CC BY
32ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2000, том 42, № 5, с. 833-839
БИОЛОГИЧЕСКИЕ
_ПОЛИМЕРЫ
УДК 541.64.547.96
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ С БЕЛКАМИ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ
© 2000 г. И. Ю. Ряднова*, Л. К. Шатаева*, В. X. Хавинсон**
* Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31
** Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3
Поступила в редакцию 22.04.99 г.
Принята в печать 14.09.99 г.
Методами спектроскопии, гель-хроматографии и мембранной диффузии изучены физико-химические особенности образования интерполимерных комплексов ДНК с инсулином, кортексином, цито-хромом С в нейтральной области рН. Выбранные белки различаются кислотно-основными свойствами и не являются природными лигандами ДНК. Комплексы ДНК с изученными белками сохраняют устойчивость при увеличении ионной силы раствора до 0.5 моль/л. Изотермы связывания ДНК с белками при ионной силе раствора 0.3 моль/л и рН 7.8-8.2 носят кооперативный характер. Характеристическая вязкость ДНК в присутствии белков уменьшается симбатно с количеством связанного белка.
Нуклеиновые кислоты - природные высокомолекулярные жесткоцепные полиэлектролиты, способные к разнообразным межмолекулярным взаимодействиям. Однако большие ММ (К^-Ю8) и высокая вязкость затрудняют изучение физико-химических особенностей таких взаимодействий в растворах.
Известно, что межмолекулярные реакции белков и нуклеиновых кислот осуществляются на всех этапах репликации и экспресии ДНК, а также в ходе процессов эндогенной регуляции. Тем не менее представления о физико-химическом механизме таких взаимодействий остаются неполными. В работах школы академика В.А. Кабанова широко исследованы не только физико-химические особенности связывания ДНК с синтетическими полиэлектролитами [1, 2], но и определены перспективы использования соответствующих комплексов для доставки генетического материала в клетку [3,4]. Одновременно исследованы особенности образования интерполимерных комплексов белковых макромолекул с синтетическими или природными полимерами, несущими сульфо- и карбоксильные группы [5-7]. Однако закономерности связывания нуклеиновых кислот с белками и стабильность нуклеопро-
теиновых комплексов (НПК) не были достаточно изучены.
НПК играют важную роль в регуляции функций организма - белковые молекулы с разными кислотно-основными свойствами входят в состав хроматина эукариотической клетки [8]. Как известно, хроматин (вещество хромосом) содержит 50% ДНК и 50% белковых компонентов. Нормальное соотношение между делящимися и покоящимися клетками - митотическое равновесие в постоянно функционирующих органах и тканях поддерживается с помощью специфических белков, выполняющих регуляторные функции (ядерных белков-регуляторов), связанных с ДНК [9]. Поэтому исследование особенностей комлексо-образования ДНК и белков представляет большой практический интерес для создания новых пролонгированных форм лекарственных препаратов, направленно корректирующих функциональную активность организма на молекулярном уровне.
В настоящей работе исследованы процессы комплексообразования глобулярных белков: инсулина, кортексина и цитохрома С с ДНК. Целью экспериментов являлось установление количественных закономерностей связывания этих компо-
нентов в растворе, исследование устойчивости полученных комплексов и определение изменения конформации ДНК при взаимодействии с белками.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали натриевую соль ДНК из селезенки крупного рогатого скота производства НПО "Биохимреактив" Олайнского завода химреактивов, инсулин бычий, кортексин, цито-хром С производства завода медпрепаратов АО "Самсон" (Санкт-Петербург). Кортексин представляет собой препарат, выделенный из мозга крупного рогатого скота, содержащий линейные пептиды. В их состав входят нейропептид Y и ней-рокинины А и В, которые содержат гомологические участки (Асп-Сер-Фен-Вал-Гли-Лей-Мет). Эти пептиды проявляют нейротрофическую активность и их ММ не превышают 1 х 104 [10].
Приготовление раствора ДНК заданной концентрации начинали с замачивания навески в небольшом объеме дистиллированной воды на холоду. Набухание и сольватация нативной ДНК длилось 16-20 ч, затем набухшую ДНК растворяли в фосфатном буфере рН 7.8-8.0 с добавлением хлористого натрия до ионной силы 0.3 моль/л. Концентрация ДНК в рабочих растворах не превышала 1.0 мг/см3. Нативность ДНК определяли по наличию значительного гиперхромного эффекта после кипячения раствора ДНК с последующим немедленным охлаждением на льду [11]. Концентрацию ДНК контролировали по оптической плотности при длине волны 260 нм, концентрацию белков находили по методу Лоури (калибровка по сывороточному альбумину). Концентрацию цитохрома С рассчитывали из калибровочной прямой по оптической плотности растворов при длине волны 410 нм. Калибровку выполняли по препарату цитохрома С фирмы "Serva".
В данной работе изучали комплексообразова-ние нативной ДНК с инсулином (изоэлектричес-кая точка р/ 5.4), кортексином (р/ 9.5) и цитохро-мом С (р/ 10.6) [12], при этом ДНК рассматривали как природный полиэлектролит, обладающий функциональными одноосновными фосфатными группами и заряженными группами нуклеотидов [13]. На основании данных об аминокислотном составе и константах диссоциации белков [14-16] рассчитывали сумму положительных и отрицательных зарядов молекулы белка. При выбранном значении рН заряды молекул таковы: инсулин - 2~ (4+; 6~), цитохром С - 4+ (24+; 20~), кортексин 2+ (6+; 4"). Таким образом, выбранное значение рН 7.8-8.3 для кортексина и цитохрома
С определяет избыток положительных зарядов, тогда как для инсулина при этом значении рН молекула несет избыточный отрицательный заряд.
Комплексообразование проводили смешением растворов ДНК и белков в том же буферном растворе и последующей инкубацией в холодильнике при +4°С в течение 16-20 ч. УФ-спектры растворов ДНК, инсулина, кортексина, цитохрома С и их смесей получали на спектрофотометре СФ-26. Устойчивость комплексов ДНК с белками исследовали методом ГПХ на Сефадексе G-200 Superfine при различной ионной силе раствора (колонка 2.0 х 60 см). На колонку наносили комплекс в 1 мл раствора и проводили элюирование фосфатным буфером рН 8.0 с добавлением NaCl до ионной силы 0.1, 0.3, 0.5 моль/л. Содержание белка по пикам хроматограмм определяли методом Лоури.
Связывание белков с ДНК исследовали методом мембранного диализа [17]. Кинетику диффузии белков через пористые мембраны измеряли в двухкамерной ячейке с объемом камер 50 см3 и окошком диаметром 2.65 см. Для диализа использовали сложенные вдвое трековые мембраны на основе лавсана толщиной 10 мкм, с диаметром пор 0.46 мкм. Выбранная пористость обеспечивает беспрепятственное прохождение свободного белка, тогда как ДНК и ее комплексы полностью задерживаются. В контрольных экспериментах измеряли проницаемость белка в отсутствие ДНК. В ресурсную камеру помещали растворы белков, в приемную камеру - буферный раствор. Диффузию наблюдали по увеличению концентрации белка в приемной камере, отбирая пробы через фиксированные промежутки времени и определяя оптическую плотность раствора. Коэффициент проницаемости Р (см2/с) белка через мембраны определяли по увеличению оптической плотности раствора в приемной камере при длине волн 260 и 280 нм по формуле [18]
7СО2/С0
где с, - концентрация белка в приемной камере в момент и мг/см3; г - время, с; V- объем камеры, см3; О - диаметр окошка, <ж,Ь- толщина мембраны, см; с0 - начальная концентрация белка в ресурсной камере, мг/см3.
В той же ячейке проводили аналогичный эксперимент, помещая в ресурсную камеру инкубированную систему белок-ДНК. Измеряли диффузию свободного белка из ресурсной камеры и по эффективной проницаемости Р рассчитывали концентрацию свободного белка, который нахо-
дится в равновесии с комплексом. Концентрацию белка (мг/см3), связанного в комплекс, вычисляли по уравнению
ск ~ с0~ ср'
где с0 - исходная концентрация белка при проведении комплексообразования, мг/см3; ср - равновесная концентрация свободного белка, не связанного в комплекс, мг/см3.
Определение характеристической вязкости проводили методом последовательных разведений растворов, используя вискозиметр Оствальда с капилляром 0.73 мм при 20°С. Экстраполяцией зависимости приведенной вязкости от концентрации вещества определяли характеристическую вязкость для свободной ДНК и ее комплексов с инсулином и цитохромом С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены УФ-спектры растворов ДНК, инсулина и их смеси, а также расчитан-ный по аддитивной схеме спектр смеси. Появление гиперхромного эффекта в случае смешивания ДНК и белков (кривая 4) свидетельствует об изменении конформации ДНК в результате образования интерполимерного комплекса нуклеиновой кислоты с белком. Для смесей ДНК с кортексином и цитохромом С получены аналогичные данные. Известно, что комплексообразование между макромолекулами полиэлектролитов осуществляется за счет ионных связей, гидрофобных или ион-ди-польных взаимодействий [5]. В системах с участием ДНК - это взаимодействия фосфатных групп и аминогрупп оснований в составе двойной спирали с кислыми и основными боковыми группами аминокислотных звеньев белка [13]. Образование комплексов ДНК-кортексин, ДНК-инсулин и ДНК-цитохром С за счет полярных взаимодействий полиамфолитных макромолекул представляется вполне закономерным.
Чтобы определить характер межмолекулярных взаимодействий при образовании комплекса ДНК-инсулин, методом гель-хроматографии исследовали устойчивость комплекса в растворах с различной ионной силой. Соответствующие гель-хроматограммы представлены на рис. 2. Видно, что во всем диапазоне ионной силы белковый компонент (инсулин) проявляется в виде интенсивного пика слева на хроматограммах вместе с высокомолекулярной ДНК. При этом концентрация белка одинакова во всех экспериментах независимо от ионной силы раствора. ИнаГче говоря, добавление низкомолекулярного электролита не приводит к диссоциации комплекса ДНК-инсулин. По-види-
. Е
X, им
Рис. 1. УФ-спектры ДНК (Г), инсулина (2), спектр смеси, рассчитанный по аддитивности (5), комплекса ДНК с инсулином (4). Е- оптическая плотность растворов.
мому, взаимодействие ДНК и этого белка осуществляется не только за счет электростатического притяжения, но главным образом за счет других типов межмолекулярных взаимодействий. Возможно, к ним относится взаимодействие полипептидной цепи белка с двойной спиралью ДНК, при котором Р-слой встраивается в "минорный" желобок спирали нуклеиновой кислоты, со стороны О2 атома пиримидина и 1Ч3 атома пурина [13].
Учитывая тот факт, что комплексообразование происходит между полиэлектролитом с М ~ ~ 1.9 х 105 (ДНК) и белком с ММ на 2 порядка меньшей, определяли мольное соотношение компонентов в комплексе. Для этого исследовали комплексообразование ДНК с инсулином, кортексином и цитохромом С в различных соотношениях (по массе) методом мембранного диализа. На рис. 3 показана кинетика диффузии свободного (не связанного с ДНК) инсулина и цитохрома С через трековые мембраны. Аналогичные зависимости были получены и для системы ДНК-кортек-син. По уравнениям (1) и (2) рассчитывали концентрации свободного и связанного в комплекс белка в ресурсной камере. При расчете коэффициента проницаемости по методу [18] рассматривали только начальные прямолинейные участки полученных кривых. Видно, что при варьировании соотношения компонентов в системе ДНК-белок, меняется концентрация свободного белка в ре-
Е (а) с, мг/см3
Рис 2. Гель-хроматограммы растворов комплекса ДНК-инсулин при ионной силе 0.1 (а), 0.3 (б) и 0.5 моль/л (в). V- относительный объем выхода (отношение объема выхода пробы к объему удерживания); Е- оптическая плотность растворов при длине волны 260 нм, с - концентрация белка.
сурсной камере, что связано с разной степенью ассоциации белка с ДНК. Полученные данные позволяют построить изотермы связывания ДНК с исследованными белками. Отношение количе-
0„ мг
Время/х 10-3, с
Рис. 3. Диффузия <2, свободного инсулина из раствора белка и из раствора комплекса через трековые мембраны: а - инсулин (1), ДНК : инсулин в соотношении 1 : 3 (2), 1 : 7 (3), 1 : 16 (4); б - цитохром С (1), ДНК : цитохром С в соотношении 1 : 3 (2), 1 :6 (3), 1 : 16 (4).
ства связанного белка к количеству ДНК - степень связывания т. Изотермы связывания для изучаемых систем представлены на рис. 4. Процесс комплексообразования для всех случаев описывается кооперативной изотермой. При взаимодействии ДНК с цитохромом С происходит резкое возрастание степени связывания после достижения концентрации свободного белка в растворе, равной 0.5 мг/см3, тогда как при связывании инсулина линейный участок изотермы наблюдается до концентрации белка 3.5 мг/см3.
В таблице приведены полученные характеристики для начального участка изотермы связывания. Массовое соотношение ДНК-белок в комплексах было пересчитано на число нуклеотидных
ср, мг/см3
Рис. 4. Изотермы связывания инсулина (7), ци-тохрома С (2) и кортексина (5) с ДНК. т - степень связывания, ср - равновесная концентрация свободного белка.
п
Рис 5. Зависимость характеристической вязкости [Т|] нуклеопротеиновых комплексов ДНК-инсулин (1) и ДНК-цитохром С (2) от количества звеньев ДНК и, приходящихся на одну молекулу белка; характеристическая вязкость свободной ДНК отмечена на ординате как [т|]0.
звеньев, приходящихся на 1 молекулу связанного белка. В условиях эксперимента (ионная сила 0.3 моль/л, рН 8.0) инсулин находится в растворе в виде димера, что было нами подтверждено при гель-хроматографическом исследовании чистого инсулина. Для оценки селективности комплексо-образования пользовались величиной коэффициента связывания к:
* - (Р)
Из таблицы видно, что коэффициент связывания ДНК с белками, не обладающими специфичностью связывания с нуклеиновыми кислотами, намного ниже, чем у кортексина, который содержит нейрогормоны, обладающие селективностью по отношению к ДНК. По данным таблицы, селективное взаимодействие кортексина с ДНК соответствует меньшему количеству нуклеотид-ных звеньев, приходящихся на одну молекулу белка на начальном этапе связывания.
Исследуемые вещества являются макромолекулами и большое значение в процессах их взаимодействия имеют стерические факторы и кон-формационные изменения, происходящие при комплексообразовании. Из литературы известно, что изменение структуры молекулы ДНК в растворе сопровождается увеличением оптической анизотропии {19] и уменьшением характеристической вязкости [20].
На рис. 5 приведена зависимость характеристической вязкости ДЙК от количества звеньев нуклеиновой кислоты, которые связывают одну
молекулу белка, т.е. плотности заполнения ДНК молекулами белка. Так, инсулин является кислым глобулярным белком и в случае комплекса ДНК-инсулин (кривая 1). При увеличении массового соотношения ДНК-белок от 1: 3 до 1:16 уменьшается количество звеньев ДНК, связывающих молекулу белка, и характеристическая вязкость снижается от 1.90 ± 0.15 см3/мг до 1.40 ± 0.15 см3/мг, тогда как у нативной ДНК характеристическая вязкость равна 2.0 ±0.15 см3/мг. Это показывает, что связывание ДНК с глобулярными белками определяется не только электростатическим взаимодействием положительных зарядов белка, но и дополнительными взаимодействиями. В частности, можно предполагать укладку а- и р-участков белка в "минорный" желобок спирали ДНК за счет образования связей между отрицательными зарядами белковой молекулы и положительными зарядами нуклеотидной цепи.
Основные характеристики интерполимерных комплексов ДНК с белками
Белок М х 10-4 Коэффициент связывания к п*
Инсулин 1.2 0.6 ±0.1 37
Кортексин 1.0 5.3 ±0.1 7.5
Цитохром С 1.3 2.2 ±0.1 37
♦Количество звеньев ДНК, приходящееся на одну молекулу белка в комплексе.
Известно, что при взаимодействии ДНК с щелочными белками класса гистонов, происходит компактизация линейной макромолекулы [21]. Цитохром С является белком, который близок по кислотно-щелочным свойствам к гистонам, а также по избытку положительных зарядов его свойства близки к свойствам протаминов. В случае нуклеопротеинового ДНК-цитохром С (кривая 2) уже для весового соотношения 1: 3 характеристическая вязкость снижается до 1.5 ± 0.15 см3/мг и затем до 1.4 ± 0.15 см3/мг при соотношении 1 : 16.
Из этих данных можно сделать вывод, что процесс компактизации ДНК при взаимодействии с белками, различающимися кислотно-основными и физиологическими свойствами, идет по-разно-му. Изменения характеристической вязкости свидетельствуют о том, что при взаимодействии ДНК с инсулином происходит постепенное уплотнение структуры ДНК, затем образование конфигурации "ожерелье" и последующая суперспира-лизация комплекса, как это было показано для взаимодействия ДНК с гистонами [20]. Такая компактизация объясняет отсутствие диссоциации комплекса ДНК-инсулин при увеличении ионной силы. При связывании ДНК с цитохромом С, процесс компактизации протекает намного быстрее. При наличии белка происходит практически полное его связывание с образованием нелинейных структур типа "ожерелье", дальнейшее увеличение количества белка также ведет к суперспирализации молекулы ДНК. При этом предел компактизации интерполимерного комплекса нуклеиновой кислоты с белком примерно одинаков при насыщении белками независимо от их физических свойств.
Таким образом, комплексообразование ДНК с инсулином, кортексином, цитохромом С определяется кислотно-основными свойствами белков, соотношением компонентов в комплексе, а также специфичностью взаимодействия макромолекул и соответствующим изменением конформа-ции ДНК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кабанов В.А., Жирякова М.В., Каргов С.И., Зе-зинА.Б., Изумрудов В.А. // Докл. РАН. 1993. Т. 332. № 6. С. 722.
2. Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1994. Т. 36. №2. С. 183.
3. Kabanov A.V., Astafyeva I.V., Chikindas M.L., Rosenb-lat G.F., Kiselev V.l., Severin ES., Kabanov V.A. // Biopolymers. 1991. V. 31. P. 1437.
4. Kabanov A.V., Kabanov VA. // Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 7.
5. Харенко О.В., Изумрудов В.А., Харенко A.B., Ка-саикин В.А., Зезин A.B., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. № 1. С. 218.
6. Гликина М.В., Кузнецова Н.П., Болотина И.Н., Самсонов Г.В. // Молек.биология. 1970. Т. 4. № 5. С. 692.
7. Стеценко Д.А., Лубяко E.H., Попанов В.К., Ажи-кина ТЛ., Свердлов Е.Д. //Докл. РАН. 1995. Т. 343. № 6. С. 834.
8. Воробьев В.И. // Сб. науч. тр. "Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии". Д.: Наука, 1986. С. 18.
9. Bullough WS. II Biol. Revue. 1975. V. 50. P. 99.
10. Хавинсон B.X., Морозов В.Г., Чалисова H.И., Окулов В.Б. // Цитология. 1997. Т. 39. № 7. С. 571.
11. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1976.
12. Zeng X., Rucken Е. //J. Membrane Sei. 1998. V. 148. P. 195.
13. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1987.
14. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. М.: Мир, 1980.
15. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Oxford.: Oxford Univ. Press, 1997. P. 447.
16. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон B.X. Цито-медины. СПб: Наука, 1998.
17. Тищенко Г.А, Мчедлишвили Б.В., Грушка Э., Ты-рачкова В., Попович A.M., Шашков Б.В., Шатае-ваЛ.К. И Докл АН СССР. 1989. Т. 308. № 3. С. 655.
18. Crank J. The Mathematics of Diffusion. Oxford.: Clare-don Press, 1975. P. 51.
19. Касьяненко H.A., Назарова O.B., Панарин Е.Ф. // Сб. докл. II Междунар. конф. "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехно-логии". СПб., 1998. С. 35.
20. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Иозеп A.A. II Журн. прикл. химии. 1997. Т. 70. № 6. С. 1040.
21. Киселева О.И., Пышкина O.A., Кумазава Н., Сергеев В.Г., Яминский И.В. II Сб. докл. II Междунар. конф. "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии". СПб, 1998. С. 104.
DNA-Protein Interaction Studied in Model Systems
I. Yu. Rvadnova*, L. K. Shataeva*, and V. Kh. Khavinson**
*Institute of Macromolecular Compounds, Russian Academy of Sciences, Bol'shoi pr. 31, St. Petersburg, 199004 Russia
**Institute of Bioregulation and Gerontology, pr. Dinamo 3, St. Petersburg, 197110 Russia
Abstract—Physicochemical conditions for the formation of interpolymer complexes of DNA with insulin, cor-texin, and cytochrome С in the neutral pH range were studied by UV spectroscopy, gel-permeation chromatography, and membrane diffusion techniques. The selected proteins differ by their acid-base properties and do not belong to natural DNA ligands. The DNA-protein complexes remained stable when the ionic strength of solution was increased up to 0.5 шо1Д. The isotherms of DNA binding to proteins in solutions with an ionic strength of 0.3 mol/1 and pH 7.8-8.2 exhibit a cooperative character. The intrinsic viscosity of DNA in the presence of proteins studied decreases proportionally to the amount of bound protein.
