CC BY
52
С. С. Бабкина, Е. Н. Моисеева, Н. А. Улахович ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК С АДРИБЛАСТИНОМ И ИОНАМИ КОБАЛЬТА (II) И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОАФФИННЫМИ МЕТОДАМИ, ОСНОВАННЫМИ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ДНК-СЕНСОРА
Изучено взаимодействие молекул иммобилизованной ДНК с противоопухолевым антибиотиком адрибластином и ионами Со(11) для разработки и оптимизации биоаффинных методов на основе амперометрического ДНК-сенсора. Разработанные методы анализа могут использоваться для определения данных эффекторов в различных объектах. Предложенные методы определения адрибластина и ионов Со(11) основаны на предварительном концентрировании на модифицированной ДНК нитроцеллюлозной мембране в составе амперометрического биосенсора, реактивации биосенсора и получении аналитических сигналов. Нижняя граница определяемых концентраций для адрибластина составила 1,0х1010 моль/л, для ионов Со(11) 2,0х10 8 моль/л. Определены константы аффинного связывания (Ксвяз) изученных комплексов с помощью вольтамперометрических и спектрофотометрических данных. Ксвяз для адрибластина составила (2,5±0,2)х106 л/моль, для ионов Со(11) (3,9±0,2)х104 л/моль. Предложенные методики отличаются высокой чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, достаточной экспрессностью.
ДНК играет ключевую роль в организме человека, так как является носителем генетической информации и участвует в важных процессах биосинтеза веществ в организме [1]. В последнее время уделяется большое внимание изучению взаимодействия низкомолекулярных веществ с нуклеиновыми кислотами с целью выяснения механизма такого взаимодействия, анализа изменений в структуре ДНК при повреждающем действии токсичных веществ, выяснения причины мутаций, происхождения некоторых заболеваний, в том числе и наследственных. Значение исследований действия тяжелых металлов на ДНК особенно возрастает в последние годы в связи с увеличением загрязнения ими окружающей среды, что ставит задачу определения и уточнения предельно допустимых норм содержания данных металлов в природных, биологических и пищевых объектах [2]. Вызывает интерес также изучение взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК, что является важным аспектом при рациональной разработке новых, более эффективных препаратов и новых методов их определения [3].
Методы анализа на основе ДНК позволяют предсказать и количественно оценить действие различных эффекторов, в том числе противоопухолевых препаратов и металлов, на структуру и функции ДНК. Использование электрохимических методов обеспечивает изучение, а также моделирование сложной биологической системы ДНК-эффектор без разделения компонентов с высокой чувствительностью и селективностью. Электрохимические биосенсоры (БС) на основе ДНК объединяют чувствительность метода детекции с высокой специфичностью биомолекул, уменьшают количество используемой ДНК и позволяют разрабатывать современные методы анализа экологических и биологических объектов [4, 5].
Методы определения, основанные на биологическом сродстве (биоаффинности) молекул, т. е. биоаффинные методы, нами уже разработаны для определения антител к ДНК, ряда тяжелых металлов и противоопухолевых препаратов на основе комплексов Р1 (II) [6-8].
Цель данного исследования заключалась в разработке биоаффинных методов анализа эффекторов ДНК - противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы на примере адрибластина и тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II) - с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК и получения количественных характеристик взаимодействия эффекторов с данной формой ДНК.
Экспериментальная часть
Вольтамперометрические измерения проводились с помощью вольтамперометрической системы SVA-1BM-01 «Аналитик» (Болгария). Рабочим электродом служил стационарный ртутнопленочный электрод (СРПЭ) с серебряной подложкой (<3=0,5 мм), либо разработанный БС, в котором мембрана с иммобилизованной денатурированной ДНК (д-ИДНК), либо с иммобилизованной ренатурированной ДНК (р-ИДНК) закрепляется на поверхности СРПЭ с серебряной подложкой [9]. Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод (нас.к.э.). Растворенный кислород удаляли из исследуемых растворов током аргона в течение 15 минут, во время регистрации вольт-амперограмм газ пропускали над раствором.
Электронные спектры поглощения были сняты на спектрофотометре и-2000 «HitacЫ» (Япония) в кюветах толщиной 1 см. Точность измерения оптической плотности составляла ±1%. Все измерения проводили при термостатировании 298±2 К.
Использовали ДНК эритроцитов цыплят фирмы «Reanal»: соотношение Ы/Р 1,6-1,7. Растворы ДНК с концентрацией 0,01 мг/мл в физиологическом растворе (0,9% раствор ЫаС1) готовили по точной навеске. Концентрацию растворов ДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при ^=258нм.
Применены следующие химические реагенты и растворы: нитрат целлюлозы (НЦ) ФТ-30 типа коллоксилин марки ч. со средним содержанием азота 11,5-12%; органические растворители высокой чистоты марки х.ч. (ацетон, толуол, гексан) и 25% раствор глутарового альдегида фирмы «Reanal»; ацетатный буферный раствор рН=5,0; 1 М раствор ЫаС1; раствор комплексона III с концентрацией 0,005 моль/л, приготовленный из стандартного фиксанала.
Исходный раствор сульфата Со(11) с концентрацией 1,010-3 моль/л готовили растворением соли Со(11) в тридистиллированной воде. Точную концентрацию раствора устанавливали методом комплексонометрии.
Исходный раствор с концентрацией 1,0' 10-4 моль/л готовили по точной навеске препарата «Адрибластин» фирмы «Parmacia&Upjohn» (Италия). Исследуемые растворы готовили по точной навеске и методом последовательных разбавлений.
Приготовление биочувствительной части амперометрического ДНК-содержащего биосенсора. Образцы д-ИДНК и р-ИДНК получали путем растворения навески НЦ в системе органических растворителей при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с последующим добавлением водного раствора денатурированной ДНК (д-ДНК) (денатурацию проводили кипячением раствора ДНК на водяной бане с последующим охлаждением) и раствора глутарового альдегида для химического связывания молекул д-ДНК и р-ДНК с НЦ матрицей. После этого на поверхности чашки Петри формировали пленку и высушивали ее в течение 5 минут. Полученные образцы ИДНК хранят в холодильнике при 1 = 2 - 50 С. Биочувствительную часть БС, полученную по данной методике, закрепляли на корпусе электрохимического детектора (СРПЭ) с помощью прижимных колец [9].
Методика определения адрибластина с помощью амперометрического ДНК-содержащего биосенсора. Для проведения биоаффинного мембранного концентрирования адриб-ластина амперометрический БС, содержащий р-ИДНК погружали в электрохимическую ячейку с
модельным раствором адрибластина различной известной концентрации при pH 5,0 на 15 мин. Затем раствор сливали, ячейку промывали и заливали в нее 5 мл 1 М NaCl, деаэрировали раствор током аргона в течение 20 мин и снимали вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0,02 В до -0,8 В (Е0= - 0,02 В, скорость наложения потенциала 0,5 В/с). Измеряли высоту катодного пика при потенциале - 0,25 В и по полученным данным строили градуировочный график, который использовали для определения неизвестной концентрации адрибластина.
Методика определения ионов Co(II) с помощью амперометрического ДНК-содержащего биосенсора. Для проведения биоаффинного мембранного концентрирования ионов Co(II) амперометрический БС на основе д-ИДНК погружали в электрохимическую ячейку с раствором соли Co(II) различной известной концентрации на 10 мин. Затем раствор сливали, ячейку промывали и заливали в нее 5 мл ацетатного буферного раствора pH 5,0 содержащего комплексон III с концентрацией 0,005 моль/л, деаэрировали раствор током аргона и снимали вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0,02 В до -1,85 В (Е0= - 0,02 В, скорость наложения потенциала 0,5 В/с). Измеряли высоту катодного пика при потенциале - 1,3 В и по полученным данным строили градуировочный график зависимости тока восстановления комплексоната Co(II) от концентрации ионов Co(II), который использовали для определения неизвестной концентрации ионов Co(II).
Методика определения константы аффинного связывания (Ксвяз) комплексов Со(11) - д-ИДНК и адрибластин - р-ИДНК. Ксвяз комплексов Co(II) - д-ИДНК и адрибластин - р-ИДНК определялись на основании данных спектрофотометрического метода. Для этого в случае комплексо-образования с Co(II) строили зависимость оптической плотности растворов комплексоната Co(II) от исходной концентрации металла-комплексообразователя (Co(II)). Для этого готовили серию растворов Co(SO4)2 (рН=2,7) с различной начальной концентрацией ионов Co(II) в диапазоне от 2,0х10-6 до 1,0х10"4 моль/л, опускали в каждый из них НЦ мембрану с д-ИДНК площадью 1 см2 на 10 мин. После проведения биоаффинного мембранного концентрирования была проведена реактивация д-ИДНК-содержащей мембраны раствором комплексона III с концентрацией 0,005 М. После удаления мембраны проводили измерение оптической плотности при длине волны ^=215 нм (D215). По полученным спектрофотометрическим данным строили градуировочный график зависимости оптической плотности (D215) растворов, содержащих комплексонат Co(II) от концентрации ионов Co(II), который использовали для обработки результатов.
Ксвяз комплекса адрибластин - р-ИДНК определялась аналогично, но аналитическим сигналом служила оптическая плотность при длине волны ^=232 нм (D232), соответствующая поглощению раствора адрибластина. Строили градуировочный график зависимости оптической плотности (D232) растворов адрибластина от их исходной концентрации.
Полученные градуировочные графики использовали для определения концентрации соответствующего комплекса и равновесной концентрации Co(II) либо адрибластина, которые использовали для построения графика Скетчарда [10].
Результаты и их обсуждение
Определение адрибластина с помощью амперометрического ДНК-содержащего
БС. В качестве эффектора ДНК был выбран препарат адрибластин (синоним доксорубици-на), широко применяемый в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей. Известно, что адрибластин является интеркалятором т.е., имея планарные ароматические кольца, его молекулы встраиваются между парами оснований двойной цепи ДНК раковых клеток, тем самым ингибируя синтез нуклеиновых кислот и останавливая рост опухоли. Кроме этого экспериментально доказано, что в организме ад-рибластин вызывает окислительное повреждение молекул ДНК раковых клеток вследствие генерации активных радикалов кислорода при участии ионов Fe(III) (которые содержатся в организме), выступающих в качестве агента-окислителя. Адрибластин имеет большое сродство к ионам Fe(III) и образует с ними комплекс, который в дальнейшем и вызывает
окислительное повреждение ДНК в биологической системе. Однако препарат обладает рядом побочных эффектов, среди которых наиболее часто отмечается его кардиотоксичность, что связано с селективным накоплением адрибластина в клеточных мембранах сердца (установлено большое сродство препарата к кардиомицину - главному компоненту митохондриальных мембран клеток сердца), вызывающим необратимые повреждения этого важнейшего органа человека. Кроме того, образующиеся под действием адрибластина свободные радикалы кислорода также пагубно влияют на сердечную деятельность [11, 12]. В связи с этим исследования по уточнению механизма действия данного онкопрепарата и определения малых его концентраций в биологических образцах с целью подбора индивидуальной дозы препарата при лечении являются актуальными.
При разработке биоаффинного метода определения адрибластина на основе ДНК-сенсора был учтен механизм его действия, как интеркалятора [13], а также его способность связываться с денатурированной однонитевой ДНК за счет электростатического взаимодействия [12-14]. Поэтому при приготовлении биочувствительной части БС на основе ИДНК после термической денатурации ДНК проводили медленное охлаждение. В результате при сохранении одинарных цепей образуются и фрагменты вторичных двойных цепей ДНК за счет восстановления водородных связей либо между двумя цепями, либо внутри одной спирали, т.е. происходит процесс частичной ренатурации. В данном случае образуется ренатурированная ДНК, или р-ДНК. Затем проводили ковалентную иммобилизацию данных форм биомолекулы в НЦ-матрице.
Таким образом ренатурацию проводили для того, чтобы взаимодействие онкопрепарата с ДНК протекало наиболее эффективно, что возможно при реализации обоих механизмов комплексообразования адрибластин-ДНК. Это и делает целесообразным иммобилизовать ДНК одновременно и в одно- и в двунитевой форме. Следует отметить, что ковалентная иммобилизация позволяет фиксировать обе формы молекулы ДНК на матрице, обеспечивая наибольшую доступность центров связывания ДНК для молекул эффектора.
Нами было изучено комплексообразование адрибластина с молекулами ИДНК для оценки сродства эффектора именно к данной форме ДНК, а также для оптимизации разработанного аналитического метода.
Для исключения неспецифического связывания адрибластина матрицей-носителем ДНК в процессе концентрирования была приготовлена НЦ мембрана без ДНК. Далее были проведены все операции, описанные выше, при этом появления аналитического сигнала не наблюдалось.
Для сокращения времени анализа было выбрано оптимальное время концентрирования адрибластина на мембране с р-ИДНК по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени концентрирования (мин), которое составило 15 мин. Оптимальное время реактивации мембраны выбиралось по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени реактивации (мин) - 20 мин.
Градуировочный график для определения адрибластина строили по методике, описанной выше. Уравнение градуировочного графика зависимости логарифма тока пика (мкА) от логарифма концентрации адрибластина (моль/л) имеет следующий вид:
lg/п = (0,365±0,003)lgc + (1,06±0,02), r = 0,9997.
Полученный градуировочный график использовали для определения неизвестной концентрации препарата. Результаты определения действующего вещества в препарате «Адрибластин» фирмы «Parmacia&Upjohn» (Италия) биоаффинным методом на основе амперометрического ДНК-содержащего биосенсора представлены в таблице 1. Линейная область
Таблица 1 - Результаты определения действующего вещества в препарате «Адрибла-стин» фирмы «Parmacia&Upjohn» (Италия) биоаффинным методом на основе амперометрического ДНК-содержащего биосенсора (п=5, Р=0,95)
Введено, с х10 , моль/л Найдено, (с ± 5) х106, моль/л вг
0,0001 0,00015 ± 0,00002 0,03
0,005 0,0048 ± 0,0001 0,05
0,01 0,013 ± 0,002 0,04
0,50 0,49 ± 0,03 0,02
1,00 1,01 ± 0,04 0,01
определяемых концентраций адрибластина в модельных растворах с помощью БС на осно-
5 10
ве р-ИДНК составляет 1,0х10" - 1,0х10" моль/л. Нижняя граница определяемых содер-
10
жаний (сн) составляет 1,0х10" моль/л.
Для количественной характеристки специфичности комплексообразования провели определение константы аффинного связывания адрибластина с иммобилизованными формами ДНК на основании полученных спектрофотометрических данных методом Скетчарда [10] в координатах: [Сднк-АдР]/[САдР] — [САдР], где [Сднк-адр] - равновесная концентрация комплекса ИДНК-адрибластин, [СадР] - равновесная концентрация адрибластина. Значение Ксвяз составило (2,5±0,2)х10 л/моль. Полученное значение выше литературных данных для комплек-сообразования препарата с нативной иммобилизованной ДНК (9±4)х10 л/моль [15], что, по-видимому, еще раз подтверждает большую способность к комплексообразованию с выбранной формой р-ДНК и свидетельствует о перспективности определения противоопухолевых препаратов этого класса с помощью р-ИДНК-содержащего БС.
Чувствительность разработанного биоаффинного метода отражает высокое сродство адрибластина к р-ИДНК, подтвержденное высоким значением константы аффинного связывания образующегося комплекса.
Определение ионов Оо(П) с помощью амперометрического БС на основе д-ИДНК. Известно, что роль кобальта в организме неоднозначна. С одной стороны, он является необходимым элементом и входит в состав различных биомолекул, в частности витамина В12 и кофермента В12. С другой стороны возможно отравление разовыми дозами (выбросы на производстве) или при длительном воздействии (при использовании протезов на основе сплавов, содержащих кобальт, в ортопедии) [16]. Учитывая, таким образом, необходимость контроля за содержанием данных ионов, нами были выбраны ионы Со(11) в качестве эффектора ДНК, так как кобальт признан генотоксичным металлом Международным агентством по исследованию раковых заболеваний (ТАКС). Прочно связываясь с ДНК кобальт вызывает конформационные и структурные изменения ее молекул вплоть до денатурации и фрагментирования [17]. Поэтому представляет интерес изучение взаимодействия ионов Со(11) именно с денатурированной ИДНК для уточнения и моделирования механиз-
ма этого процесса в организме и для определения данного металла. В литературе отсутствуют данные об устойчивости комплексов с иммобилизованной ДНК, хотя иммобилизация ДНК в составе БС повышает ее устойчивость к различным воздействиям, обеспечивает многократное использование дорогостоящего препарата и может позволить разработать методы определения токсичных металлов в биологических средах и объектах экологоаналитического контроля.
При анализе ионов Со(11) на стадии приготовления биочувствительной части сенсора после термической денатурации было проведено резкое охлаждение раствора для иммобилизации именно однонитевой д-ДНК в НЦ матрице. В результате, в случае д-ИДНК мы имеем наиболее раскрученные и фиксированные на матрице биомолекулы с доступными центрами связывания (азотистыми основаниями ДНК) для ионов металла.
Для исключения неспецифического связывания ионов Со(11) матрицей-носителем ДНК была приготовлена НЦ мембрана без ДНК, были проведены все операции, описанные выше, при этом появления аналитического сигнала комплексоната Со(11) не наблюдалось.
Проводился выбор оптимального рН для эффективного проведения анализа. Выбор рН определялся следующими условиями: 1) при накоплении была выбрана кислая среда рН=2,7, так как в ней стабилизируется ион Со(11) (в щелочной среде он легко окисляется до иона Со(111) либо протекает процесс гидролиза), что облегчает взаимодействие негидролизованной формы Со(11) с д-ИДНК вследствие большего заряда и меньшего размера частиц; ДНК при данном рН сохраняет биологическую активность [1]; 2) реактивацию биосенсора при комплексообразовании Со(11) - комплексон III проводили при рН=5,0, так как данный комплекс устойчив и в более щелочной среде в отличие от иона Со(11) [18].
Для сокращения времени анализа было выбрано оптимальное время концентрирования ионов Со(11) на мембране с д-ИДНК по выходу на предел зависимости тока пика комплексоната Со(11) (мкА) от времени концентрирования (мин), которое составило 10 мин. Оптимальное время реактивации мембраны выбиралось по выходу на предел зависимости тока пика комплексоната Со(11) (мкА) от времени реактивации (мин) - 15 мин
Градуировочный график для определения иона Со(11) с помощью биосенсора строили по методике, описанной выше. Уравнение градуировочного графика зависимости логарифма тока пика комплексоната Со(11) (мкА) от логарифма концентрации комплексоната Со(11) (моль/л) имеет следующий вид:
1д/п = (0,262±0,002)!дс + (1,95±0,02), г = 0,9998.
Полученный градуировочный график использовали для определения неизвестной концентрации ионов Со(11) в модельных растворах. Линейная область определяемых концентраций ионов Со(11) в модельных растворах с помощью БС на основе д-ИДНК составляет
5 8
1,0х10" - 2,0х10- моль/л. Нижняя граница определяемых содержаний (сн) составляет 2,0х10-8 моль/л. Результаты определения ионов Со(11) с помощью амперометрического ДНК-содержащего биосенсора в модельных растворах представлены в таблице 2.
Определение константы аффинного связывания ионов Со(11) с д-ИДНК проводилось на основании спектрофотометрических данных методом Скетчарда [10] в координатах: [Сднк-Со]/[Ссо] - [Ссо], где [Сднк-Со] - равновесная концентрация комплекса, [Ссо] -равновесная концентрация ионов Со(11). Методика определения описана в разделе «Экспериментальная часть». Ксвяз составила (3,9±0,2)х104 л/моль, что говорит о высоком сродстве ионов Со(11) к выбранной форме ДНК и еще раз доказывает потенциальную генотоксич-ность данного металла.
Таблица 2 - Результаты определения ионов Со(11) в модельных растворах биоаффинным методом на основе амперометрического ДНК-содержащего биосенсора (п = 5; Р = 0,95)
Введено, с х105, моль/л Найдено, (с ± 5) х105, моль/л Sr
0,001 0,0012 ± 0,0002 0,03
0,01 0,017 ± 0,001 0,08
0,05 0,046 ± 0,003 0,06
0,1 0,097 ± 0,04 0,05
0,50 0,49 ± 0,01 0,02
Было также показано, что различные формы ДНК после иммобилизации являются биологически активными и сохраняют свою активность не менее 30 дней. В течение всего этого времени отсутствует вымываемость д-ДНК и р-ДНК из НЦ мембраны. Равенство аналитических сигналов, полученных при использовании различных участков мембраны с различными формами иммобилизованной ДНК равной площади, свидетельствует об однородности биочувствительной части сенсора по составу. Следует сказать, что при необходимости можно легко заменить мембрану после проведения анализа на новую.
Таким образом, использование иммобилизованной ДНК в составе амперометрического биосенсора позволило на основании полученных вольтамперометрических и спектрофотометрических данных разработать биоаффинные методы определения эффекторов ДНК различной природы (адрибластин и ионы Со(11)), а также получить количественную оценку процесса комплексообразования. Предложенные методики отличается высокой чувствительностью, хорошей воспроизводимостью и достаточной экспрессностью, что является подтверждением того, что биоаффинный метод на основе амперометрического ДНК-биосенсора может применяться на практике наряду со стандартными методами, находящимися в арсенале современной аналитической химии.
Литература
1. В.Зенгер. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.:Мир, 1987. 584 с.
2. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов/ Под ред. Х. Зигель, А. Зигель. М.: Мир, 1993. С. 222-227.
3. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction/ S. Rauf, J.J. Gooding, K. Ahtar// J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2005. V. 37. №. 2. P. 205-217.
4. Disposable DNA electrochemical biosensors for environmental monitoring/ G.Marrazza, I. Chianella, MMascini// Anal.Chim.Acta. 1999. V.387. P.297-307.
5. Electrochemical nucleic acid biosensor/ Anal. Chim. Acta. 2002. V. 469. № 1. P. 63-71.
6. Amperometric DNA biosensor for the determination of autoantibodies using DNA interaction with Pt (II) complex/ S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich, Yu.I. Zyavkina// Anal. Chim. Acta. 2004. V. 501. № 1. P. 23-30.
7. Электрохимические сенсоры на основе стационарных электродов и иммобилизованной ДНК либо ее фрагментов и оценка их аналитических возможностей/ Бабкина С.С., Палечек Э., Йелен Ф., Фойта М.// Журн. анал. химии. 2005. Т. 60. №6. С. 639-645.
8. S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich. The study of complexing of heavy metals with DNA and new bioaffinity method of their determination based on amperometric DNA-based biosensor// Anal. Chem. 2005. V.77. №17. P. 5678-5685.
9. Budnikov H.C., Medyantseva E.P., Babkina S.,S. An enzyme amperometric sensor for toxicant determination// J.Electroanal.Chem. 1991. V.310. P.49-55.
10. Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: ФАИР-Пресс, 1999. 720 с.
11. Formation of adriamycin-DNA adducts in vitro/ C. Cullinane, S. Cutts, A. Rosmalen, D. Phillips// Nucl. acids res. 1994. V.22. №12. P. 2296-2303.
12. Electrochemical sensing of DNA-adriamycin interactions/ J.A.P. Piedade, I.R. Fernandes, A.M. Oliveira-Brett// Bioelectrochemistry. 2002. V. 56. №1. P. 81-83.
13. Electrochemical properties of DNA-intercalating doxorubicin and methylene blue on n-hexadecyl mercaptan-doped 5'-thiol-labeled DNA-modified gold electrodes/ H.C.M. Yau, H. L. Chan, M. Yang// Biosens. and bioelectron. 2003. V. 18. №7. P. 873-879.
14. Electrochemical detection of in situ adriamycin oxidative damage to DNA/ A.M. Oliveira-Brett, M. Vivan, J.A.P. Piedade, I.R. Fernandes//Talanta. 2002. V. 56. №5. P. 959-970.
15. An optical DNA-based biosensor for the analysis of bioactive constituents with application in drug and herbal drug screening/ M. Minunni, S. Tombelli, A.R. Bilia, M.Mascini// Talanta. 2005. V.65. №2. P. 578-585.
16. Руководство по медицине. Диагностика и терапия/ Под ред. Р. Беркоу, Э. Флетчера. М.: Мир, 1997. С. 771-878.
17. Determination of trace cobalt concentrations in human serum by adsorptive stripping voltammetry/ P. Kajic, I. Milosev, B. Pihlar, V. Pisot// J. of Trace elements in Medicine and Biology. 2003. V. 17. №3. Р.153-158.
18. Н.М.Дятлова, В.Я.Темкина, И.Д.Колпакова. Комплексоны. М.: Химия, 1970. 416 с.
© С. С. Бабкина - д-р хим. наук, проф. каф. неорганической химии КГУ; Е. Н. Моисеева -асп. той же кафедры; Н. А. Улахович - д-р хим. наук, проф. каф. неорганической химии КГУ.
