CC BY
61УДК 612.1
М. Ю. Милорадов, Е. В. Узикова, С. В. Булаева
Взаимодействие клеток крови: феномены и молекулярная сигнализация
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.B37.21.0214 и при поддержке гранта РФФИ № 12-04-00550-а.
Известно, что кровь состоит из суспензии форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в плазме. Эти клетки крови могут взаимодействовать в потоке, например, выделением сигнальных молекул. Последнее способно приводить к изменению микрореологических свойств клеток. В связи с этим целью данного исследования стало изучение влияния лейкоцитов и тромбоцитов на микрореологические свойства эритроцитов.
Ключевые слова: агрегация эритроцитов, текучесть крови, тромбоциты, адгезия лейкоцитов, деформируемость эритроцитов, микрореологические свойства.
M. Ju. Miloradov, E. V. Uzikova, S. V. Bulaeva
Blood Cell Interaction: Phenomena and Molecular Signaling
Blood is a concentrated suspension of formed elements that includes red blood cells (RBCs), white blood cells (WBCs), and platelets. These cells can interact in a blood flow and their microrheological properties can be altered. The aim of this study was to investigate whether WBCs and platelets have an effect upon RBC microrheology.
Keywords: RBCs aggregation, blood fluidity, platelets, leukocyte adhesion, RBC deformability, microrheological properties.
Введение
Выполнение кровью присущих ей физиологических функций, особенно на уровне микроциркуляции, где диаметр сосудов соизмерим с размерами клеток и непосредственно осуществляется перфузия тканей и транскапиллярный обмен, во многом определяется способностью клеток крови к взаимодействию между собой, друг с другом и с клетками сосудистого эндотелия.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что такие реологические параметры, как агрегация эритроцитов, влияют на адгезию лейкоцитов в сосудистом русле [17]. В свою очередь, активированные лейкоциты продуцируют сигнальные молекулы, способные действовать на эритроциты, изменяя их микрореологические свойства, и в том числе агрегацию [14]. Вместе с тем имеются лишь отдельные работы, в которых исследовано взаимодействие эритроцитов и лейкоцитов. В них анализируется влияние отдельных микрореологических изменений одних клеток крови на другие [12, 19, 23], тогда как комплексного исследования влияния лейкоцитов на микрореологические характеристики эритроцитов не проводилось.
Процесс агрегации тромбоцитов и эритроцитов изучается уже достаточно давно. В более ранних экспериментальных работах было показано влияние суспензионной среды и мембранных свойств на межэритроцитарные взаимодействия [1, 6, 8]. Многочисленные исследования ведутся и в отношении агрегации тромбоцитов [2-4]. Однако нами не было найдено исчерпывающей информации о взаимосвязи процессов агрегации эритроцитов и тромбоцитов, хотя в условиях течения in vivo эти два процесса происходят в сходных условиях и являются зависимыми от ряда общих факторов.
Целью данного исследования было изучение влияния лейкоцитов и тромбоцитов, а также продуцируемых ими веществ на микрореологические свойства эритроцитов.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на венозной крови практически здоровых мужчин и женщин в возрасте 20-30 лет (n=64). Забор крови производился утром натощак из локтевой вены без наложения жгута в условиях клинической лаборатории квалифицированным медицинским персоналом после получения информированного согласия донора. В качестве ан-
© Милорадов М. Ю., Узикова Е. В., Булаева С. В., 2012
тикоагулянта использовали гепарин (10 МЕ/мл). Все измерения и манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора.
Были организованы 3 серии исследований. В первой серии изучали влияние лейкоцитов, обработанных и не обработанных адреналином на агрегацию эритроцитов с использованием ранее описанных методик [5, 11].
Во второй серии эритроциты инкубировали в изотоническом растворе с одним из важных про-воспалительных цитокинов интерлейкином-8 (10 мкг/мл), и одним из ферментов, продуцируемых нейтрофилами, миелопероксидазой (МПО, в концентрациях 10нМ, и 50нМ). Время инкубации составляло 15 мин. С помощью метода оптической микроскопии определяли степень агрегации [10]; деформируемость эритроцитов оценивали путем определения индекса удлинения эритроцитов (ИУЭ) методом проточной микрокамеры.
В третьей серии опытов исследовали влияние тромбоцитов на агрегацию эритроцитов. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОБОГ. Т. П.) получали путем центрифугирования антикоагулированной крови в течение 7 мин. при 1000 об/мин. После ее отделения оставшуюся кровь центрифугировали в течение 20 мин. при 3000 об/мин., после чего разделяли обедненную тромбоцитами плазму (ОБЕДН. Т. П.) и эритроцитарную массу [2]. Для активации и индуцированной агрегации тромбоцитов в аликвоты
ОБОГ. Т. П. добавляли адреналин до конечной концентрации 1 мкМ. Образцы плазмы с препаратами оставляли на 10 мин. при комнатной температуре. Суспензию красных клеток крови в изотоническом растворе хлорида натрия при стандартном показателе Hct=40 % инкубировали в течение 15 мин. при температуре 37 0С. Затем эритроциты отделяли от раствора центрифугированием и ресуспендировали в заранее заготовленные образцы аутологичной плазмы с различной концентрацией тромбоцитов при стандартном показателе Hct=40 % и измеряли индексы агрегации эритроцитов с помощью агрего-метра МА1 (Myrenne, Германия) [13].
Статистическую обработку полученных цифровых материалов и все виды анализа результатов проводили на РС IBM, используя табличный редактор Microsoft Excel и программу "Statistica" (версия 6.0).
Результаты исследования и их обсуждение
В первой серии исследований путем оптической микроскопии была обнаружена тенденция к снижению ПА и ИИА на 9 и 5 % соответственно в присутствии лейкоцитов по сравнению с контролем (суспензия RBC без лейкоцитов) и достоверное снижение ПА и ИИА на 27 и 25 % соответственно в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином (рис. 1).
□ Контроль
О В присутствии лейкоцитов
□ В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином
Рис. 1. Изменение ПА и ИИА эритроцитов в присутствии лейкоцитов, обработанных и необработанных
адреналином, по сравнению с контролем.
* - различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контролем
При измерении агрегации с помощью полуав- (СА) эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не томатического агрегометра МА1 получили дос- обработанных адреналином) и эритроцитов (в товерное (p<0,01) снижение степени агрегации присутствии лейкоцитов, обработанных адрена-
лином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига (3 с"1) в интервале времени 10 с (М1ю), на 16 и 21 % соответственно. При измерении степени агрегации эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов,
обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига (3 с"1) в интервале времени 5 с (М15), отмечено достоверное снижение агрегации на 17 и 21 % соответственно (рис. 2).
О Контроль
В В присутствии лейкоцитов
В В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином
Рис. 2. Изменение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных и необработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига в течение 10 и 5 с, по сравнению с контролем
** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.
При измерении агрегации с помощью полуавтоматического агрегометра МА1 получили достоверное снижение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига (600 с-1) в интервале времени 10 с (М10), на 14 и 22 % соответственно. При измерении СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига (600 с-1) в интервале времени 5 с (М5), отмечено снижение агрегации на 11 и 20 % соответственно (рис. 3).
Таким образом, присутствие лейкоцитов в суспензии эритроцитов сочетается с достоверным снижением их агрегации, что подтверждается измерением этой микрореологической характеристики двумя разными методами. Поскольку при регистрации агрегации прибором МА1 соотношение лейкоцитов и эритроцитов было примерно как 1:1000, вряд ли лейкоциты влияли на микрореологическое поведение эритроцитов ме-
ханическим способом. Вполне вероятно, что лейкоциты продуцируют какие-то сигнальные молекулы, которые действуют на эритроциты и выраженно снижают их агрегацию. Для понимания механизмов этого явления была проведена вторая серия исследований.
Активированные лейкоциты выделяют про-воспалительные цитокины. Под их воздействием происходит стимулирование функций клеток эндотелия и лейкоцитов. Интерлейкин-8, являясь основным хемотактическим фактором поли-морфноядерных нейтрофильных гранулоцитов, играет ведущую роль в их привлечении в очаг воспаления in vivo. Его роль в хемотаксисе ней-трофилов иллюстрируется тем, что инъекция ИЛ-8 вызывает сильную воспалительную реакцию, сопровождающуюся массивной лейкоцитарной инфильтрацией.
При инкубации эритроцитов с интерлейки-ном-8 прослеживалась тенденция к снижению ПА и ИИА на 10 и 7 % соответственно, и практически не наблюдалось изменение деформируемости (рис. 4).
О Контроль
О В присутствии лейкоцитов
О В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином
Рис. 3. Изменение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных и не обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига в течение 10 и 5 с по сравнению с контролем
* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем; ** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.
I Контроль О Интерлейкин-8
R S
X
«
X
«
я
м
Н
120 100 80 60 40 20 0
Р
I
т
Ш
Р Р Р ¡1!
ПА
ИИА
ИУЭ
Рис. 4. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии интерлейкина-8 по сравнению с контролем
Миелопероксидаза (МПО) - железосодержащий фермент, который находится в азурофиль-ных гранулах нейтрофилов.
Было установлено, что МПО в концентрации 10 нМ способствовала достоверному снижению ПА и ИИА эритроцитов на 33 и 39 % соответственно и достоверному снижению деформируемости эритроцитов на 15 % (рис. 5).
В концентрации 50 нМ МПО привела к достоверному снижению ПА и ИИА на 49 и 50 % соответственно и достоверному снижению ИУЭ на 8 % (рис 6).
Согласно литературным данным измененные механические свойства эритроцитов, такие как мембранная жесткость, цитоплазматическая вязкость, снижают скорость и степень агрегации клеток [15, 18, 20, 21].
Нельзя исключить, что МПО проявляет свою ферментативную активность и продуцирует НОС1, которая может инициировать перекисное окисление липидов. Но, помимо этого, НОС1 может и по молекулярным механизмам (без образования свободных радикалов) модифицировать белки, липиды и другие биомолекулы.
□ Контроль И МПО (10 нМ)
Рис. 5. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии МПО (10 нМ) по сравнению с контролем
** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем; *** - различия достоверны при р<0,001 по сравнению
с контролем.
120
□ Контроль В МПО (50 нМ)
R S
X
«
X
100
80
60
40
20
ПА
ИИА
ИУЭ
■к
0
Рис. 6. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии МПО (50 нМ) по сравнению с контролем
* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем; ** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.
Возможен и другой, не имеющий отношения к ферментативной активности механизм. МПО как поликатионный белок может связываться с поверхностью клетки и изменять свойства ее плазматической мембраны.
При исследовании влияния тромбоцитов на про-агрегантные свойства эритроцитов агрегацию последних измеряли в разных сдвиговых условиях.
В результате исследования выяснили, что в отсутствие сдвигового течения индексы агрегации эритроцитов (М5 и М10), суспендированных в ОБОГ. Т. П., были на 16 % (р>0,01) и на 18 % (р>0,01) меньше соответствующих индексов, полученных в ОБЕДН. Т. П. Еще более выраженное снижение агрегации эритроцитов было в ОБОГ. Т. П. с добавлением адреналина, где оно составило 24 % (р>0,01) и 22 % (р>0,01) соответ-
ственно (рис. 7). Подобные изменения агрегации красных клеток крови наблюдались и в условиях низкосдвигового течения, когда оно способствовало сближению и взаимодействию клеток. Индексы агрегации эритроцитов (М15 и М1ю) снижались на 15 % и 14 % в ОБОГ. Т. П. и на 24 % и 25 % в ОБОГ. Т. П. с добавлением адреналина в сравнении с соответствующими индексами, измеренными в ОБЕДН. Т. П. (рис.7).
Таким образом, результаты исследования показывают, что тромбоциты влияют на проагре-гантные свойства эритроцитов. Присутствие тромбоцитов в суспензионной среде существенно снижало агрегацию красных клеток крови. Следует отметить, что тромбоциты, подвергшиеся влиянию адреналина, еще сильнее проявляли эти свойства.
□ ОБЕДН. Т. П. □ ОБОГ. Т. П. ■ ОБОГ. Т. П. (адреналин)
100,00
5?
¡я 75,00 и н е
| 50,00 ¡S
25,00 0,00
М5
М10
М15
М110
Рис. 7. Индексы агрегации эритроцитов в ОБЕДН. Т. П. и ОБОГ. Т. П., измеренные в разных сдвиговых условиях
и временных интервалах
** - различия достоверны по сравнению с индексом агрегации в ОБЕДН. Т. П. при р<0,01; *** - различия достоверны по сравнению с индексом агрегации в ОБЕДН. Т. П. при р<0,001.
Адреналин вызывает агрегацию тромбоцитов без изменения дисковидной формы, взаимодействуя с а-адренорецепторами плазматической мембраны. Известно, что агрегация тромбоцитов, стимулированная адреналином, обусловлена активацией а2-адренорецепторов [7, 9]. При их активации происходит ингибирование аденилат-циклазы, при этом предполагается, что механизм действия адреналина связан с модуляцией мембран и изменением их проницаемости к ионам Са2+ [16]. Вход Са2+ в тромбоциты при их акти-
вации может сопровождаться снижением уровня свободного экстрацеллюлярного кальция в плазме, что, в свою очередь, способно быть причиной снижения агрегации эритроцитов. Тот же самый процесс может происходить и при спонтанной агрегации тромбоцитов в ОБОГ. Т. П., но менее интенсивно. С другой стороны, воздействие тромбоцитов может быть опосредовано рядом активных веществ, выделяющихся при их активации: простагландинов, простациклинов, тром-боксанов, гистамина, серотонина и т. д. [22].
Библиографический список
1. Блохина, Т. А. Роль плазменных факторов в регуляции реологических свойств эритроцитов человека [Текст] / Т. А. Блохина, С. Б. Назаров, В. В. Чемоданов // Мат. международн. конф. по гемореологии. -Ярославль, 2001. - С. 60-61.
2. Егорихина, М. Н. Роль фибриногена в агрегации клеток крови при ожоговой болезни [Текст] / М. Н. Егорихина // Тромбоз, гемостаз и реология. -2009. - № 3. - С. 67-75.
3. Кузник, Б. И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и при патологии [Текст] : монография / Б. И. Кузник. - Чита : Экспресс-издательство, 2010. - 832 с.
4. Левин, Г. Я. Нарушения гемостаза и ДВС-синдром в острый период ожоговой болезни [Текст] / Г. Я. Левин // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2004. -№ 4. - С. 55-62.
5. Михайлов, П. В. Влияние макро- и микрореологических параметров крови на адгезию лейкоцитов
[Текст] : автореф. дисс. ...канд. биол. наук / П. В. Михайлов. - Ярославль, 2004. - 22 с.
6. Муравьев, А. В. Анализ влияния плазменных и клеточных факторов на агрегацию эритроцитов разных возрастных популяций [Текст] / А. В. Муравьев, И. А. Тихомирова, Д. В. Борисов // Физиология человека. - 2002. - Т. 28, № 4. - С. 144-148.
7. Орлов, С. Н., Новиков, К. Н. Регуляция объема клеток : механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение [Текст] / С. Н. Орлов, К. Н. Новиков // Росс. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 1996. - Т. 82, № 8-9. - С. 1-15.
8. Тихомирова, И. А. Роль экстрацеллюлярных, мембранных и внутриклеточных факторов в процессе агрегации эритроцитов [Текст] : автореф. ... докт. биол. наук / И. А. Тихомирова. - Ярославль, 2006. -48 с.
9. Ткачук, В. А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов [Текст] /
**
В. А. Ткачук // Рос. физиол. журнал им. И. М Сеченова. - 1998. - Т. 84, № 10. - С. 1006-1018.
10. Узикова, Е. В. Молекулярные механизмы агрегации и адгезии эритроцитов [Текст] / Е. В. Узикова [и др.] // Ярославский педагогический вестник. - 2011. - Т. 3, № 4. - С. 105-107.
11. Узикова, Е. В. Взаимодействие клеток крови: влияние присутствия лейкоцитов в суспензионной среде на агрегацию эритроцитов [Текст] / Е. В. Узикова [и др.] // Тезисы докладов 5-й Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - М., 2012. - С. 125126.
12. Bagge U., Branemark P.-I. White blood cell rheology. An intravital study in man // Adv. Microcirculation. -1997. - Vol.7. - P.1-17.
13. Baskurt O. K., Farley R. A., Meiselman H. J. Erythrocyte aggregation tendency and cellular properties in horse, human, and rat: a comparative study // Amer. J. Physiol. - 1997. - Vol. 273. - P. H2604-H2612.
14. Baskurt O. K., Meiselman H. J. Cellular determinations of low-shear blood viscosity // Biorheology. -1997. - Vol.34. - №. - 3. - P. 235-247.
15. Bradley A. J., Murad K. L., Regan K. L., Scott M.D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter [Текст] // Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes. -2002. - Vol. 1561. - № 2. - P. 147-158.
16. Clerck F., Xhonneux B., Wiele R. Biochemical mechanisms in 5-hydroxy tryptamine-induced human
platelet aggregation // Agents Action. - 1985. - Vol. 17, №2. - P. 220-228.
17. Johnson P., Cabel M., Popel A. Venous resistance and red cell aggregation // Abstr. Microcirculatory Soc. 41st Annu. Conf.-Anaheim, California. - 1994. -P. 82-83.
18. Meiselman H. J. Red-blood-cell role in RBC aggregation [Текст] // Clin Hemorheol. - 1993. - № 13. -P. 575-592.
19. Munn L. L., Melder R. J., Jain R. K. The role of erythrocytes in leukocyte-endothelial interactions // Biorheology. - 1995. - Vol.32. - №2- 3. - p. 142.
20. Nash G. B., Wenby R. B., Sowemimo-Coker S. O., Meiselman H. J. Influence of cellular properties on red cell aggregation // Clin. Hemorheol. - 1987. - № 7. -P. 93-108.
21. Sowemimo-Coker S. O., Whittingstall P., Pietsch L. et al. Effects of cellular factors on the aggregation behavior of human, rat and bovine erythrocytes // Clin. Hemorheol. Microcirc. - 1989. - № 9. - P. 723-737.
22. Stoltz J.-F., Donner M. Hemorheology: importance of erythrocyte aggregation // Clin. Hemorheol. -1987. - № 7. - P. 15-23.
23.Wautier M-P., Boulanger E., Wautier J-L. Erythro-cytes from diabetic patients adhere to endothelium and potentiate leukocyte adhesion molecule expression // Materials of 11th International Congress of Biorheology and 4th International Conference on Clinical Hemorheology. -Antalya. - Turkey. - September 22-26, 2002. - P. 85.
