CC BY
74
14. Modlin I.M., Gustafsson B.I., Moss s.F., pavel M., Tsolakis A.V., Kidd M. chromogranin a - biological function and clinical utility in neuroendocrine tumor disease. Ann. surg. oncol. 2010; 17(9): 2427—43.
15. singh s., Law c. chromogranin A: a sensitive biomarker for the detection and post-treatment monitoring of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Expert Rev. gastroenterol. Hepatol. 2012; 6(3): 313—34.
biochemistry
16. Vinik A.I., silva M.p., Woltering E.A., Go Vi., Warner R., caplin M. Biochemical testing for neuroendocrine tumors. pancreas. 2009; 38(8): 876—89.
17. Nikou G.c., marinou K., Thomakos p., papageorgiou D., sanzanidis V., Nikolaou p. et al. chromogranin a levels in diagnosis, treatment and follow-up of 42 patients with non-functioning pancreatic endocrine tumours. pancreatology. 2008; 8(4-5): 510—9.
received 29.03.16
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2016 УДК 616-092.612.017.1]-074
Алчинова И.Б.1, Яковенко Е.Н.1, Санадзе АХ.2, Карганов М.Ю.1
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА И СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
1ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии », 125315, Москва; 2Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница №51 Департамента здравоохранения города Москвы», 121309, Москва, Российская Федерация
Работа посвящена исследованию взаимодействия наночастиц оксида титана и сыворотки крови людей с верифицированными диагнозами «миастения» и «аллергия». Исследование раствора нанопорошка оксида титана методом лазерной корреляционной спектрометрии (ЛКС) показало, что основной вклад в светорассеяние вносят частицы, имеющие радиус 4,64—8,42 нм. Данные о размерах частиц, полученные с помощью ЛКС, согласуются с данными анализа этих частиц различными физическими методами. Наночастицы оксида титана, стабилизированные фосфорной кислотой, при взаимодействии с сывороткой крови вызывают образование и осаждение комплексов с альбуминами и глобулинами. Взаимодействие наночастиц двуокиси титана с сывороткой крови пациентов с миастенией приводит к удалению из нее значительной (40%) доли циркулирующих иммунных комплексов. В сыворотке крови пациентов с бронхиальной астмой наночастицы двуокиси титана связывают преимущественно белки небольшого размера.
Ключевые слова: лазерная корреляционная спектрометрия; диоксид титана; нанотехнологии; аутоиммунные комплексы.
Для цитирования: Алчинова И.Б., Яковенко Е.Н., Санадзе А.Г., Карганов М.Ю. Взаимодействие наночастиц диоксида титана и сыворотки крови больных аутоиммунными заболеваниями. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61(7): 401-404. DOI: 10.18821/0869-2084-2016-7-401-404 AlchinovaI.B.1, YakovenkoE.N.1, SanadzeA.G.2, KarganovM.Yu.1
the interaction of nano-particles of titanium dioxide and blood serum in patients with autoimmune diseases
1The research institute of general pathology and pathophysiology, 125315 Moscow, Russia; 2The municipal clinical hospital №51 of the Moscow health department. 121309 Moscow, Russia
The article considers interaction of nano-particles of titan oxide and blood.serum ofpatients with verified diagnoses of "myasthenia" and "allergy". The analysis ofsolution ofnano-powder of titan oxide using technique of laser correlated spectrometry demonstrated that main input into light scattering is made by particles with radius of4.64-8.42 nm. The data concerning dimensions of particles received with laser correlated spectrometry matches data of analysis of these particles with various physical techniques. The nano-particles of titan oxide stabilized with phosphoric acid at interaction with blood serum cause development and sedimentation of complexes with albumins and globulins. The interaction of nano-particles of titan oxide with blood serum of patients with myasthenia results in elimination from it the significant percentage (40%) of circulating immune complexes. In blood serum of patients with bronchial asthma, nano-particles of titan oxide bind proteins of small size mainly.
Keywords: laser correlated spectrometry; titan dioxide; nano-technology; autoimmune complex
For citation: Alchinova I.B., Yakovenko E.N., Sanadze A.G., Karganov M.Yu. The interaction of nano-particles of titanium dioxide and blood serum in patients with autoimmune diseases. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (7): 401-404 (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-7-401-404
For correspondence: Alchinoval.B., candidate of biological sciences; leading research worker . e-mail: alchinovairina@ yandex.ru
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support
Received 02.04.2016 Accepted 15.04.2016
Для корреспонденции: Алчинова Ирина Борисовна, канд. биол.наук, вед. науч.сотр. ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», е-mail: [email protected]
биохимия
Введение. Современный уровень научно-технического прогресса предполагает появление материалов с новыми свойствами и новых областей применения для уже известных технологий. В настоящее время существует возможность создавать и применять материалы с размерами частиц 10-9 м [1]. И если области и способы использования таких материалов в металлургии, автомобилестроении и т.п. давно известны и подробно описаны, в медицине они пока что являются новшеством.
Нанопорошки, состоящие из частиц размером < 100 нм, благодаря своим мелким размерам обладают повышенной биологической активностью и высокой возможностью проникновения в организм. Проникнув в клетку, наночастицы способны взаимодействовать со структурными компонентами клетки, вызывая их повреждения. Наночастицы, попавшие в организм, могут выступать в роли катализаторов образования токсичных веществ. Доказано токсическое действие
14,00-,
т*
12,00-
10,008,006,004,002,000,00
i
о
а>
СМ С}
л
t*-
оо
И
I!
Ш
т
ЕШ Стандартная сыворотка
I Астма ср.
Рис. 1. ЛК-гистограммы стандартной сыворотки и сывороток крови людей с верифицированными диагнозами.
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — ленного размера в светорассеяние, стандартной сыворотки и астмы,
- размер частиц в нм, по оси ординат — процентный вклад частиц опреде-. * — сравнение стандартной сыворотки и миастении, ^ — сравнение ! — сравнение миастении и астмы, критерий Манна—Уитни, р < 0,05.
20,00 -,
15,00-
10,00-
5,00-
0,00
м
т
Ш
ш
Ollil^lON^nNlIlSnnSNOllilO^fflON®'-.
" 1П о" h-" I-." о" Г-" Т-" см" НО со" о" -Ч"" ю" TJ-" со" СМ т-счсчсоюсоосчсосмоо-чгсососо T-I-Mn^insain
C\l СО Tt <D СО
j Стандартная сыворотка
1 Стандартная сыворотка-нч
Рис. 2. ЛК-гистограммы стандартной сыворотки крови: до и после взаи модействия с наночастицами оксида титана.
нанопорошков на организмы лабораторных животных, их цитотоксическое действие на опухолевые и бактериальные клетки. В то же время антибактериальный эффект нанопорошков стимулирует ускоренное (в 1,5 раза) заживление ран и ожогов [2].
Одной из проблем, препятствующих широкому распространению наночастиц в качестве терапевтического средства, является их низкий уровень накопления в ткани-мишени, обычно не превышающий 10% [3, 4] при системном введении. Повышение дозы вводимых частиц чревато токсическими эффектами в здоровых тканях. Взаимодействие наночастиц с компонентами крови изменяет их физические свойства и влияет на биораспределение [5]. С другой стороны, наночастицы могут избирательно связывать отдельные вещества, содержащиеся в избыточных количествах. Эти обстоятельства обусловливают актуальность изучения вопроса взаимодействия наночастиц с компонентами сыворотки крови.
Титан и оксид титана рассматриваются как биологически совместимые материалы. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия сыворотки крови с наночастицами оксида титана. Для этого было необходимо подобрать оптимальные условия, подтвердить факт взаимодействия и определить направление происходящих процессов.
Материал и методы. В работе была использована стандартная сыворотка, приготовленная из крови условно здоровых людей, а также сыворотки людей с верифицированными диагнозами «миастения» (10 пациентов) и «бронхиальная астма» (20 пациентов). Эти заболевания относятся к аутоиммунным, что предполагает повышенное содержание аутоантител.
Наночастицы оксида титана были предоставлены компанией Plasmachem GmbH (Германия). Они имеют диаметр 20 нм, стабилизированы фосфорной кислотой и представляют собой порошок белого цвета. Свойства этих наночастиц при взаимодействии с биологическими жидкостями не изучены. При смешивании наночастиц с физиологическим раствором образуется прозрачная взвесь. Данные наночастицы являются новым объектом для изучения применительно к биологическим объектам, поэтому их рабочая концентрация была определена эмпирическим путем и составила 7,8 мг/мл.
Для выявления процессов, происходящих при взаимодействии наночастиц и сыворотки, использовали метод ЛКС. В его основе лежит изменение спектральных характеристик монохроматического когерентного излучения гелий-неонового лазера в результате светорассеяния при прохождении через дисперсную систему (плазма, сыворотка крови, моча, ротоглоточные смывы) [6, 7]. Результатом обработки является гистограмма, по оси ординат которой отложен процентный вклад частиц в светорассеяние, а по оси абсцисс — их размер в нанометрах [8, 9]. Общее содержание белка определяли
со тО Tt
со" о"
СМ о
см со
со т- iri о
со см" ч
со со а>
от со
Миастения ср.
i-lL
й_
biochemistry
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
m,
a
Ю ■St
со
00 см irt
со см
CN CM
т- Ю CD
■Ч- CO О
о" Tf in
О О
CO Tf
S
CM со CO
Астма ср.
I Астма-нч
Рис. 3. ЛК-гастограммы сыворотки крови пациентов с астмой: до и после взаимодействия с наночастицами оксида титана. Приведены значимые различия, критерий Манна—Уитни, р < 0,05.
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
й
il
о о>
со ю ю
ю см
CM Tf
со" со"
со ■>- ю
О t (О
со" о" Tt
см о о
см со ч*
Миастения ср.
Миастения-нч
Рис. 4. ЛК-гистограммы сыворотки крови пациентов с миастенией: до и после взаимодействия с наночастицами оксида титана. Приведены значимые различия, критерий Манна—Уитни, р < 0,05.
по Бредфорд [10]. Лиофильную сушку продуктов взаимодействия сыворотки крови и наночастиц оксида титана осуществляли на аппарате Alpha 1-5 («Martin Ehrist», Германия).
Результаты и обсуждение. Исследование раствора нано-порошка оксида титана методом ЛКС показало, что основной вклад в светорассеяние вносят частицы с радиусом 4,64— 8,42 нм, что соответствует данным, заявленным в описании частиц (радиус 10 нм). Кроме того, видно, что небольшой вклад в светорассеяние вносят частицы размером 37—50 и 300—545 нм, которые, вероятно, возникают в результате слипания. Данные о размерах частиц, полученные с помощью ЛКС, согласуются с данными анализа этих частиц различными физическими методами.
Соотношение частиц в сыворотке крови людей с верифицированными диагнозами отличается от ЛК-гистограммы стандартной сыворотки: можно отметить преобладание частиц в зоне от 20 до 67 нм у больных людей и в зоне 123 и 300 нм — в стандартной сыворотке (рис. 1). При сравнении ЛК-гистограмм сыворотки крови пациентов с астмой наблю-
дается увеличение вклада в светорассеяние частиц размером от 4 до 15 нм, у пациентов с миастенией — 404—1794 нм. Вероятно, это связано с выраженным воспалительным процессом, который сопровождает течение бронхиальной астмы, а именно — с эффектами комплекса цитокинов и других маркеров инфекционно-аллергического процесса.
Добавление к сыворотке наночастиц сопровождалось выпадением белого осадка. По нашим предположениям, наночастицы неспецифически связывались с белками. С одной стороны, это привело к удалению мелких белков, а с другой в сыворотке сохранялись комплексы, которые не удалось полностью осадить центрифугированием.
ЛКС-исследование показало, что из проб удаляются именно частицы, по размеру соответствующие основным белкам сыворотки, при этом происходит перераспределение в сторону более крупных частиц, которые представлены гликолипидами, гли-копротеидами и комплексами «антиген-антитело».
Приведенные на рис. 2—4 ЛК-гистограммы отражают сходство этих процессов.
При исследовании сыворотки пациентов как с астмой, так и (даже в большей степени) с миастенией наблюдается уменьшение вклада частиц размером свыше 223 нм, которые служат показателем аутоиммунизации.
Для доказательства того, что из сыворотки крови удаляются белки, использовали метод определения содержания белка по Бредфорд [10]. Показано, что после взаимодействия наночастиц и сыворотки крови удаляется до 40% белка в случае, если это сыворотка крови пациентов, и до 70% — если это стандартная сыворотка. Вероятно, это связано не столько с количеством белка, сколько с его доступностью. Для приготовления стандартной сыворотки используется кровь здоровых людей, при этом соблюдается точное соотношение основных компонентов. Для крови людей с аутоиммунными заболеваниями характерно наличие крупных комплексов, и доступ к разным белкам может быть затруднен вследствие их связи с другими веществами или изменения конформационной структуры.
В результате лиофильной сушки были получены осадки, образующиеся в результате взаимодействия компонентов сыворотки крови с наночасти-цами, при этом масса осадка позволяет говорить о том, что осадок состоит не только из наночастиц, а представляет собой комплексы наночастиц с белками сыворотки.
Таким образом, наночастицы оксида титана, стабилизированные фосфорной кислотой, при взаимодействии с сывороткой крови вызывают образование и осаждение комплексов с альбуминами и глобулинами. Взаимодействие на-ночастиц двуокиси титана с сывороткой крови пациентов с миастенией приводит к удалению из нее значительной доли (40%) циркулирующих иммунных комплексов. В сыворотке крови пациентов с бронхиальной астмой наночастицы двуокиси титана связывают преимущественно белки небольшого размера. В результате взаимодействия сывороточных белков с наночастицами на последних образуется так называемая «белковая корона» [11].
Есть все основания полагать, что интерес к наноразмер-ным частицам будет сохраняться еще долгое время — в связи с тем, что они занимают промежуточное положение между атомно-молекулярным и конденсированным состояниями вещества. Фундаментальными задачами остаются установ-
f^Li/x-
со ■>-
OÎ
со" см"
S 23
о> со
биохимия
ление их электронной структуры, характера взаимодействия со средой, изучение состояния поверхности и ее влияния на устойчивость наночастицы, способности оказывать каталитическое действие на протекание разнообразных химических реакций.
Следует отметить, что в настоящее время определение размеров наноструктур довольно проблематично. Большинство методов контроля размеров либо не позволяют проводить измерения в диапазоне наноструктур, либо чрезвычайно трудоемки. Однако применение методов динамического светорассеяния и решение обратной задачи методом регуляризации позволяет получить распределение частиц по размерам из спектра флуктуаций рассеянного на этих частицах света. Диапазон предлагаемой методики лежит в границах от единиц нанометров до десятков и даже сотен микрометров (5—6 порядков), что не достижимо никаким другим методом [12, 13]. Полученные в настоящем исследовании результаты позволяют утверждать, что метод лазерной корреляционной спектроскопии представляет собой адекватный и удобный инструмент для изучения взаимодействия нанообъектов с компонентами биологических жидкостей.
В практическом аспекте обнаруженное связывание нано-частиц с крупными иммунными комплексами, характерными для тяжелых форм миастении [14], представляет несомненный интерес. В настоящее время для удаления циркулирующих иммунных комплексов из кровотока при миастении применяют процедуру плазмафереза. Обнаруженное нами взаимодействие наночастиц с компонентами сыворотки открывает новые перспективы для разработки нанотехнологий терапии этого инвалидизирующего заболевания.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—5, 9—11 см. REFERENCES)
6. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев: Наукова думка; 1987.
7. Карганов М.Ю., Киселев М.Ф., Комаров Г.Д., Куинжи Н.Н., Кур-нешова Л.Е., Кучма В.Р. и др. Полисистемный саногенетический мониторинг. М.: МИПКРО; 2001.
8. Титов В.Н., Карганов М.Ю., Ротенко А.А., Дмитриев В.А., Алчи-нова И.Б., Архипова Е.Н. Биологические функции и биологические реакции. Лазерная корреляционная спектроскопия в оценке чистоты межклеточной среды - функции эндоэкологии (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. 2009; (6): 21—36.
12. Жданов Р.И., Стражевская Н.Б., Шмырина А.С., Крылов А.С., Зарубина Т.В., Карганов М.Ю. и др. Нестабильность геномной ДНК и изменение состава жирных кислот ДНК-связанных ли-пидов селезенки крыс при фолат-индуцированной гипергомоци-стеинемии. Патогенез. 2006; 4(4): 82—92.
13. Пирузян Л.А., Ковалев И.Е., Ковалева В.Л., Тюменцева Е.С., Балаболкин И.И., Карганов М.Ю. и др. Лазерная корреляционная спектроскопия макромолекулярных комплексов в сыворотке крови как эффективный метод оценки течения заболевания бронхиальной астмой у детей. Доклады Академии наук. 2004; 395(6): 832—6.
14. Карганов М.Ю., Ковалева О.И., Санадзе А.Г., Сиднев Д.В., Пивоваров В.В., Ланда С.Б. Сравнительный анализ информативности радиоиммунологического исследования и лазерной корреляционной спектроскопии при миастении и миастенических синдромах. Неврологический журнал. 2003; 8(s 1): 26—9.
Поступила 02.04.16
references
1. De Jong W.H., Borm P. J. Drug delivery and nanoparticles: Applications and hazards. Int. J. Nanomedicine. 2008; 3(2): 133—49.
2. Thevenot P., Cho J., Wavhal D., Timmons R.B., Tang L. surface chemistry influences cancer killing effect of ТЮ2 nanoparticles. Nanomedicine. 2008; 4(3): 226—36.
3. Bae Y.H., Park K. Targeted drug delivery to tumors: Myths, reality and possibility. J. Control. Release. 2012; 153(3): 198—205.
4. Mirshafiee V., Mahmoudi M., Lou K., Cheng J., Kraft M.L. Protein corona significantly reduces active targeting yield. Chem. Commun. 2013; 49: 2557—9.
5. Dell'orco D., Lundqvist M., oslakovic C., Cedervall Т., Linse s. Modeling the time evolution of the nanoparticle-protein corona in a body fluid. PLos one. 2010; 5(6): e10949.
6. Lebedev A.D., Levchuk Yu.N., Lomakin A.V., Noskin V.A. Laser Correlation spectroscopy in Biology [Lazernaya korrelyatsionnaya spektroskopiya v biologii]. Kiev: Naukova dumka; 1987. (in Russian)
7. Karganov M.Yu., Kiselev M.F., Komarov G.D., Kuinzhi N.N., Kurneshova L.E., Kuchma V.R. et al. Polysystemic sanogenetic Monitoring [Polisistemnyy sanogeneticheskiy monitoring]. Moscow: MIPKRo; 2001. (in Russian)
8. Titov V.N., Karganov M.Yu., Rotenko A.A., Dmitriev V.A., Alchinova I.B., Arkhipova E.N. Biological functions and biological reactions. Laser correlation spectroscopy in an assessment of purity of the intercellular environment - functions of an endoekologiya (lecture). Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2009; (6): 21— 36. (in Russian)
9. Karganov M., Alchinova I., Arkhipova E., skalny A.V. Laser Correlation spectroscopy: Nutritional, Ecological and Toxic Aspects. In: Misra A.N., ed. Biophysics. InTech; 2012: 1—16.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248—54.
11. Cedervall Т., Lynch I., Lindman s., Berggеrd Т., Thulin E., Nilsson H. et al. understanding the nanoparticle-protein corona using methods to quantify exchange rates and affinities of proteins for nanopar-ticles. Proc. Natl. Acad. sci. u s A. 2007; 104: 2050—5.
12. Zhdanov R.I., strazhevskaya N.B., shmyrina A.s., Krylov A.s., Zarubina T.V., Karganov M.Yu. et al. Instability of genomic DNA and change of composition of fatty acids of the DNA-connected lip-ids of a spleen of rats at the folat-induced hyperhomocysteinemia. Patogenez. 2006; 4(4): 82—92. (in Russian)
13. Piruzyan L.A., Kovalev I.E., Kovaleva V.L., Tyumentseva E.s., Bal-abolkin I.I., Karganov M.Yu. et al. Laser correlation spectroscopy of macromolecular complexes in blood serum as an effective method of an assessment of a course of a disease of bronchial asthma at children. Doklady Akademii nauk. 2004; 395(6): 832—6. (in Russian)
14. Karganov M.Yu., Kovaleva o.I., sanadze A.G., sidnev D.V., Pivo-varov V.V., Landa s.B. Comparative analysis of the information content of radioimmunoassay and laser correlation spectroscopy with myasthenia gravis and myasthenic syndromes. Nevrologicheskiy zhurnal. 2003; 8(s1): 26—9. (in Russian)
Received 02.04.16
