CC BY
97
УДК 577.214.3
Взаимодействие РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С с РНК-матрицами
К. А. Кондукторов, Г. С. Людва, А. В. Иванов, В. Л. Туницкая, С. Н. Кочетков# Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, # e-mail: kochet@eimb.ru
Гепатит С является одним из наиболее опасных и широко распространенных вирусных заболеваний. В настоящее время, по оценкам ВОЗ, вирусом гепатита С (ВГС) - этиологическим агентом инфекции, поражено около 170 млн человек практически во всех странах мира. Ключевым ферментом, осуществляющим репликацию генома ВГС, является РНК-зависимая РНК-полимераза (Р-РНКП, неструктурный вирусный белок NS5B). Р-РНКП имеет молекулярную массу ~67 кДа и локализуется на мембране эндоплазматического ретикулума пораженной клетки печени посредством C-концевого а-спирального трансмембранного домена (21 а.о.). Одним из характерных свойств Р-РНКП является ее способность катализировать синтез РНК как по праймер-зависимому, так и по праймер-независимому (de novo) механизмам [1]. В первом случае в опытах in vitro в качестве РНК-матрицы, как правило, используется праймер-матричный дуплекс поли(гА)-олиго(ги), а во втором - фрагменты генома ВГС. Предполагается, что в репликации принимает участие олигомер из нескольких одинаковых молекул Р-РНКП, причем установлено, что в его образовании участвуют аминокислотные остатки H502 и Е18, расположенные в области взаимодействия белковых глобул [2].
Ранее нами был получен штамм E. coli - продуцент Р-РНКП ВГС, позволяющий получить высокоочищенный рекомбинантный белок с выходом до 6 мг/л культуры, и разработана процедура очистки фермента до состояния, близкого к гомогенному (по данным электрофореза в полиакриламидном геле) [3]. Процедура очистки включала приемы, сходные с описанными в литературе [4]; определенные ки-
нетические параметры праимер-зависимои реакции для полученного препарата полимеразы также соответствовали литературным данным [5]. Однако при переходе к праймер-независимой репликации гетерогенных РНК (например, к матрице (-)IRES, представляющей собой З’-нетранслиру-емый регион (-)цепи вирусного генома ВГС) было отмечено аномально высокое включение радиоактивной метки. Фермент также оказался неспособен к одношаговой элонгации олигонуклеотидов в праймер-зависимой системе, что ограничивало его возможности в исследованиях специфических ингибиторов. Эти факты указывали на возможные примеси клеточных РНК в препарате белка, образующих прочный комплекс с молекулой фермента и способных служить «эндогенной» матрицей. Вследствие этого представилось необходимым как модифицировать метод очистки фермента, так и более тщательно подойти к определению параметров его взаимодействия с матрицами разных типов.
Р-РНКП ВГС экспрессировали в клетках Escherichia coli, используя плазмиду рЕТ21-2с-5ВА55, как описано ранее [3]. Исходно выделение белка, содержащего на С-конце поли-пептидной цепи шесть остатков гистидина, проводили разрушением клеток ультразвуком и хроматографией лизата, осветленного центрифугированием, на колонке с Ni-NTA-агарозой в градиенте концентраций имидазола. Активность фермента определяли на основании измерения включения радиоактивно-меченного [y32P]-UTP в высокомолекулярные продукты при использовании поли(гА)-олиго(ги) праймер-матричного комплекса или (-)IRES матрицы. Полученный препарат Р-РНКП ВГС обладал высокой полимеразной активностью в праймер-зависимой системе ее определения.
При этом, при репликации РНК de novo наблюдалось высокое включение радиоактивной метки, как в присутствии, так и в отсутствие матрицы.
Модификация стандартного метода выделения заключалась в лизисе бактериальных клеток лизоцимом (1 мг/мл, Sigma, США) с последующим криолизом (2-3 цикла замораживания/оттаивания) в жидком азоте, после чего к лизату добавляли NH4Cl до концентрации 1 М. После полного растворения хлорида аммония добавляли 10 % раствор по-лиэтиленимина (Serva, ФРГ) до конечной концентрации 1 %, раствор перемешивали 30-40 мин при 4 °С, центрифугировали при 3-5000 об/мин в течение 3 мин и отбирали супернатант. К супернатанту добавляли сульфат аммония до 80 % насыщения и инкубировали при 4 °С в течение ночи. Белки осаждали центрифугированием при 10 000 об/мин при 4 °С в течение 20 мин, осадок растворяли в минимальном объеме буфера, содержащем 20 mM Трис-HCl pH 7.5, 350 mM NaCl, 5 % глицерина, 1 mM Р-меркаптоэтанола, 1 mM фенилметилсулфонилфторида (PMSF), 1 мкл/мл смеси ингибиторов протеаз (Sigma, США). Проводили диализ в два этапа (по 1 ч каждый) против 500 мл того же буфера. Диализат дважды наносили на колонку с Ni-NTA агарозой, уравновешенной тем же буфером. Отмывку колонки проводили 50 mM имидазолом. Белок элюировали 200 mM имидазолом и собирали по фракциям. Элюат диа-лизовали в два этапа против 200 и 100 мл буфера (первый буфер содержал Трис-HCl 20 mM pH 7.5, NaCl 350 mM, 10 % глицерина, 0.5 mM ЭДТА, 10 mM Р-меркаптоэтанола; состав второго буфера тот же, кроме 50 % глицерина) соответственно. Концентрацию белка измеряли по методу Бредфорд [6].
Общую и удельную активности фермента определяли по методу, описанному нами ранее [3].
Фосфорилирование РНК и препаратов Р-РНКП проводили при помощи Т4-полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва) и [y32P]-ATP согласно инструкции производителя. Фосфорилированную РНК очищали на микроколонках Micro-spin G-50 (GE Healthcare, США).
Кинетические параметры взаимодействия фермента с РНК определяли при помощи дот-блот гибридизации. Использовали 48-луночный доттер с применением нитро-целлюлозной и нейлоновой мембран (Bio-Rad, США). Ни-троцеллюлозную мембрану помещали поверх нейлоновой
в доттере. Мембраны предварительно смачивали в буфере, содержащем 50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 5 mM MgCl2, 10 mM Р-меркаптоэтанола. Фермент разводили с шагом в два раза от верхнего значения концентрации при 500 mM NaCl. Связывание РНК проводили при 4 °С в течение 30 мин в буфере для смачивания мембран, после чего наносили на мембраны. Концентрацию РНК определили опытным путем и довели до 2 nM. Высушенные мембраны экспонировались течение 40-60 мин и визуализировались при помощи Storage Phosphor Screen и Phosphor Imager (Packard, США). Математическую обработку результатов проводили с применением программ Total Lab и Origin 7.0.
Необходимость внесения изменений в методику очистки Р-РНКП была связана с возможным наличием в очищенном препарате рекомбинантного фермента коротких примесных РНК, возможно, относящихся к бактериальным рибо-сомальным или транспортным РНК. Эти примесные РНК могли бы конкурентно блокировать центры связывания нуклеиновых кислот в молекуле фермента и, таким образом, препятствовать взаимодействию in vitro с РНК-матрицами, добавляемыми в реакцию. Как известно, при обработке бактериальных клеток ультразвуком происходит механическое разрушение клеточных нуклеиновых кислот, которые дробятся на мелкие фрагменты различной длины. В данном случае часть из них, по-видимому, связывалась с рекомбинантной Р-РНКП, причем этот процесс протекал с высокой аффинностью, что препятствовало их отделению на дальнейших этапах очистки. Действительно, в результате обработки препаратов фермента [y32P]-ATP в присутствии полинуклеотидкиназы, осуществляющей, как известно, специфичное фосфорилирование свободного 5’-конца полинуклеотида, было выявлено наличие как минимум трех дискретных низкомолекулярных РНК, длины которых лежали в диапазоне от 12 до 60 нуклеотидов (рис. 1а и б). Кроме того, было показано образование комплекса белок-РНК в экспериментах по ковалентному сшиванию компонентов комплекса формальдегидом (рис. 1в). Попытки избавиться от данных примесей с использованием различных приемов, в частности, обработки высокими концентрациями NaCl (до 1.5 М) и дополнительной хроматографии на гепарин-агарозе, успеха не имели (данные не представлены).
В результате предложенный ранее метод выделения Р-РНКП был модифицирован таким образом, чтобы препа-
Рис. 1. Низкомолекулярные РНК в препаратах Р-РНКП, выделенных стандартным методом, выявленные фосфорилирова-нием препаратов [732 Р]-АТР (дорожка 1 — дикий тип, 2 — двойной мутант) (а); значительно меньшее количество примесных РНК в препарате Р-РНКП дикого типа, выделенного модифицированным методом, выявлено фосфорилировани-ем препаратов [732 Р]-АТР (дорожка 1 — дикий тип старого выделения, 2 — дикий тип модифицированного выделения, 3 — двойной мутант старого выделения, К — отрицательный контроль без сшивки) (б); образование комплекса Р-РНКП старого выделения с примесной РНК, сшивки 1 % формальдегидом (дорожка 1 — дикий тип, 2 — мутант с одиночной заменой,
3 — двойной мутант) (б);. а, б — радиоавтография, в — окраска серебром
рат активного фермента не содержал примесных РНК. Модификация заключалась в замене способа разрушения бактериальных клеток, тогда как последующие этапы очистки остались прежними. При использовании данного метода исключалась обработка клеток ультразвуком, приводящая к образованию коротких НК, а высокая концентрация соли приводила к диссоциации белково-нуклеиновых комплексов и препятствовала соосаждению целевого белка с нуклеиновыми кислотами. Такой подход ранее был с успехом применен нами при очистке рекомбинантной Т7 РНК-полимеразы [7].
Поскольку вопрос об олигомеризации фермента при связывании РНК по-прежнему остается открытым, в эксперименте наряду с ферментом дикого типа мы использовали полученный нами двойной мутант ^М) Р-РНКП (H502L, Е18А), который по литературным данным не способен к олигомеризации [2], а также две мутантные формы Р-РНКП с единичными точечными заменами близ активного центра (И222А и С223А), которые, предположительно, могли влиять на связывание фермента с РНК. Препараты Р-РНКП дикого типа, выделенные новым методом, отличались высокими значениями удельной активности (9.2 нмоль/мин • 1 мкг фермента). Согласно литературным данным [2], двойная аминокислотная замена (H502L, Е18А) в Р-РНКП ВГС приводит к неактивности двойного мутанта. Однако наши данные показали, что удельная активность двойного мутанта несколько выше, чем у фермента дикого типа (20.4 нмоль/ мин • 1 мкг фермента).
Следует отметить, однако, что использование нового метода приводило к уменьшению выхода целевого белка. Если при выделении стандартным методом выход Р-РНКП составлял 3-5 мг/л клеточной культуры, то при выделении новым методом выход не превышал 1 мг/л. Кроме того, как выяснилось, препараты Р-РНКП, не содержащие примесных полинуклеотидов, имеют гораздо меньшую стабильность. В отличие от стандартных препаратов, стабильных при температуре хранения -20 °С в течение одного года, новые препараты сохраняли свою активность максимум один месяц при температуре -85 °С (данные не представлены). Это явление объясняется возможным участием примесных полинуклеотидов в стабилизации фермента от инактивации.
Свободные от примесных полинуклеотидов препараты Р-РНКП обладали существенно более высоким сродством
А Б
Рис. 2. Определение параметров связывания Р-РНКП с РНК. (А) дот-гибридизация на нитроцеллюлозной и нейлоновой мембранах; (Б) зависимость связывания РНК от концентрации фермента. Обозначения: WT — дикий тип, DM — двойной мутант
in vitro к РНК различной структуры. В экспериментах были использованы РНК трех типов - короткие (rA20) и длинные (поли-rA) гомополимеры, а также протяженная гетерополимерная РНК ВГС (-IRES). Рис. 2 и табл. 1 демонстрируют полученные результаты.
Параметры взаимодействия Р-РНКП с РНК обсчитывались в соответствии с уравнением Хилла [8], поскольку предполагается, что связывание протяженных РНК происходит кооперативно [9]. Как следует из табл. 1, константы диссоциации для Р-РНКП WT и DM в случае (rA20) существенно различаются, т.е. олигомеризация Р-РНКП препятствует связыванию коротких РНК. В то же время при связывании протяженной гомополи-мерной матрицы оба фермента (WT и DM) ведут себя одинаково, и взаимодействие не кооперативно. На основании этих данных можно предположить, что, во-первых, сайт связывания матрицы не превышает 20 нуклеотидов и, во-вторых, при связывании протяженного полинуклеотида белком дикого типа структура олигомера меняется. В случае мутантов с одиночными заменами такой картины не наблюдалось, и оба белка показали сходные результаты.
Таким образом, нами был модифицирован метод получения Р-РНКП ВГС, позволивший получить рекомбинантный белок, свободный от примесных клеточных полинуклеотидов. Полученный препарат Р-РНКП обладал большим сродством к различным РНК, что позволило уточнить параметры этого взаимодействия.
Список литературы
1. Bressanelli S., Tomei L., Roussel A., Incitti I., Vitale R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 13034-13039
2. Qin W., Luo H., Nomura T., Hayashi N., Yamashita T., Murakami S. // J Biol Chem. 2002. V. 277. № 3. Р. 2132-2137.
3. Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O.,
Kukhanova M.K., Kochetkov S.N. // Prot. Expr Purif. 2006. V. 48. № 1. Р. 14-23.
4. Hengen P. // Trends Biochem Sci. 1995. Jul;20(7):285-6.
5. Zhong, W., Ferrari, E., Lesburg, C.A., Maag, D., Ghosh, S.K., Cameron,C.E., Lau, J.Y., Hong Z. // J.Virol., 2000. V. 74. P. 9134-9143.
6. Bradford M.M. // 1976 May 7;72:248-54.
7. Tunitskaya V.L., Akbarov A.Kh., Luchin S.V., Memelova L.V., Rechinsky V.O., Kochetkov S.N. // Eur J Biochem. 1990. V. 191. № 1. Р. 99-103.
8. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика М., «Гранд», 1998. 720 с.
9. Wang Q.M., Hockman M.A., Staschke K., Johnson R.B., Case K.A., Lu J., Parsons S., Zhang F., Rathnachalam R., Kirkegaard K., Colacino J.M. //J Virol. 2002 Apr;76(8):3865-72.
Табл. 1. Параметры связывания РНК ферментом, выделенным двумя способами. Обозначения: WT — дикий тип, DM — двойной мутант, п — коэффициент Хилла, Кд — константа диссоциации комплекса
Тип РНК Параметры Стандартный метод Модифицированный метод
WT DM WT DM
rA20 Кд (нМ) 57,86 ± 1,82 - 17,34 ± 6,62 2,73 ± 0,31
n 0,59 ± 0,14 - 1,08 ± 0,21 1,38 ± 0,19
поли-rA Кд (нМ) - - 0,81 ± 0,12 1,03 ± 0,13
n - - 0,97 ± 0,21 0,83 ± 0,12
(-)IRES Кд (НМ) >3000 >3000 7,80 ± 1,21 14,69 ± 2,94
n - - 1,24 ± 0,16 1,20 ± 0,18
