, ферменты и т.д. Скорее всего, МС не содержат элементов клеточного генома, но возможно, что они несут на своей поверхности Т-клеточные рецепторы (TCR) с молекулами-лигандами, а также цитотоксинами, которые распознают свой антиген в кооперации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC-1) при тактильном взаимодействии с мембраной опухолевых клеток мишеней для киллерной атаки, вызывая их лизис по механизму апоптоза, на что указывают специфические ультраструктурные изменения этих клеток (наличие апоптотических блебов). Таким образом, в этом исследовании впервые был расшифрован механизм киллерного эффекта ЦТЛ при их взаимодействии с опухолевой клеткой мишенью.
Микровезикулы, призводные от микоплазм. Важно также обсудить вопрос о механизмах, которые используют бактерии для персистенции в тканях и органах макроорганизма. Как бактерии заботятся о своем сохранении в покоящемся состоянии без напряжения иммунной системы хозяина и действия бактерицидных факторов? Одним из первых примеров служит проблема L-форм бактерий, которой было в свое время посвящено много серьезных и детальных исследований [11]. Сегодня, по-видимому, ее можно переместить в обсуждаемую здесь проблему микровезикулярного транспорта с переоценкой способов функционирования и истинного биологического значения.
В работе [38] приводятся экспериментальные доказательства персистенции микровезикул, производных от микоплазм. Предполагается, что микровезикулы, оставшиеся после фильтрации нормальной клеточной популяции через фильтры с порами 20 нм, содержат участки генетической информации, позволяющие им реверсировать в культурах Т-лимфоцитов после последовательных пассажей в течение 3 недель в полноразмерные бактерии, даже если фильтрат был разведен до 10-6. Авторы предположили, что реконструкция полноценного генома происходит не без участия эукариотической клетки.
Впервые непосредственно из крови пациентов мужского пола с хроническими воспалительными заболеваниями мочеполовой сферы И.В. Раковская и др. [12, 13] получили на агаре рост смешанной культуры, типированной как Mycoplasma hominis и представленной двумя разными типами колоний: большого размера, содержащими полногеномные вегетативные клетки, и миниколонии, состоящие из гетероморфной популяции миниклеток (15 — 100 нм в диаметре) [12, 13]. Только часть из них имела внутреннее содержимое, в то время как большая часть представляла собой полые микровезикулы.
Идентичные по морфологии и размерам миниколонии, состоящие из миниклеток M. hominis, но уже в однородной монокультуре были также получены нами искусственно в лабораторных условиях в результате обработки обычной стационарной культуры M.hominis двумя разными видами физической «холодной» плазмы — низкотемпературной электролитической (NTEP) [8] и низкотемпературной аргоновой (NTP) [22]. Несмотря на то, что эти два вида плазмы генерируют различные заряженные частицы, метастабильные молекулы и радикалы c разными механизмами воздействия на биологические системы, полученные миниколонии c миниклетками имели морфологию и биологические свойства, идентичные с выделенными от людей. Появление в нашем распоряжении монокультуры, состоящей только из миниклеток, позволило изучить их ростовые и биологические характеристики, достоверно определить в ПЦР наличие фрагментов ДНК-генома микоплазмы, по крайней мере, для части популяции (что можно было наблюдать также при электронно-микроскопическом исследовании) и ти-пировать ее как M.hominis [22]. Эти миниклетки также обладали патогенностью, хотя и значительно сниженной по сравнению со стационарной культурой [13].
Ранее существовало представление, что микоплазмы эволюционно произошли от грампо-зитивных бактерий, потеряв клеточную стенку, и содержат минимальный геном с низким процентным содержанием G+C оснований [39]. Наши сведения указывают на то, что, видимо, еще более низкое содержание генетического материала в миниклетках способно, тем не менее, функционировать и воспроизводиться. Подтверждением служит то, что миниколонии M.hominis продолжают пассироваться на агаре уже более 3 лет и вызывать патологический процесс у мышей [13]. При этом их популяция остается такой же гетерогенной по размерам и композиции. Таким образом, это первый пример популяционной персистенции микровезикул in vivo, обладающих патогенностью.
Заслуживающие, по нашему мнению, особого внимания сведения мы получили после обработки NTEP эукариотических клеток, спонтанно контаминированных микоплазмой. Исследования проводились в поисках путей альтернативных неэффективным антибиотикам, для деконтаминации производственных биотехнологических субстратов от глобально рас-
пространенной in vitro и in vivo микоплазма-контаминации [8]. Первые после обработки высевы на селективные для микоплазмы среды не выявили присутствия в бульоне типичных колоний. Однако наличие микровезикул, морфологически идентичных выделенным от людей морфотипам, было документировано электронно-микроскопически в обработанных клетках. Этот феномен, аналогично отмеченному в [38], можно также рассматривать как выработку микоплазмой защитного фактора для сохранения вида и дальнейшего поддержания перси-стентного мембранного паразитизма.
Таким образом, сегодня мы имеем достаточно информации о способах образования микровезикул и наличия у них многочисленных специализированных функций, таких как идеальных упаковочных систем для переноски активных макромолекул, осуществления межклеточных коммуникаций, киллерных свойств и, самое главное — персистирования во всех биологических системах. По-видимому, настало время для пристального анализа причинно-следственных связей микровезикулярного транспорта с жизнедеятельностью про- и эукариотических систем вплоть до появления новых патогенов, приобретших такие свойства или индуцируюших их в ходе прогрессивного или редукционного эволюционного процесса.
Кроме того, представляется, что микровезикулярный аппарат — абсолютный кандидат в качестве обязательного компонента для любой комплексной таргетной терапии. Для этого необходимо развивать методы его всесторонней характеристики в изолированном и очищенном состоянии. Структура и функции микровезикулярного аппарата подвержены постоянному динамическому изменению, зависимому от каждого донора и реципиента и, по-видимому, благодаря постоянно протекающим процессам трансформации и микроэволюционных событий. Важно отметить также высокую устойчивость микровезикул различного происхождения к внешним воздействиям как биологического, так и физического характера.
Л ИТЕРАТУРА.
1. Быковская С.Н., Раушенбах М.Б., Быковский А.Ф. Шеддинг мембраны цитотоксического Т-лимфоцита после взаимодействия с опухолевой клеткой мишенью. Иммунология. 1980, 4: 431-435.
2. Быковский А.Ф., Клицунова Н.В. Минимальные формы вирусов (МиФ), персистирующие в клетках млекопитающих. ДАН СССР. 1975, 224 (1): 226-228.
3. Быковский А.Ф., Клицунова Н.В., Миллер Г.Г., Горохова Л.В., Мартыненко В.Б. Онкогенные вирусы. Атлас. М., Медицина, 1983.
4. Вайнштейн М.Б., Кудряшова Е.Б. О нанобактериях. Микробиология. 2000, 68: 163.
5. Дерябин П.Г. Гепатит С: современное состояние и перспективы. Вопросы вирусологии. 2012, прилож. 1: 91-103.
6. Миллер Г.Г. Наночастицы в инфекционной патологии. Вестник новых информационных технологий. 2009, 1: 2-5.
7. Михайлов М.И. Вирус гепатита С. Российские мед. вести. 2007, 4: 56.
8. Мухачев А.Я., Раковская И.В., Миллер Г.Г., Ермолаева С.А. Действие низкотемпературной плазмы на различные виды микоплазм in vitro. Журн. микробиол. 2013, 2: 28-37.
9. Покровский В.В.,Ермак Т.Н., Беляеа В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция. Клиника, диагностика и лечение. М., ГЕОТАР Медицина, 2000.
10. Практическое руководство по вирусологии. Д.Львов (ред.). М., МИА, 2013.
11. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий. Механизмы образования, структура, роль в патологии. М., Медицина, 1973.
12. Раковская И.В., Бархатова О.И., Гамова Н.А., Горина Л.М., Миллер Г.Г «Мини-клетки» и «мини-колонии» микоплазм, выделенные из крови людей, инфицированных M.hominis. Лаб. клин. диагностика. 2010, 9: 31-32.
13. Раковская И.В., Бархатова О.И., Гамова Н.А., Горина Л.М., Миллер Г.Г. Нетипичные формы микоплазм, персистирующие в организме зараженных ими людей. Лаб.клин.диагностика. 2011, 12: 35-38.
14. Цимоха А.С., Зайкова Ю.Я, Куличкова В.А. Регулируемый экспорт протеасом из клеток хронической миелоидной лейкемии человека линии К562. Цитология. 2010, 52 (4): 277-300.
15. Чеботарь И.В., Кончакова Е.Д., Бугрова М.П. Везикулярные структуры в системе нейтрофил-биопленка S. aureus. Инфекционная иммунология. 2012, 4: 35-39.
16. Akerman K.K., Kurone I., Kajander E.O. Scanning electron microscopy ofnanobacteria novel biofilm producing organisms in blood. Scanning. 1993, 15 (Suppl. III): 90-91.
17. Benedicte H., Carmen M., Corrine K., Freyssinet J.-M. Membrane microparticles: two sides of the coin. Physiology. 2005, 20: 22-27.
18. Bhatnagar S., Shinagawa K., Castellino F., Schorey J. Exosome released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflamatory response in vitro and in vivo. Blood. 2007, 110: 3234.
19. Bykovskaya S., Gruntenko A., Raushenbach M., Bykovsky A. Ultrastructural alterations of cytolytic T-lymphocytes following their interaction with target cells. III. Plasmalemma. Membranosomes. Cell immunol. 1979, 41: 197-207.
20. Deatherage B., Cookson B. Membrane vesicles in bacteria, eukaryotes, and arhaea: a Conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infect. Immun. 2012, 80 (6): 1948-1957.
21. Dorward D.,Garon C. DNA is packaged within Membrane-derived vesicles of gram-negative but not grampositive bacteria. Eppl. Envir. Microbiol. 1990, 36 (6): 1960-1962.
22. Ermolaeva S., Rakovskaya I., Miller G., Sysolyatina E., Mukhachev A., Vasiliev M., Adgamov R., Levina G., Petrov O., Morfill G., Grigoriev A., Fortov V., Ginzburg A. Nobthermal plasma affects viability and morphology of Mycoplasma hominis and Acholeplasma laidlawii. J. Appl. Microbiol. 2014, 116: 1129-1136.
23. Fernandes-Chacon R., Konigstorfer A., Gerber S. et al. Synaptotagmin 1 functions as a calcium regulator of release probability. Nature. 2001, 410: 41-49.
24. Filds Virology. Knipe&Howley (eds.). Lippencot&Wilkinson, 2001.
25. Folk R. Bacteria and nannobacteria revealed in hardgrounds, calcite cements, native sulfur, sulfide minerals, and travertines. Proc. Geol. Soc. Amer. Ann. Meeting. 1992, 1: 104.
26. Folk R.L. SEM imaging of bacteria and nannobacteria in carbonate sediments and rocks. J. Sedimentary Petrology. 1993, 63: 990-999.
27. Fuchs T., Abed U.,Goosman C. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2007, 176 (2): 231-241.
28. Gurung M., Moon D., Choi C. Staphylococcus aureus produces membrane-derived vesicles that induce host cell death. PLoS One. 2011, 11 (6): 27958.
29. Hamilton A. Nanobacteria: gold mine or minefield of intellectual enquiry. Microbiol. Today. 2000, 27: 182185.
30. Kajander E., Ciftcioglu N. Nanobacteria: An alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation. PNAS USA. 1998, 95 (14): 8274-8279.
31. Kajander E., Kuronen J., Akerman K., Ciftcioglu N. Nanobacteria from blood, the smallest culturable autonomously replicating agent on earth. Proc. Soc. Photo Opt. Instrum. Engl. 1997, 3111: 420-428.
32. Kajander E., Kuronen J., Ciftcioglu N. Fatal (fetal) bovine serum — discovery of nanobacteria. Mol. Biol. Cell. 1996, 7: 3007-3007.
33. Koonin E.V., Dolja V.V. Evolution of complexity in the viral world: the dawn of a new vision. Virus Res. 2006, 117: 1-4.
34. Lee E.,Choi D., Kim D. Gram-positive bacteria produce membrane vesicle: proteomics-based characterization of Staphylococcus aureus-derived membrane vesicle. Proteomics. 2009, 9: 5425-5436.
35. Mashburn-Warren L., Whiteley M. Spetial delivery: vesicle trafficking in prokaryotes. Mol. Microbiol. 2006, 61 (4): 839-846.
36. Mathivanan S., Simpson R. Filds Virology. J. Proteomics. 2010, 73: 1907-1920.
37. Miller R., Purcell R. Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members oftwo plant virus supergroups (non-A,non-B hepatitis/potyvirus/carmovirus/picornavirus/ alphavirus). PNAS USA. 1990, 87: 2057-2061.
38. Montagnier L., Assa A., Ferris S. Reversible forms of Micoplasma in tissue cultural cells, contaminated M. orale II. Вестник новых медицинских технологий. 2009, XVI (1). Специальный выпуск (in Engl.): 54.
39. Muhlradt P. Molecular biology and pathogenisity og Mycoplasmas. N-Y, 2002.
40. Pap E. Cell fusion in health and diseases.the role of microvesicles in malignancies. Dittmar&Zanker, Springer, 2011.
41. Pap E., Pallinger E., Pasztoi M., Falus A. Highlights of a new type of intercellular communication: microvesi-cle —based information transfer. Inflam. Res. 2009, 58 (1): 1-8.
42. Picker L., Watkins D. HIV pathogenesis: the first cut is the deepest. Nature Immunol. 2005, 6: 430-432.
43. Schekmann R., Orci L. Coat proteins and vesicle budding. Science. 1996, 5255 (271): 1526-1533.
44. Schwartz M., Miller M. Biological nanoparticles in surgery and diagnostic. Surgery. 2010, 147 (2): 181-185.
45. Simpson R., Kalra H., Mathivanan S. ExoCarta as a resource for exosomal research. J. Extracellular Vesicles. 2012, 1 (incl. Suppl.): 18374.
46. Simpson R., Mathivanan S. Extracellular microvesicles: The need for internationally recognized nomenclature and stringent purification criteria. J. Proteomics Bioinform. 2012, 5 (2): ii-ii.
47. Tauro B., Greening D., Mathias R., Mathivanan S. Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation and immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cells LIMI863 — derived exosomes. J. Proteomics 2010, 73: 1922.
48. The Nobel Prize in Physiology and Medicine 2013. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laure-ates/2013/.
49. Zhdanov V.M., Tikchonenko T.I. Viruses as a factor of evolution: Exchange of genetic Information in the Biosphere. Adv. Virus Res. 1974, 19: 361-394.
Контактная информация: Миллер Г.Г.,
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)193-30-01
