CC BY
12
УДК 577.158.54
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ С ДИМЕТИЛОКСИЛЮЦИФЕРИНОМ О.В. Леонтьева, Т.Н. Власова, Н.Н. Угарова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: [email protected])
Анализ спектров поглощения и флуоресценции диметилоксилюциферина (ДМОЛ) в диапазоне рН 3,9-12,0 показал, что при рН 12,0 значение А,макс поглощения сдвигается с 485 нм (рН 9,6) до 356 нм. При рН 3,9-8,0 А,макс флуоресценции для ДМОЛ составляет 639 нм. При более высоких рН наблюдается дополнительный пик флуоресценции, А,макс = 537 нм (A,ex = 383 нм), интенсивность которого растет во времени. Показано, что этот пик относится к продукту химического превращения ДМОЛ при рН > 9, которое описывается реакцией первого порядка (k = 0,02 мин-1). Изучены каталитические и флуоресцентные свойства люциферазы светляков в присутствии 20-140 мкМ ДМОЛ при рН 7,8. Из данных по тушению собственной флуоресценции белка определена константа связывания люциферазы с ДМОЛ (Ks = 45,7 мкМ). Показано, что ДМОЛ является сильным ингибитором люциферазы (Кг = 10 мкМ).
Люцифераза светляков катализирует реакцию окисления кислородом воздуха специфического субстрата лю-
циферина (ЬЫ2) в присутствии аденозин-5'-трифосфата
2 2+
(АТР) и ионов М§ ; продукт реакции - оксилюцифе-рин (рис. 1) в синглетном электронно-возбужденном состоянии, переход которого в основное состояние сопровождается эмиссией видимого света.
Поведение электронно-возбужденной молекулы в растворе не зависит от механизма ее образования. При хемилюминесценции и биолюминесценции молекула переходит в электронно-возбужденное состояние за счет энергии химической реакции, при фотолюминесценции -за счет поглощения энергии света, поэтому хорошей моделью биолюминесценции может служить флуоресценция оксилюциферина [1]. Однако оксилюциферин в водном растворе нестабилен, вместо него был выбран его более стабильный аналог - диметилоксилюциферин (ДМОЛ) (рис. 1). Оксилюциферин может существовать как в кетонной (при рН < 6), так и в енольной (при рН > 7) форме. ДМОЛ содержит две метильные груп-
Фенол Фенолят
Диметилоксилюциферин
Рис. 1. Оксилюциферин и диметилоксилюциферин (ДМОЛ)
пы, препятствующие превращению кетона в енол. Целью данной работы было изучение спектральных и флуоресцентных свойств ДМОЛ, а также его взаимодействия с люциферазой светляков.
Материалы и методы Использованные вещества. Использовали диметилоксилюциферин (ДМОЛ), синтезированный доктором Д. Вейсом [2], люциферин, синтезированный по методу [3]. Рекомбинантную люциферазу светляков Luciola mingrelica выделяли из клеток E. coli (штамм LE 392), несущих плазмиду суперпродуцент pLR с геном люциферазы, и очищали по методу [4]. Растворы готовили на дистиллированной деионизированной воде (Milli Q, США).
Регистрацию спектров поглощения выполняли на спектрофотометре Shimadzu UV 1202 в интервале от 250 до 600 нм, используя 2 мл буферного раствора с фиксированным рН и 40 мкл этанольного раствора ДМОЛ с концентрацией 10-3 М.
Регистрацию спектров флуоресценции выполняли на спектрофлуориметре LS50B "Perkin Elmer" в интервале 450-750 нм (^возб = 383, 425, 485нм), используя 2 мл буферного раствора с фиксированным рН и 10 мкл спиртового раствора ДМОЛ с концентрацией 10-3 М.
Флуоресцентное титрование люциферазы L. mingrelica диметилоксилюциферином выполняли, используя раствор люциферазы с активностью 1,2-10' мВ/мл в 0,05 М Трис-ацетатном буфере (2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, рН 7,8) и 1 мМ раствор ДМОЛ в том же буфере. К 2 мл раствора люциферазы добавляли по 10 мкл раствора ДМОЛ и регистрировали спектр собственной флуоресцен-
Рис. 2. Спектры поглощения ДМОЛ в буферных растворах с разными значениями рН: 1 - 9,62; 2 - 8,60; 3 - 8,24; 4 - 7,66; 5 - 7,12; 6 - 6,37;
7 - 5,75; 8 - 5,08; 9 - 4,63
ции белка в интервале от 300 до 400 нм (Хех = 290 нм). Степень тушения флуоресценции определяли с учетом разбавления, проводя в тех же условиях титрование белка буферным раствором. Полученные данные обрабатывали по уравнению Штерна-Фольмера [5].
Ингибирование люциферазы диметилоксилюцифе-рином. Получали зависимости интенсивности биолюминесценции, пропорциональной скорости ферментативной реакции [6], от концентрации одного субстрата при фиксированной концентрации другого в присутствии ДМОЛ, концентрация которого составляла от 0 до 25 мкМ. Тип ингибирования определяли по методу Лайнуивера-Берка [7]; константы ингибирования (К ) в
случае конкурентного и неконкурентного ингибирования определяли по методу Диксона, а в случае бесконкурентного ингибирования - по методу, описанному в [7].
Результаты и обсуждение
Спектры поглощения и флуоресценции ДМОЛ. Ди-метилоксилюциферин содержит фенольную группу, которая депротонируется при щелочных рН. Спектры поглощения ДМОЛ в диапазоне рН 4,6-9,6 (рис. 2) указывают на существование равновесия между фенольной (Хюкс = 383 нм) и фенолятной (Хмакс = 485 нм) формами ДМОЛ с величиной рК = 7,8, которая несколько отличается от рК фенольной группы оксилюциферина (7,4) [8]. Известно, что для возбужденной молекулы фенола
рК значительно уменьшается. Приблизительная оценка
*
рК в возбужденном состоянии из спектров поглощения
*
по методу Ферстера [4] дает величину рК = -3,91. Следовательно, ДМОЛ в возбужденном состоянии - сильная кислота, существующая в фенолятной форме при всех изученных рН.
Таким образом, в спектрах флуоресценции можно было ожидать наличие только одного пика независимо от длины волны возбуждения. Ранее [2] были получены спектры флуоресценции ДМОЛ при Хех = 390 нм (Хмакс поглощения фенольной формы). При рН 6,0 авторы наблюдали красную флуоресценцию, а при рН > 8 - желто-зеленую. Однако это явление не было объяснено. Нами были получены спектры флуоресценции ДМОЛ в диапазоне рН 3,9-10,5 при трех величинах длины волны возбуждения: 485 нм (X с поглощения фенолятной формы), 425 нм (изобестическая точка), 383 нм (X с поглощения фенольной формы). При X = 485 нм наблюдали
X, нм
X, нм
Рис. 3. Спектры флуоресценции ДМОЛ в буферных растворах с разными значениями рН. а: X 9,18; 3 - 8,24; 4 - 7,66; 5 - 5,75; 6 - 4,63; б: Хех = 383 нм при рН: 1 - 10,5; 2 - 10,23; 3 - 9,18; 4 -
8 - 4,97; 9 - 3,94
= 425 нм при рН: 1 - 10,5; 2 -3,24; 5 - 7,12; 6 - 6,37; 7 - 5,97;
б
а
один пик (Хмакс = 639 нм) при любом рН. Интенсивность флуоресценции уменьшалась с понижением рН, что можно объяснить снижением концентрации фенолят-иона. При Хех = 425 и 383 нм при рН > 8,0 наблюдали два пика флуоресценции (Хмакс = 537 и 639 нм) (рис. 3).
Интенсивность желто-зеленой флуоресценции (Хмакс = 537 нм) увеличивалась с ростом рН, тогда как интенсивность красной (Хмакс = 639 нм) наоборот уменьшалась. Необходимо отметить, что интенсивность желто-зеленой флуоресценции увеличивалась со временем и не исчезала при сдвиге рН в кислую область. В спектрах поглощения после инкубации при щелочном рН в течение 15-20 мин появлялся новый пик с X = 356 нм. Таким образом, изменения в
макс г '
спектрах поглощения и флуоресценции, по-видимому, объясняются тем, что ДМОЛ претерпевает некие химические превращения при щелочных рН. Дополни-
тельные пики в спектрах поглощения и флуоресценции соответствуют продукту этой химической реакции. Скорость данной реакции сильно зависит от рН. Так, при рН 9,2 продукт реакции регистрируется сразу после внесения ДМОЛ в раствор. При рН 10,3 кинетика накопления продукта этой реакции соответствует кривой первого порядка с к = 0,02 мин \ В то же время при рН 7,8 (рНмакс активности люциферазы) спектры поглощения и флуоресценции ДМОЛ не меняются в течение 6 часов. Это позволило использовать ДМОЛ для изучения его взаимодействия с люци-феразой при рН 7,8.
Взаимодействие диметилоксилюциферина с люци-феразой светляков. Кинетические и флуоресцентные свойства люциферазы светляков были изучены при рН 7,8 в отсутствие и присутствии ДМОЛ. При титровании раствора фермента раствором ДМОЛ (0-120 мкМ) на-
0
1 СП
О
>
40
30
20
10
0 10 20 30
[ATP] -1, мМ"1
и
5 6
СП
О
>
-1-'-1-'-1-
12 16
[LH2]~ , мкМ"
б
а
в
г
Рис. 4. Зависимость скорости люциферазной реакции от концентрации одного субстрата при постоянной насыщающей (а, б) и ненасыщающей (в, г) концентрации другого в координатах Лайнуивера-Берка. a: ДМОЛ, мкМ: 1 - 25; 2 - 18; 3 - 7; 4 - 2,5; 5 - 0 (концентрация люциферина 0,33 мМ); б: ДМОЛ, мкМ: 1 - 25; 2 - 18; 3 - 7; 4 - 2,5; 5 - 0 (концентрация АТР 1 мМ); в: ДМОЛ, мкМ: 1 - 0; 2 - 1,28; 3 - 3,5; 4 - 10; 5 - 17,5 (концентрация люциферина 1 мкМ); г: ДМОЛ, мкМ: 1 - 0; 2 - 1,28; 3 - 3,5; 4 - 10 (концентрация АТР 1 мкМ)
Ингибирование люциферазы диметилоксилюциферином
Условия Тип ингибирования
[LH2] >> Km LH2 [ATP] >> KmATP [LH2] << Km LH2 [ATP] << KmATP Бесконкурентное по АТР Неконкурентное по LH2 Неконкурентное по АТР Конкурентное по LH2
блюдали тушение собственной флуоресценции люциферазы (флуоресценции единственного остатка Trp в лю-циферазе Luciola mingrelica), которое описывается константой связывания (К) равной 45,7 мкМ, что достаточно близко к константе связывания люциферзы с субстратом люциферином (34 мкМ) [9].
Были получены зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации одного из субстратов (АТР или LH2) при фиксированной насыщающей (1 мМ АТР или 0,33 мМ LH2) и ненасыщающей (1 мкМ АТР или 1 мкМ LH2) концентрации другого субстрата в присутствии ДМОЛ, концентация которого менялась от 0 до 25 мкМ. Полученные зависимости показали, что
Работа выполнена при финансовой поддержке РФ1
ДМОЛ является сильным ингибитором люциферазы. Экспериментальные данные, представленные в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 4), показывают, что тип ингибирования (таблица) зависит от соотношения концентраций субстратов люциферазы: LH2 и АТР.
Экспериментальные данные были представлены в координатах Диксона для конкурентного и неконкурентного ингибирования и в координатах [ATP]/v -[ДМОЛ] для бесконкурентного ингибирования, откуда были определены константы ингибирования Кин . Во всех случаях константа ингибирования была одинакова и равна 10 мкМ. Эта величина значительно выше, чем аналогичная для оксилюциферина (одного из самых сильных ингибиторов люциферазы), однако характер ингибирования люциферазы совпадает для ДМОЛ и оксилюциферина [10].
Таким образом, ДМОЛ является ингибитором люци-феразы, который, по-видимому, связывается в области, близкой к центру связывания люциферина и оксилюци-ферина, но в силу возможных стерических затруднений его сродство к белку значительно ниже.
4 (проект 02-04-48-961) и INTAS (проект 2000-0562).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Plant P. J., White E.H., McElroy W.D. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1968. 31. N 1. Р. 98.
2. Weiss D, Beckert R, Lamm K, Baader W.J. еt al. // Bioluminescence
and chemiluminescence.World scientific. 2001. Р. 197.
3. ТалебаровскаяИ.К., КатковаВ.А., РыжоваВ.В., ЩеголевА.А и
др. Способ получения D-люциферина. Авт. cß. №1192324. 1983.
4. Кутузова Г.Д., Дементьева Е.И., Болдвин Т.О., Угарова Н.Н. //
Биотехнология. 1992. N5. С. 43.
5. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.,
1986.
6. Ugarova N.N. // J. Biolum. Chemilumin. 1989. 4. Р. 406.
7. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.,
1978.
8. Gandelman O.A., Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Chikishev A.Yu. ct
al. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1993. 19. № 19. Р. 187.
9. Чудинова Е.А., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П. и
др. //Биохимия. 1999. 64. №10. С. 1097.
10. ДементьеваЕ.И. // Дис. ... канд. хим. наук. М., 1986.
Поступила в редакцию 25.10.02
