CC BY
33
© ЦАРЕНОК С.Ю., РОСИН И.В., ГОРБУНОВ В.В. - 2006
ВЗАИМОСВЯЗЬ RH-1ß, ФНО-а, ИЛ-4 С ПОКАЗАТЕЛЯМИ ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ РЕВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ
СЕРДЦА
С.Ю. Царенок, И.В. Росин, В.В. Горбунов (Читинская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. А.В. Говорин)
Резюме. Представлены результаты исследования уровня интерлейкинов, активности тканевого фактора и некоторые показатели коагуляционного гемостаза у больных ревматической болезнью сердца. Отмечено повышение продукции провоспалительных цитокинов во всех группах больных. При ревматической болезни сердца происходит увеличение прокоагулянтной активности, при этом активность тканевого фактора прямопропорционально связана с концентрацией ИЛ-lß и обратно с уровнем ИЛ-4.
Ключевые слова. Цитокины, тканевой фактор, гемостаз._
Актуальность изучения гемостаза при хронической ревматической болезни сердца (ХРБС) не вызывает сомнений, так как ревматическая лихорадка представляется как процесс непрерывного отложения фибрина в системе микрососудов, а тромбозы и инфаркты органов являются неизменными спутниками тяжелых пороков сердца [4]. В последние десятилетия разрабатывается концепция иммунной регуляции физиологических функций, в частности, системы гемостаза [2,3,5]. Важными участниками сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свертывания крови и фибринолиза являются цитокины. Их эффекты опосредованы клетками, принимающими участие в продукции прокоагулянтов, антикоагулянтов и других факторов [5,10,12]. Цитокины — сигнальные молекулы, обеспечивающие специфический и неспецифический ответ макрофагов и лимфоцитов и тем самым оказывают опосредованное влияние на гемостаз [3]. Известно, что на различных этапах иммунного ответа продуцируются провоспалительные ци-токины, такие как интерлейкин (ИЛ)-1, фактор некроза опухоли (ФНО-а) [7,8]. Установлено, что эти молекулы являются важными триггерами гиперкоагуляции [2,3,5,12]. Появление провоспалительных цитокинов обуславливает продукцию тканевого фактора, фактора Виллебранда, активаторов плазминогена и др., стимулирующих реакции сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, активирующих проферментно-ферментный каскад свертывания крови и фибринолиза [10]. Тканевой фактор является главным физиологическим инициатором гемокоагуляции. Чрезмерная экспрессия тканевого фактора, в основном на поверхности моноцитов связана с большим риском развития тромбоза при различных заболеваниях: сепсисе, травмах, онкологических [10,11].
Известно, что в дебюте острой ревматической лихорадки происходят значительные нарушения клеточного иммунитета: повышение концентрации ИЛ-1, нео-птерина, растворимых рецепторов цитокинов [6,7,9]. Развитие ревматического вальвулита ассоциируется с увеличением ИЛ-1а, а при прогрессирующем поражении клапанов повышение ИЛ-ф, ИЛ-1 и ФНО. Эти цитокины оказывают стимулирующее действие на эдо-телиальные клетки, вызывая экспрессию молекул тканевого фактора, что приводит к запуску профермент-но-ферментного каскада свертывания с образованием тромбина, активацией тромбоцитов и отложением фибрина [10,11,12]. Повышенное тромбообразование может быть одним из существенных факторов развития
ревматического эндокардита, приводящего к формированию и прогрессированию пороков сердца [1]. Вместе с тем, сведений о взаимосвязи продукции цитокинов и тканевого фактора при ревматизме в литературе практически нет. В связи с этим целью нашей работы явилось установить патогенетическое значение изменений продукции цитокинов (ИЛ-1Р, ФНО-а и ИЛ-4), экспрессии молекул тканевого фактора моноцитами и показателей коагуляционного гемостаза у больных ревматической болезнью сердца.
Материалы и методы
Было обследовано 64 больных повторной ревматической лихорадкой (ПРЛ) и ХРБС (36 женщин и 28 мужчин), находившихся на лечении в ревматологическом отделении Дорожной клинической больницы ст. Чита-2 Забайкальской железной дороги. Из них ПРЛ была диагностирована у 35 больных, а ХРБС — у 29. Возраст пациентов составлял от 22 до 59 лет. Средний возраст женщин — 44,58+10,03, мужчин — 41,19+8,9. Основные клинические проявления ПРЛ включали: ревмокардит, артралгии. Ревмокардит расценивали как слабо выраженный у 20 больных и умеренный — у 15. Четверо больных отмечали повышение температуры тела. Доказательством перенесенной стрептококковой инфекции служил повышенный уровень антистреп-толизина-О (АСЛ-О) у 30 больных. У всех больных при проведении ЭхоКГ выявлены ревматические пороки сердца: у 28 — сочетанный митральный порок с преобладанием стеноза, у 6 — митральный порок с преобладанием недостаточности, у 4 — митральный порок без преобладания, у 3 — аортальный стеноз, у 2 — недостаточность аортального клапана и 21 больной имел комбинированные митрально-аортальные пороки. Недостаточность кровообращения 0 стадии установлена у 4 больных, 1 стадии, функциональный класс 1 (ФК) и ФК 2 - у 15; 2А стадии, ФК 2 и ФК 3 -у 33; 2Б стадии, ФК 3 и ФК 4 — у 12. Мерцание предсердий отмечено у 12 человек. У 3 больных имелись тромбоэмбо-лические осложнения в виде нарушения мозгового кровообращения и тромба левого предсердия. Больные к моменту обследования получали профилактику экстенциллином или бицилином-5, при 2А стадии недостаточности кровообращения и мерцании предсердий назначались препараты дигиталиса, мочегонные средства, ингибиторы АПФ в терапевтических дозах. Контрольную группу составили 16 практически здоровых человек.
Для оценки степени активности и подтверждения диагноза повторной ревматической лихорадки использовали критерии Киселя-Джонса (в модификации АРР, 2003), ЭхоКГ, клинический анализ крови, определение концентрации С-реактивного белка, фибриногена [9]. Для верификации стрептококковой инфекции исследовали уровень АСЛ-О.
Интерлейкины определяли методом ИФА с использованием наборов реагентов ООО «Протеиновый контур» Результаты оценивали на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 450 нм. Экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови исследовали в 4-х часовой культуре цельной крови с бактериальным липополи-сахаридом по методике R.A. 8аПисш е! а1. (2000) в модификации Ю.А. Витковского [11]. Для оценки состояния гемостаза использовали коагуляционные тесты - активи-
рованное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), международное нормализованное отношение (МНО), тромбиновое время.
Статистическую обработку проводили при помощи программы «BIOSTAT» и электронных таблиц EXCEL 2000 for Windows (Microsoft, USA). В некоторых случаях распределение признака было ассиметричным, поэтому нами применялись непараметрические методы статистики. При сравнении нескольких групп сначала проводились вычисления критерия Крускаля-Уолиса, а затем группы сравнивались попарно при помощи вычисления критерия Дана. Корреляционный анализ выполнен с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
Проведенные нами наблюдения показали, что у больных ХРБС концентрация ФНО-а в сыворотке крови была достоверно выше указанного показателя в группе здоровых лиц на 37% (p<0,05). Среди больных с ПРЛ мы выделили 2 группы. Первую составили больные с минимальными клинико-лабораторными проявлениями активности воспалительного процесса, ко второй группе были отнесены больные, имеющие более выраженные проявления воспаления. У больных ПРЛ 1 группы концентрация этого цитокина была выше на 20% по сравнению с группой ХРБС (p<0,05) и на 66% по сравнению с контролем (p<0,001). У больных ПРЛ 2 группы концентрация ФНО-a была выше на 83% по сравнению с контролем (p<0,001), но достоверно не отличалась от показателя у больных ПРЛ 1 группы, хотя и была несколько выше. Содержание другого провоспа-лительного цитокина — ИЛ-1 ß достоверно повышалось у больных ХРБС по сравнению с контрольной группой на 9% (p<0,05). У больных с ПРЛ 1 группы концентрация ИЛ-1 ß была выше на 17% по сравнению с больными ХРБС (p<0,05) и на 28% по сравнению с контролем (p<0,005). Во второй группе концентрация ИЛ-1 ß повышалась на 90% по сравнению со здоровыми (p<0,001),
на 73% по сравнению с больными ХРБС (р<0,001) и на 48% по сравнению с больными ПРЛ, 1 группы (р<0,001) (табл. 1). Уровень антивоспалительного цитокина — ИЛ-4 в группе больных ХРБС был достоверно ниже по сравнению с контролем (р<0,001). У больных ПРЛ 1 группы концентрация этого интерлейкина достоверно не
изменялась, хотя отмечалось некоторое увеличение данного показателя по сравнению с больными ХРБС. У больных ПРЛ 2 группы отмечено достоверное повышение концентрации ИЛ-4 по сравнению с больными ПРЛ с минимальной активностью (р<0,005). В ряде работ показано, что профиль синтеза цитокинов может существенно меняться в различных фазах заболевания. Например, при ревматоидном артрите в дебюте заболевания отмечается увеличение числа клеток, синтезирующих ИЛ-2 и ИФ-у, а в хронической стадии — клеток, синтезирующих ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-а [8]. Для изучения системы гемостаза нами применялся такой показатель как экспрессия тканевого фактора моноцитами периферической крови. Для этого рассчитывалась разница времени свертывания интактной и продигиозан-стимулированной крови. Как известно, чем меньше разница времени коагуляции, тем выше экспрессия тканевого фактора [11]. В нашем исследовании было выявлено, что у больных с ХРБС разница времени свертывания продигиозан-стимулированной и нестимули-рованной крови достоверно снижалась по сравнению со здоровыми лицами (р<0,001) (табл. 1). Это свидетельствует о том, что в крови больных ХРБС тканевой фактор уже изначально активирован. Тканевой фактор является главным физиологическим инициатором гемо-коагуляции. Активация проферментно-ферментного каскада с участием тканевого фактора приводит к образованию тромбина, активации тромбоцитов и отложению фибрина [11,12].
Одними из важных индукторов экспрессии тканевого фактора являются провоспалительные цитокины [2,3,5], концентрация которых повышалась у обследованных больных. У больных ПРЛ 1 группы разница времени свертывания продигиозан-стиму-лированной и интак-тной крови оставалась небольшой и достоверно не отличалась от группы больных ХРБС (табл. 1) Однако у пациентов ПРЛ 2 группы данный показатель достоверно отличался от 1 группы в сторону удлинения разницы времени свертывания стимулированной и нестимулированной крови (р<0,001), то есть изначальная активность тканевого фактора в периферической крови была ниже (табл. 1). Учитывая, что высокая активность молекул тканевого фактора приводит к внутрисосудистой гиперкоагуляции, мы исследовали общие коагуляционные тесты. Было выявлено, что в активную фазу у 55% больных имеют место изменения в виде уменьшения МНО в среднем до 0,79+0,22, укорочения тромбинового времени до 9,87+1,90 (р<0,05).
Таблица 1
Показатели цитокинов, экспрессии тканевого фактора и гемостаза у больных ревматической
болезнью сердца M±m
Показатель Здоровые n=16 Больные ХРБС n=29 Больные ПРЛ, 1 группа, n=20 Больные ПРЛ, 2 группа, n=15
Ln (Rn-1ß, пкг/мл) 3,42±0,49 3,74±0,23 p1-2<0,05 4,39±1,12 p2-3<0,05 6,5±0,61 p3-4<0,001
Ln(OHO-a, пкг/мл) 2,95±0,54 4,07±0,42 p1-2<0,001 4,92±0,06 p2-3<0,05 5,42±0,82 p2-4<0,005
Ln(RH-4, пкг/мл) 3,1±0,45 2,65±0,03 p1-2<0,05 2,88±0,59 p1-3<0,05 3,61±1,17 p3-4<0,005
ЭТФ, % 58,9±7 13,9±11,9 p1-2<0,001 14,8±6,8 29,7±6 p3-4<0,001
МНО 0,9±0,2 0,9±0,6 N=11 0,79±0,22 N=9 0,93±0,14 0,94±0,06
ТВ,с 16,4±0,25 15,8±3,06 N=11 9,87±1,9 p2-3<0,05 N=9 18,14±1,8 18,7±2,5
АЧТВ, с 39±0,09 36,2±0,92 40,5±2,8 41,9±4,8
Примечание'. р1-2 — по сравнению с контрольной группой, р2-3 — сравнение между 2 и 3 группой, р3-4 — сравнение между 3 и 4 группами, р1-3 — достоверность различий между контрольной группой и больными ПРЛ, 1группы, р1-4 — достоверность различий между здоровыми и больными ПРЛ, 2группы.
Для выявления возможных патогенетических взаимосвязей содержания провоспалительных цитокинов и показателей гемостаза больных ХРБС, нами проведен
Таблица 2
Коэффициенты корреляции между уровнем цитокинов, экспрессией тканевого фактора, показателями гемостаза у больных ХРБС и ПРЛ минимальной активности
Показатели МНО АЧТВ ТВ
ИЛ-1 в - - -
ИЛ-4 - 0,462 -
ФНО-а - 0,501 -
ЭТФ - 0,670
Показатели ИЛ-1 в ИЛ-4 ФНО-а
ЭТФ -0,628 0,805 -
тканевого фактора и удлинение АЧТВ и ТВ изменяло некоторые взаимосвязи. У пациентов этой группы отмечалась обратная связь содержания провоспалитель-ных цитокинов и прокоагулянтной активности. Дальнейшее повышение их концентрации сопровождалось
Таблица 4
Коэффициенты корреляции между уровнем цитокинов, показателями гемостаза, у больных ПРЛ с выраженной активностью
Примечание: в таблице приведены только статистически значимые коэффициенты корреляции при Р<0,05.
корреляционный анализ. Выявлено, что концентрация ИЛ-1Р обратно коррелировала с разницей времени коагуляции интактной и продигиозан-стимулированной крови, а содержание ИЛ-4 положительно связано с этим показателем (табл. 3). Уровни ФНО-а и ИЛ-4 положительно связаны с АЧТВ. Достоверная корреляция была установлена между экспрессией тканевого фактора и
Таблица 3
Коэффициенты корреляции между уровнем цитокинов, экспрессией тканевого фактора
Показатели ЭТФ МНО АЧТВ ТВ
ИЛ-1 в 0,686 - -
ИЛ-4 0,882 0,842 0.89 0,685
ФНО-а - 0.50 -
Примечание: в таблице приведены только статистически значимые коэффициенты корреляции при Р<0,05.
тромбиновым временем (г=0,67, р=0,002) (табл. 2). Учитывая отличия в показателях цитокинов, гемостаза у больных с выраженной активностью, были рассчитаны коэффициенты корреляции для этой группы. Увеличение концентрации ИЛ-4, снижение активности
Примечание: в таблице приведены только статистически значимые коэффициенты корреляции при Р<0,05.
удлинением АЧТВ и ТВ и снижением активности молекул тканевого фактора (табл. 4). Очевидно, изменения в процессах коагуляции связано с увеличением содержания в крови у этих больных ИЛ-4, который является ингибитором тканевого фактора и тем самым оказывает антикоагулянтный эффект. Нами установлены прямолинейные связи между содержанием противовоспалительного цитокина и АЧТВ, ТВ и МНО и обратная с активностью тканевого фактора.
Таким образом, изменения в цитокиновом статусе у обследованных больных оказывают влияние на систему гемостаза, приводя к гиперкоагуляции в связи с активацией тканевого фактора, индуктором которого служит ИЛ-1 (в группе больных ХРБС и ПРЛ минимальной активности). Напротив, у больных ПРЛ с выраженной активностью при увеличении концентрации ИЛ-4 активность тканевого фактора снижается, и удлиняются изученные показатели коагуляционного гемостаза.
RELATION BETWEEN THE LEVELS OF IL-1p, TNF-a, IL-4 AND BLOOD COAGULATION IN PATIENTS WITH RHEUMATIC HEART DISEASE
S.U. Tsarenok, I.V. Posin, V.V. Gorbunov (Chita State Medical Academy)
The paper presents data on comparative investigation of interleukins, tissue factor and blood coagulation in patients with rheumatic heart disease. Patients with rheumatic heart disease showed significantly higher levels of IL-1b, TNF-a. The procoagulation activity was increased in these patients. Correlation between the level of IL-1b and parameters of blood coagulation were determined. Activity of tissue factor was increased in these patients whole blood that resulted in hyper coagulation. This state requires medical correction.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бобков В.А., Мясоедова С.Е., Лебедева А.В. Антитела к кардиолипину и показатели гемостаза у больных ревматизмом при формировании ревматических пороков сердца // Тер. Архив. - 1997. - № 12. - С.12-15.
2. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Еделев Д.А., Солпов А.В. Блокировка интерлейкинов 4 и 10 изменяет гемоста-тические свойства лейкоцитов // Иммунология. — 1999. - № 5. - С.20-23.
3. Витковский Ю.А. Роль цитокинов в регуляции системы гемостаза: Автореферат дис. ... д-ра мед. наук. -Чита, 1997. - 30 с.
4. Заславская Р.М., Логвиненко С.И., Тейблюм М.М. и др. Временная организация гемокоагуляции и ее коррекция у больных ревматическими пороками сердца с недостаточностью кровообращения // Клиническая медицина. - 1996. - № 8. - С.25-28.
5. Кузник Б.И. Физиология и патология системы крови, издание 4-е. - Чита, 2004. - 336 с.
6. Насонов Е.Л. Избранные лекции по клинической ревматологии. - М., 2000. - С.29-45.
7. Насонов Е.Л., Самсонов М.Ю., Тилз Г. и др. Активация клеточного иммунитета при острой ревматической лихорадке // Вестник РАМН. - 1996. - № 11. - С.41-44.
8. Насонов Е.Л. Современные направления иммунологических исследований при хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека // Тер. архив. - 2001. - № 8. - С.43-46.
9. Насонов Е.Л. Ревматология. Клинические рекомендации. - М.: «ГЭОТАР - Медиа», 2006. - 264с.
10. Paleolog E.M. Crosman D.C., Mc Vey J.H. Differential regulation by cytokines of constitutive and stimulated secretion of von Willebrand factor from endothelial cells // Blood. - 1990. - Vol. 75, № 3. - P.688-695.
11. Richard A. Santucci, Jonathan Erlich, Joanne Ladriola. Measurement of Tissue Factor Activity in Whole Blood // Thrombosis and Haemostasis. - 2000. - № 83. - С.45-54.
12. Qsterud B. Tissue factor in neutrophils: no // Throm Hae-most. - 2004. - Vol. 2, № 2. - P.218-220.
