CC BY
20
XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС
ТЕЗИСЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
Изучение экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП-2 И ММП-9) в плоскоклеточном раке гортани
Р. Н. Кулагин3, С. В. Петров'■2
Место работы: 'ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрав России, Казань, Россия; 2Приволжский филиал РОНЦ им. Н. Н. Блохина, Казань, Россия; 3ГАУЗ «ГКБ№7», Казань, Россия. e-mail: rnkulagin@yandex.ru
Цель. Исследовать экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) в плоскоклеточном раке гортани и изучить ее связь с некоторыми клинико-морфологическими показателями и прогнозом заболевания. Материалы и методы. Использовались парафиновые блоки архивного материала, полученного от 201-го больного за период с 2000 по 2009 г., с дальнейшим изготовлением восьми ТМА-мультиблоков (технология tissue microarray) и оцифровкой микропрепаратов на сканере Mirax MIDI (Carl Ziess). Для иммуногистохимического исследования использовалось антитела против ММП-2 (MMP-2, 72kDa Collagenase IV, разведение 1:50, Clone VB3, LabVision Corp.) и ММР-9 (MMP-9, 92kDa Collagenase IV, разведение 1:35, LabVision Corp.).
Для визуализации применяли систему детекции UltraVision с DAB Plus хромогеном (LabVision Corp.). Результаты. Распределение по клиническим стадиям следующее: I-я — 7 случаев, II — 56, III — 95, IV — 43. Больных с опухолями, имеющими степень дифференцировки G1, было 60, G2-54, G3-83. Метастазы в регионарные лимфатические узлы отмечены в 45 случаях (22,4%). Цитоплазматическая экспрессия ММР-2 обнаружена в 47,2%, а ММР-9 — в 35% (в 95-ти и 70-ти случаях, соответственно). Пятилетняя выживаемость в исследуемой группе составила 46,7% (94 случая), а рецидивы обнаружены в 7,9% (16 случаев). В низкодиф-ференцированных опухолях (G3) наблюдается достоверное снижение экспрессии исследуемых маркеров по сравнению с высокодифференцированными (G1) (р<0,002). Нами обнаружено, что в группе больных (III IV) клинических стадий статистически увеличивается экспрессия ММР-2 по сравнению с начальными клиническими стадиями (I—II) (р<0,001). При увеличении размера опухоли (T-стадия) наблюдалось увеличение экспрессии маркера без статистических различий, однако, у пациентов групп Т3 Т4 экспрессия ММР-2 статистически выше, чем у больных Т1 Т2 (р<0,05). У больных с метастазами и рецидивами экспрессия ММР-2 была выше, а ММР-9 — ниже, но без статистических различий (р>0,05). Мы не выявили связи между 5-летней выживаемостью, локализацией опухоли в гортани и возрастом больных и экспрессией изучаемых маркеров.
Заключение. Таким образом, при прогрессии плоскоклеточного рака гортани наблюдается увеличение уровня экспрессии ММР-2, а уровень ММР-9 — снижается.
Взаимодействие клеток асцитной карциномы Эрлиха с анионными липосомами
О. М. Алексеева', Ю. А. Ким2
Место работы: 'Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН. Москва. Россия; 2Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская обл., Россия e-mail: olgavek@yandex.ru
Исследовали взаимодействие клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) с анионными липосомами как вероятными транспортерами лекарственных веществ в клетки карциномы.
Цель. Подбор условий для слияния отрицательно заряженных липосом с отрицательно заряженной мембраной клеток АКЭ и определение вида распределения липосомальных фос-фолипидов на мембране и внутри клетки. Материалы и методы. Флуорофоры N-NBD-PE (N- (7-нитро-бенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) фофсфатидилэтаноламин) и N-Rh-PE (N- (лиссамин родамин В сульфонил) фосфати-дилэтаноламин) «Avanti»; NaCl, HEPES «Sigma»; ПЭГ-300 «The British Drug Hourses Ltd». Клетки АКЭ получали из инъецированных АКЭ мышей через 7—8 дней. Отмывали двукратным осаждением в среде Хенкса с 20мМ HEPES (рН 7,4). Большие однослойные липосомы 1000 Ä, сформированные из пальмитоилолеоилфосфатидилхолина, пальмитоилолео-илфосфатидилсерина и холестерина (2:2:1), получали методом упаривания обратной фазы в среде 100 мМ NaCl и 10 мМ HEPES (рН 7,4). Эфирно-водно липидную фазу интенсивным встряхиванием на вибрационном смесителе 30гц 30 мин до образования однородной эмульсии. Затем упаривали воду под вакуумом, освобождали от эфира, и пропускали через поликарбонатную мембрану-фильтр с порами диаметром 0,1—0,2 мкм для экструзии.
Флуоресцентные фосфолипидные метки N-NBD-PE (N- (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) фофсфатидилэ-таноламин) и N-Rh-PE (N- (лиссамин родамин В сульфонил) фосфатидилэтаноламин) вносили тонкой струей шприцом «Hamilton» в первоначальную смесь в концентрации 1 моль%. Липидные дисперсии пропускали через колонки с сефадек-сами G 15, G 25 и сефарозой B 2. Конечная концентрация липидов в дисперсиях 10 мМ. Флуоресцентномеченые липо-сомы содержали по 400—500 молекул флуорофора. Хранились при 50 C.
Флуоресценцию и кинетики слияния регистрировали на спектрофлуориметре «Perkin-Elmer — MPF 44B» при 370 С и постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и излучения соответственно для N-NBD-флуоро-фора 470нм и 530 нм и для родамин В-флуорофора 470 нм и 577 нм. Фузию и эндоцитоз липосом отслеживали с помощью конфокального лазерного микроскопа «LSM 510 NLO» (Carl Zeiss) с аргоновым и гелий-неоновым лазерами с длинами волн возбуждения 488 нм и 543 нм соответственно. Регистрировали в трех каналах
Результаты. Было показано, что в определенных условиях происходит спонтанное слияние мембран липосом с мембранами клеток АКЭ. Полиэтиленгликоль ПЭГ 300 (15%) действует, как фузоген, а низкое значение pH среды инкубации (5,65) снижает заряженность липосом и клеток, что инициирует слияние мембран липосом из анионных липидов с мембранами клеток асцитной карциномы Эрлиха. Для исследования слияния липосом с клетками АКЭ применили флуоресцентный метод регистрации кинетики слияния. С помощью метода резонансного переноса энергии между меченым (N-NBD) фосфолипидом-донором и меченым (родамин В) фосфолипидом-акцептором обнаружили, что флуоресценция донора не тушится в липосомах в присутствии клеток АКЭ, т. е. перенос энергии снижается. Это происходит из-за встраивания меченных фосфолипидов в мембрану клеток и, соответственно, из-за разбавления концентрации флуорофоров, ведущее к увеличению дистанции между донором и акцептором, и затруднению переноса энергии. На этом этапе были подобраны оптимальные условия слияния липосом с клетками рН 5,65 и концентрация ПЭГ 30010%. Клетки перед опытом хранились при 50С в анаэробных условиях, в результате этого получили метаболическое истощение и увеличили проницаемость мембран.
Злокачественные опухоли
www.malignanttumours.org
Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017
Malignant Tumours
www.malignanttumours.org
XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС
ТЕЗИСЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
По данным конфокальной лазерной микроскопии на разной глубине регистрации обнаружено свечение меченных фос-фолипидов внутри клетки в близкорасположенных к плазма-лемме областях цитоплазмы. Это указывает на то, что часть липосом эндоцитируется в клетки и локализуется вблизи внутренней поверхности мембраны. Также было обнаружено и в плазматической мембране изменение свечения фосфо-липидных флуорофоров при резонансном переносе энергии. Это подтверждает слияние анионных липосом с клетками АКЭ и встраивание липосомальных фосфолипидов в плазматическую мембрану.
Заключение. Оптимальными условиями, подобранными для взаимодействия клеток асцитной карциномы Эрлиха с анионными липосомами являются инкубационные среды с низким значением рН или присутствие фузогена ПЭГ-300. Также клетки АКЭ должны быть метаболически истощены долгим нахождением при пониженной температуре в анаэробных условиях, что меняет состав и структуру клеточной мембраны и повышает ее проницаемость. Использовались анионные липосомы, сформированные из пальмитоилолео-илфосфатидилхолина, аальмитоилолеоилфосфатидилсерина и холестерина (2:2:1). В флуоресцентномеченные липосомы встраивали фосфатидилэтаноламин, ковалентно связанный с флуоресцентными метками: нитробензоксадиазолом или родамином В. Двумя методами исследовали взаимодействие клеток АКЭ с анионными липосомами. Методом регистрации интенсивности флуоресценции при переносе энергии от фосфолипидного флуорофора-до-нора к фосфолипидному флуорофору — акцептору показано встраивание фосфолипидов в мембрану клеток АКЭ и соответственно слияние анионных липосом с клетками карциномы. С помощью конфокальной лазерной микроскопии зарегистрировали флуоресценцию на клеточной мембране и в цитоплазме приближенной к плазмалемме. Таким образом, в определенных условиях обнаруживаются меченые фосфолипиды в мембране и в цитоплазме, что указывает на слияние липосом с клетками АКЭ и захват клетками липо-сом посредством эндоцитоза.
Механизм функционирования Ni(Fe)-ARD Диоксигеназ в цикле синтеза и воспроизводства метионина, способствующего поддержанию нормального гомеостаза
Л. И. Матиенко', В. И. Бинюков', Е. М. Миль1, Л. А. Мосолова' Место работы: 'ФГБУН ИБХФ РАН e-mail: mila.matienko@yandex.ru
Цикл синтеза и воспроизводства метионина (MSP) играет важную роль в регуляции ряда важных метаболитов у прокариотов и эукариотов. Ациредуктон Диоксигеназы Ni (Fe) — ARD являются ферментами, участвующими в пути рециркуляции метионина. Метилтиоаденозин (MTA) — первый промежуточный продукт в этом пути, и формируется из S-аденозил метионина (SAM) в процессе синтеза полиаминов у животных и этилена в растениях.
МТА является ингибитором как синтеза полиаминов, так и реакций трансметилирования. Ингибирование синтеза полиаминов тормозит репликацию ДНК, а увеличение концентрации полиаминов может привести к развитию злокачественных новообразований.
Концентрация MTA в клетках жестко контролируется циклом MSP, и Ni (Fe) — ARD Диоксигеназы выполняют важнейшие функции в этом процессе. Фермент Fe-ARD катализирует
предпоследний шаг в метаболическом пути окислительного (молекулярный O2) разложения субстрата Ациредуктона (1,2-дигидрокси-3-кето-5- (метилтио) пент-1-ен) в формиат и кето-кислотный предшественник метионина 2-кето-4-(тиометил) бутират (KMTB).
Путь реакции окислительного превращения Ациредук-тона молекулярным кислородом, катализируемой Ni-ARD, не приводит к образованию метионина, но в результате этой реакции образуется CO, являющийся нейротрансмиттером. Можно было предположить направляющую роль водородных связей, как один из важных факторов в регулировании синтеза метионина при участии Ni (Fe) — ARD. Используя метод АСМ, мы впервые показали возможность самоорганизации комплексов никеля: Ni2 (AcO) 3 (acac) NMP^ (H2O) 2 (NMP=N-метил-2-пирролидон), {Ni (acac) 2xL2xL3} (L2=NMP, HMPA, MSt, L3=PhOH, Tyr (L-Tyrosine)), и железа FeIIIx (acac) y18C6m (H2O) n, (18C6=18-crown-6) — являющихся структурными и функциональными моделями Ni (или Fe) — ARD, в макроструктуры за счет межмолекулярных H-связей. Самоорганизация комплексов железа в структуры, напоминающие форму микро волокнистой трубочки тубулина (как, например, это происходит в случае FeIIIx (acac) y18C6m (H2O) n), может благоприятствовать реакциям, приводящим к образованию метионина.
Образование многомерных форм (в случае Ni-ARD) может быть одним из путей регулирования Ni (Fe) — ARD активности. Здесь мы обсуждаем возможную регуляторную функцию Tyr-фрагмента в механизме действия Ni-ARD, основываясь на экспериментальных данных (АСМ), которые мы получили впервые на модельных системах. Полученные данные могут приблизить нас к пониманию процессов, происходящих в механизме функционирования Ni (Fe) — ARD, участвующих в цикле MSP.
Редокс-зависимая регуляция активности каспазы-3 опухолевых клеток линии Jurkat
О.Л. Носарева', Е. А. Степовая', Е. В. Шахристова' Место работы:'Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Томск, Россия
e-mail: olnosareva@yandex.ru
Неуклонный рост заболеваемости гемобластозами в России обосновывает актуальность поиска эффективных способов лечения этого заболевания. Дизрегуляции апоптоза и пролиферации опухолевых клеток сопровождается нарушением редокс-статуса клеток. Важную роль в поддержании редокс-состояния клетки и активности метаболических процессов играют глутатион и ферменты глутатион-зависимой системы. Белки-ферменты, благодаря наличию SH-групп в строении, одними из первых подвергаются окислению и отвечают изменением конформацией активных центров. В связи с этим, большой интерес представляет поиск молекулярных механизмов редокс-зависимой регуляции клеточной гибели при участии компонентов системы глутатиона. Цель. Оценить активность каспазы-3 при действии блокатора (N-этилмалеимида (NEM) 5 мМ) и протектора (1,4-дитиоэри-тритола (DTE) 5 мМ) SH-групп протеинов и пептидов в опухолевых клетках линии Jurkat.
Материалы и методы. Объектом исследования служила опухолевая клеточная линия Jurkat («Т-лимфобластный лейкоз человека»). Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat
Злокачественные опухоли
www.malignanttumours.org
Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017
Malignant Tumours
www.malignanttumours.org
