CC BY
14© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-02-08
ВЗАИМНОЕ СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ мРНК ANG И VEGF ПРИ ПРОГРЕССИРУЮЩЕМ АНГИОГЕНЕЗЕ ВЕНОЗНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ КРЫС WISTAR В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИРРОЗЕ
Е.И. Лебедева1, А.Т. Щастный1, А.С. Бабенко2
'Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Республика Беларусь, 210009, Витебск, пр-т Фрунзе, 27; 2Белорусский государственный медицинский университет, Республика Беларусь, 220116, Минск, пр. Дзержинского, 83, корп. '5
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Лебедева Елена Ивановна — доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет. Доцент, кандидат биологических наук. Тел.: +375 (33) 675-76-99. E-mail: lebedeva. ya-elenale2013@yandex.ru ORCID: 0000-0003-1309-4248
Щастный Анатолий Тадеушевич — ректор, заведующий кафедрой хирургии ФПК и ПК Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет. Профессор, доктор медицинских наук. Тел.: +375 (212) 60-13-95. E-mail: admin@ vsmu.by ORCID: 0000-0003-2796-4240
Бабенко Андрей Сергеевич — доцент кафедры биоорганической химии Белорусский государственный медицинский университет. Кандидат химических наук. Тел.: + 375 (017) 279-42-13. E-mail: labmdbt@gmail.com ORCID: 0000-0002-5513-970X
Введение. В настоящее время понимание молекулярных механизмов патологического ангиогенеза остается фундаментальной проблемой в гепатологии.
Цель работы состояла в поиске связи между уровнем экспрессии мРНК генов ang, vegf и ангиогенезом в печени крыс Wistar в экспериментальном циррозе.
Материал и методы. В эксперименте использовали 117половозрелых крыс-самцов Wistar массой тела от 190—210 г. Цирроз печени у животных индуцировали раствором тиоацетамида, который вводили в желудок с помощью зонда в дозе 200 мг/кг массы тела животного 2 раза в неделю. Динамику процесса изучали в девяти временных точках (в течение 17 нед). Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в печени исследовали уровень экспрессии мРНК генов ang и vegf. Для получения обзорных гистологических препаратов срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином, а для выявления соединительной ткани — методом Маллори. Микроскопический анализ проводили с использованием микроскопа OLYMPUS BX51 и программ анализа изображений ImageScope Color и cellSens Standard. Степень фиброза оценивали с использованием полуколичественной шкалы IshakK.G.
Заключение. Установлена статистически значимая зависимость между уровнем экспрессии суммарной мРНК генов-мишеней, ангиогенезом венозной системы и фиброгенезом. Со стороны артериальной системы печени на протяжении всего эксперимента выраженных морфологических изменений не отмечено, т.е. артериальный ангиогенез не выявлен. Вероятно, сплайс формы мРНК генов ang и vegf изученные в рамках данного исследования являются более важными факторами при патологическом ангиогенезе венозной системы. Между генами-мишенями выявлены значимые корреляционные связи r=0,65—0,84 (сплайс варианты, которые были исследованы). Совместное относительно друг друга изучение генов является необходимым дополнительным параметром при проведении фундаментальных и доклинических исследований.
Ключевые слова: крысы, цирроз печени, гены ang и vegf, стадии фиброза, ангиогенез
DECREASE IN ANG AND VEGFmRNA LEVELS DURING PROGRESSIVE ANGIOGENESIS OF THE LIVER VENOUS SYSTEM OF WISTAR RATS IN EXPERIMENTAL CIRRHOSIS E.I. Lebedeva1, A.T. Shchastny1, A.S. Babenka2
Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Frunze Ave., 27, Vitebsk, 210009, Republic of Belarus;
2Belarussian State Medical University, Dzerzhinsky ave., 83, building 15, Minsk, 220116, Republic of Belarus
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Lebedeva Elena Ivanovna — Associate Professor of the Department of Histology, Cytology and Embryology Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University. Associate Professor, PhD. Tel.: +375 (33) 675-76-99. E-mail: lebedeva.ya-elenale2013@yandex. ru ORCID: 0000-0003-1309-4248
Shchastniy Anatoly Tadeushevich — rector, Head of the Chair of Hospital Surgery with the course of the Faculty for Advanced Training & Retraining Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University. Doctor of Medical Sciences, professor. Tel.: + 375 (212) 6013-95. E-mail: admin@vsmu.by ORCID: 0000-0003-2796-4240
Babenka Andrey Sergeevich — Associate Professor of the Department of Bioorganic chemistry Belarussian State Medical University. PhD. Tel.: + 375(017) 279-42-13. E-mail: labmdbt@gmail.com ORCID: 0000-0002-5513-970X
Introduction. Currently, understanding the molecular mechanisms of pathological angiogenesis remains a fundamental problem in hepatology. The aim of this work was to find a relationship between the level of mRNA expression of the ang, vegfgenes and angiogenesis in the liver of Wistar rats in experimental cirrhosis.
Methods. The experiment used 117sexually mature male Wistar rats weighing from 190—210g. Liver cirrhosis in animals was induced with a solution of thioacetamide, which was introduced into the stomach using a probe at a dose of200 mg/kg of animal body weight 2 times a week. The dynamics of the process was studied at nine time points (over 17 weeks). The level of mRNA expression of the ang and vegf genes in the liver was studied by real-time polymerase chain reaction. To obtain overview histological preparations, liver sections were stained with hematoxylin and eosin, and to identify connective tissue — by the Mallory method. Microscopic analysis was performed using an OLYMPUS BX51 microscope and ImageScope Color and cellSens Standard image analysis programs. The degree offibrosis was assessed using the Ishak K.G.
Conclusion. A statistically significant relationship was established between the level of expression of the total mRNA of target genes, angiogenesis of the venous system, and fibrogenesis. No pronounced morphological changes were observed on the part of the liver arterial system throughout the experiment; arterial angiogenesis was not identified. Probably, the spliced forms of mRNA of the ang and vegf genes estimated by us are more important factors in the pathological angiogenesis of the venous system. Significant correlations were found between target genes r=0.65—0.84 (splice variants that were investigated). The joint study of genes with respect to each other is a necessary additional parameter when conducting basic and preclinical research.
Key words: rats, liver cirrhosis, ang and vegf genes, stages offibrosis, angiogenesis
ВВЕДЕНИЕ
До настоящего времени понимание молекулярных механизмов патологического ангиогенеза остается фундаментальной проблемой в гепато-логии [1, 2]. Клинические наблюдения и данные, полученные экспериментально, свидетельствуют о том, что патологический ангиогенез выполняют ключевую роль в прогрессировании фиброза печени [3-5].
Проангиогенные факторы являются важными звеньями в развитии и прогрессировании хронических заболеваний печени [6, 7]. Формирование новых кровеносных сосудов инициируется гипоксическим состоянием. Оно в свою очередь стимулирует экспрессию ангиогенных факторов, таких как УБОБ (семейство факторов роста эндотелия сосудов), ЛМО-1, 2 (ангиогенины), БОБ (семейство факторов роста фибробластов), РБОБ (фактор роста тромбоцитов) и других [8, 9].
УБОБ является мощным и хорошо изученным стимулятором ангиогенеза. Несмотря на это у исследователей его роль до сих пор вызывает интерес и порождает множество противоречий. Показано, что в ткани уровень экспрессии мРНК генов УБОБ зависит от присутствия других ангиогенных факторов, значения рН, концентрации кислорода, давления и других условий. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что УБОБ способствует развитию патологического ангиогенеза у животных при экспериментальном циррозе печени и при этом выполняет функцию провоспалительного цитокина [10, 11]. Выявлено, что снижение активности УБОБ ин-гибирует патологический ангиогенез. В тоже время
известно, что УБОБ необходим для формирования кровеносных сосудов в условиях физиологической нормы [1, 2, 10].
В отличие от УБОБ проангиогенный фактор ЛКО является менее изученным. Он экспрессирует-ся эндотелиальными клетками, лимфоцитами, фи-бробластами и гладкими миоцитами. Известно, что ЛКО вызывает изменения цитоскелета клетки путем снижения полимеризации О-актина и модификации Б-актина, принимает участие в миграции клеток, стимулирует пролиферацию опухолевых клеток [6, 7, 12].
По мнению ряда исследователей, основными регуляторами фенотипа синусоидальных эндоте-лиальных клеток при развитии и прогрессировании фиброза печени являются УБОБ и ЛКО. Одним из подходов в остановке ангиогенеза является блокада молекулярного каскада пути УБОБ, но клиническое использование этого метода ограничено из-за отсутствия надежных маркеров и побочных эффектов [3, 13, 14]. Исследование проангиоген-ных факторов, контролирующих патологический ангиогенез, является первостепенной и фундаментальной задачей при разработке лекарственных средств.
В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку оценить колебания уровня мРНК генов ащ и vegf на разных стадиях экспериментального фиброза печени крыс.
Цель работы состояла в поиске связи между уровнем экспрессии мРНК генов-мишеней и ангиогене-зом в печени крыс Wistar в экспериментальном циррозе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали 117 половозрелых крыс-самцов Wistar весом от 190—210 г. Цирроз печени у животных индуцировали раствором тиоа-цетамида (ТАА), который вводили в желудок с помощью зонда в дозе 200 мг/кг массы тела животного 2 раза в неделю за 3 ч до кормления в течение 17 нед. С использованием генератора случайных чисел животных рандомизировали на 9 групп по 12 особей в каждой (m0 — контрольная, m1 — длительность воздействия ТАА 3 нед, m2 — длительность воздействия ТАА 5 нед, m3 — длительность воздействия ТАА 7 нед, m4 — длительность воздействия ТАА 9 нед, m5 — длительность воздействия ТАА 11 нед, m6 — длительность воздействия ТАА 13 нед, m7 — длительность воздействия ТАА 15 нед, m8 — длительность воздействия ТАА 17 нед). Опытных крыс выводили из эксперимента декапитацией с применением гильотины в состоянии кратковременного эфирного наркоза через 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17 нед, а интакт-ных — по окончании эксперимента. В ходе эксперимента погибло 9 животных.
Дизайн эксперимента был одобрен на заседании Комиссии по биоэтике и гуманному обращению с лабораторными животными при учреждении образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» (Протокол №6 от 03.01.2019). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с рекомендациями Конвенции Совета Европы по охране позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях от 18.03.1986, Директиве Совета ЕЭС от 24.11.1986 и рекомендациям FELASA Working Group Report (1994-1996).
Выделение суммарной РНК из исследуемых образцов печени и синтез кДНК на матрице суммарной РНК
Для изучения уровня экспрессии мРНК генов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) скальпелем из большой левой доли печени крыс забирали фрагменты органа диаметром не более 5 мм. После забора образцы помещали в криопробирки и далее в жидкий азот для транспортировки и хранения непосредственно до начала процедуры выделения РНК.
Выделение суммарной РНК проводили с помощью набора реагентов АртРНК MiniSpin (ООО «АртБиоТех», Беларусь) согласно протоколу производителя. Гомогенизацию образцов проводили с использованием фарфоровых ступок и пестиков в присутствии жидкого азота, не допуская размораживания образцов.
После процедуры выделения и очистки суммарную РНК сбивали с мини-колонок с помощью свободной от РНКаз milliQ воды, входящей в состав набора. Контроль качественных характеристик образцов проводили с помощью электрофореза в агарозном геле (выборочно) без денатурирующих условий (1х ТАЕ, 2% гель). Количество суммарной
РНК после выделения определяли с помощью спек-трофотометрии (длина волны — 260 нм, Quantus (Promega, США). Выборочно снимали спектр поглощения 220—340 нм.
Синтез кДНК проводили с использованием олиго-дТ-праймеров и набора реагентов ArtMMLV Total (ООО «АртБиоТех», Беларусь) в соответствии с инструкцией производителя. Для одной реакции использовали одинаковое стартовое количество суммарной РНК 200 нг на 1 реакцию.
Дизайн олигонуклеотидных праймеров для оценки уровня мРНК генов-мишеней.
Для дизайна специфических олигонуклеотид-ных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов использовали данные о последовательностях мРНК генов депонированных в базе данных NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). В качестве мишеней были выбраны:
ang: Ang — ангиогенин (angio/genin).
vegf: Vegfa — фактор роста эндотелия сосудов А (vascular endothelial growth factor A).
В случае наличия нескольких вариантов мРНК перед началом дизайна проводили их выравнивание с помощью бесплатного программного пакета Ugene v.33 (UniPro, Россия). Для дизайна использовали консервативные участки последовательности мРНК с соблюдением правила о размещении одного или более олигонуклеотидов в месте соединения 2 разных экзонов.
Первичный дизайн проводили с помощью бесплатного онлайн приложения Primer3 v. 0.4.0 (http:// bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Уникальность и специфичность полученных олигонуклеотидов проверяли с помощью онлайн сервиса Blast (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi). Анализ наличия стабильных димеров и шпилечных структур олигонуклеотидов и ампликонов, а также моделирование оптимальных условий ПЦР-РВ осуществляли с помощью бесплатного онлайн программного пакета mFold (http:// unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form) и бесплатного онлайн приложения OligoAnalyser (https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer). Последовательности олигонуклеотидов представлены в табл. 1.
Проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Для проведения ПЦР-РВ использовали реагенты производства ОДО «Праймтех», Беларусь. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал все необходимые компоненты в следующих концентрациях: 2 мМ хлорида магния, 0,1 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 500 нМ олигонукле-отидов, включая зонд для ПЦР-РВ, 1,25 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы с соответствующим буферным раствором.
Режим термоциклирования: +95°С — 2 мин, затем 40 циклов: +95°С — 5 с, +60°С — 45 с. Детекция по каналу FAM после каждого цикла. В работе ис-
пользовали оборудование производства компании BioRad (прибор CFX96touch, США). Критерием успешной оптимизации считали наименьший показатель цикла амплификации. Эффективность реакций определяли с помощью метода стандартной кривой и серий разведений, концентрированных образцов кДНК. Шаг 5 раз. Критерием удовлетворительной эффективности считали >90%. Для определения уровня экспрессии генов проводили ПЦР-РВ согласно оптимизированным протоколам для всех мишеней и кандидатов в референсные гены. Все реакции проводили в триплетах. В каждой экспериментальной и контрольной группах все 12 образцов анализировали отдельно для получения наибольшей достоверности и учета внутри-групповой вариации, фенотипической гетерогенности уровня экспрессии генов.
Нормализация данных ПЦР-РВ
Для нормализации данных ПЦР-РВ в качестве референсного гена использовали hesl. Уровень мРНК этого гена в предварительном исследовании (данные не приводятся) не показал ответа на экспериментальное воздействие в течение всего периода наблюдений (17 нед), а вариация уровня его мРНК внутри одного эксперимента от животного к животному варьировала в пределах 1 цикла. При анализе всех значений циклов ПЦР-РВ Cq (Cq — quantitation cycle) также была выявлена вариация гена-мишени hesl менее 1 цикла. В связи с этим было принято решение проводить нормализацию данных ПЦР-РВ с использованием в качестве референсного гена — hesl.
Гистологические и морфометрические методы исследования
Для проведения морфологического исследования образцы печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере в течение 24 ч. Обработку фиксированного материала проводили с использованием автомата для гистологической обработки ткани (STP-120, тип карусель, Thermo Fisher Scientific, Германия) и станции для заливки ткани парафином (EC350, Thermo Fisher Scientific, Германия). С помощью ротационного микротома (НМ340Е, MICROM, Laborgerate GmbH, Германия) изготавливали срезы толщи -ной 4 мкм. Для получения обзорных гистологических препаратов срезы печени окрашивали гематоксилином
и эозином, а для выявления соединительнои ткани — методом Маллори в автоматическом программируемом приборе для цитологических и гистологических исследовании (HMS70, Thermo Fisher Scientific, Германия).
На гистологических препаратах с использованием компьютерных программ ImageScope Color и cellSens Standard определяли площадь междолько-вых вен (мкм2) и площадь соединительной ткани в процентах к общей площади среза [15]. Измерения осуществляли путем микрофотосъемки случайных полей зрения препаратов печени цифровой камерой OLYMPUS XC30 (Япония) на базе микроскопа OLYMPUS BX51 (Япония) при увеличении объектива х20 >3 полей зрения в каждом гистологическом срезе. Степень фиброза оценивали с использованием полуколичественной шкалы Ishak K.G. [16].
Статистические методы исследования
Результаты количественных измерений оценивали с использованием программ Statistica 10.0 фирмы StatSoft, IBM SPSS Statistics 23.0, Microsoft Office Excel. В выборках по каждой неделе эксперимента определяли нормальность частотного распределения признака по критерию Шапиро—Уилка. О достоверности различий изучаемых признаков с нормальным частотным распределением судили по t-критерию Стьюдента. При отличии частотного распределения признака от нормального использовали U-критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Изучение значимости влияния нед эксперимента (стадии фиброза/цирроза) на исследуемые признаки проводили с помощью параметрического двухфакторного дисперсионного анализа. Для выявления наличия
Таблица 1
Последовательности специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов
Table 1
Sequence of specific oligonucleotide primers and fluorescently labeled probes
Название олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида, 5' ^ 3' Метка, 5' Метка, 3'
angF TGCGAAAGTATGATGAGGAGAA
angR TGTTGCCATGGATAAAGGTG
angP ACCTCGCCCTGCAAAGAGGT FAM BHQ1
vegfaF GCAGATCATGCGGATCAAA
vegfaR ATGCTGCAGGAAGCTCATCT
vegfaP CCTCACCAAAGCCAGCACAT FAM BHQ1
heslF GAAAGATAGCTCCCGGCATT
heslR CGGAGGTGCTTCACTGTCAT
heslP CCAAGCTGGAGAAGGCAGACA FAM BHQ1
зависимости и ее силы между изучаемыми признаками использовали непараметрическую ранговую корреляцию Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В последние годы внимание исследователей все больше привлекают не только фактические участники физиологических процессов, но и пути регуляции их активности. Причем актуальными остаются буквально все уровни организации, включающие ДНК, мРНК, белки-участники процесса и в тоже время ряд регуляторных ассоциированных некодирующих структур. Увы, в данном отношении до сих пор не удалось продвинуться достаточно далеко ввиду чрезвычайного многообразия регуляторных элементов и их ролей в тех или иных, казалось бы, уже понятных процессах [9, 17].
Касательно механизмов регуляции работы систем, отвечающих за развитие цирроза, сложно сделать какие-то конкретные выводы ввиду недостаточности экспериментальных данных на молекулярном уровне. Тем не менее становится ясно, что для своевременной диагностики, стадирова-ния, а тем более — лечения и профилактики фиброза и цирроза данных морфологических исследований недостаточно. В первую очередь, это связано с тем фактом, что в подавляющем большинстве случаев данные морфологии являются уже следствием ряда процессов, которые запускаются в тканях задолго до клинических проявлений патологии. Мо-лекулярно-генетическая диагностика при умелом подходе может быть чрезвычайно полезна в отношении ранней диагностики, адаптивного подхода в терапии, профилактике изменений, связанных с фиброзом и циррозом [14, 17, 18].
В рамках настоящей работы проводилась оценка динамики уровня мРНК генов, вовлекаемых в процессы ангиогенеза, в частности и ащ. Стоит
отметить, что уровень мРНК данных мишеней часто упоминается в работах, посвященных изучению механизмов фиброгенеза в различных органах. Полученные данные пока не позволяют сделать конкретных и однозначных выводов и часто бывают противоречивыми. Некоторые исследователи считают, что это может быть связано с большим разнообразием регуляторных механизмов. Однако, даже на уровне альтернативного сплайсинга мРНК генов и ащ могут быть скрыты ответы на многие вопросы. Дело в том, что в настоящий момент описано порядка 20 альтернативных вариантов мРНК гена УБОБЛ для человека и 13 вариантов для крысы. В отношении гена ЛМО как минимум 7 и 2 варианта соответственно. Безусловно, эти варианты не единственное, что мешает полностью разобраться в процессе, но изучение их роли, по мнению многих ученых, может пролить свет на ряд процессов, до сих пор не охарактеризованных [8, 10, 14, 19].
В данном исследовании уровень мРНК генов и ащ изучали в пуле вариантов, т.е. суммарную мРНК каждого из генов-мишеней без разделения на альтернативные варианты сплайсинга. Тем не менее, в современных работах этому вопросу уделяется недостаточное внимание и зачастую олигонуклеотиды покрывают не все доступные для изучения альтернативные варианты мРНК.
В течение всего периода эксперимента динамику уровня мРНК генов ув^и ащ изучали в отдельности друг от друга в 9 точках. Между генами установили значимые корреляционные связи (данные приводятся ниже) и на основании этого было принято решение исследовать динамику уровня мРНК генов-мишеней совместно, относительно друг друга. Наряду с этим рассматривали изменение процентного отношения уровня мРНК генов ащ и
При исследовании экспрессии мРНК генов-мишеней в отдельности друг от друга на всех сроках на-
>Б Й
S >£
3
Е-
S о с S Ес
g
а
св
I 0
й 0 д
^ л
£ 0
>£
S о
и с
£
0,24
~ 009 0,07 0,05 0,03 0£2 QQ2 QQ5
m0 ml m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 Контрольные точки исследования
l
Относительный* уровень мРНК гена vegf 0, 0, 0, 0, 02 4 6 8 l l 0,23 0,30 0,25 0,2 0,34 0,28 0,l9 0,27
m0 ml m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 Контрольные точки исследования
Рис. 1. Динамика суммарного уровня мРНК гена ang. * — нормализованные значения уровня мРНК гена ang, референсный ген Hesl, референсная контрольная точка — m0
Fig. 1. All splice variants of ang mRNA level changes. * — normalized mRNA expression (ang); reference gene — Hesl; reference control point — m0
Рис. 2. Динамика суммарного уровня мРНК гена vegf.
* — нормализованные значения уровня мРНК гена vegf, референсный ген Hesl, референсная контрольная точка — m0
Fig. 2. All splice variants of vegf mRNA level changes.
* — normalized mRNA expression (vegf); reference gene — Hesl; reference control point — m0
блюдения выявили снижение их уровня (рис. 1, 2), а при совместном наблюдении результаты получили другие.
В контрольной группе животных (точка m0) уровень мРНК генов ang и vegf был выбран стартовой точкой и принят за 1. Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 2,3% для гена vegf и 97,7% для гена ang или 1:42,5. Гистологическая картина печени крыс Wistar соответствовала критериям нормы. Степень фиброза по шкале Ishak K.G. соответствовала F0.
Морфологический анализ печени подопытных животных показал развитие хронического патологического процесса в динамике, основным проявлением которого являлся фиброз с трансформацией в цирроз. Морфологические изменения паренхимы органа описаны в статье А.Т. Щастного и соавт. (2021) [20]. В рамках настоящей работы приведены только стадии фиброза.
На начальном этапе эксперимента (через 3 нед, точка m1) отмечали падение экспрессии гена ang в 4,1 раза, а гена vegf — в 4,35 раза по сравнению с точкой m0. Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 2,2% для гена vegf и 97,8% для гена ang или 1:44,5. При общем падении уровня экспрессии генов примерно в 4 раза их соотношение по сравнению с точкой m0 осталось практически без изменений. Степень фиброза по шкале K.G. Ishak соответствовала F1. На данном этапе со стороны венозной системы печени наблюдали изменения, которые проявлялись увеличением площади меж-дольковых вен в 1,56 раза (р=0,000) по сравнению с точкой m0.
Через 5 нед эксперимента (точка m2) выявлен процесс дальнейшего снижения экспрессии гена ang в 11,75 раза, а гена vegf — в 3,3 раза по сравнению с точкой m0. На фоне прогрессирования фиброза печени (стадия F2/F3) уровень экспрессии гена ang стремительно падал, в то время как экспрессия гена vegf остается практически неизменной по сравнению с точкой m1. Площадь междольковых вен также не изменилась по сравнению с m1. Отношение уровня мРНК генов-мишеней составило 7,8% для гена vegf и 92,2% — для гена ang, или 1:11,8. Как видно, доля мРНК гена vegf возросла практически в 4 раза (3,77 раза) по сравнению с начальной точкой.
На фоне дальнейшей затравки животных (7 нед эксперимента, точка m3, стадия фиброза F3/F4) выявили падение уровней экспрессии гена ang в 14,5 раза, а гена vegf — в 4 раза (относительно точки m0). Предположительно, это может быть как-то связано с изменением структуры паренхимы печени (гибелью одних клеток, изменением фенотипа и активности других клеток и пр.) и формированием определенных условий под влиянием которых происходит разная степенью ингибирования уровня экспрессии генов vegf и ang в точках m2 и m3. Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 7,9% для гена vegf и 92,1% для гена ang или 1:11,7. Наблю-
дался процесс увеличения площади междольковых вен в 2,5 раза (р=0,000) по сравнению точкой т0. Заслуживает особого внимание и вызывает большой интерес факт того, что на данном этапе эксперимента при установленных фактах падения уровней изучаемых проангиогенных факторов на гистологических препаратах печени крыс в портальных зонах и соединительнотканных септах выявили формирование мелких кровеносных сосудов венозного типа: венул и мелких вен.
В рамках настоящего эксперимента мы считаем точку т3 границей начала ангиогенеза венозной системы печени, проявляющейся морфологически. При этом сам процесс мог быть инициирован еще в точке т2.
Через 9 нед эксперимента (точка т4) уровень экспрессии гена ащ упал до 19,8 раза, а гена vegf был снижен до 3,4 раза по сравнению с точкой т0. Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 12,1% для гена vegf и 87,9% для гена aяg. Соотношение уровней мРНК генов-мишеней снова изменилось в пользу гена vegf и составило 1:7,3.
В точке т5, что соответствовало одиннадцати нед эксперимента установлено сильное падения уровня экспрессии гена ащ в 31,7 раза по сравнению с точкой т0. При этом темпы снижения гена vegf были минимальными (2,9 раза по сравнению с точкой т0). Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 20,3% для гена vegf и 79,7% для гена ащ или 1:3,92.
В данный период эксперимента (9-11 нед, стадии фиброза Р4/Б5 и Б5 соответственно) на гистологических препаратах печени крыс отмечена стабилизация прогрессирования дистрофических процессов без развития выраженных зон некроза. При этом выявлено значительное прогрессирование процессов организации, которые проявлялись в обширном разрастании соединительной ткани вокруг портальных зон, местами формированием толстых септ по периферии долек с уменьшением их площади. Это период трансформации фиброза в цирроз. Значительные изменения наблюдали в сосудистом русле печени: выраженный ангиогенез, который проявлялся формированием множества мелких кровеносных сосудов венозного типа (рис. 3). Площадь имеющихся меж-дольковых вен увеличилась в 6,13 раза (р=0,000) через 9 нед и в 7,00 раз (р=0,000) через 11 нед по сравнению с точкой т0.
В дальнейший срок исследования (через 13 нед эксперимента, точка т6, стадия фиброза Р5/Б6) уровень экспрессии гена ащ снизился по сравнению с точкой т0 в 52 раза, а гена vegf — в 3,6 раза, как и практически на всех стадиях развития фиброза ранее. Продолжалась перестройка венозной системы печени. В портальных зонах и соедини -тельнотканных септах был выявлен выраженный ангиогенез. Отношение уровня мРНК генов-мишеней в процентах составило 25,5% для гена vegf и
74,5% для гена ащ или 1:2,9. Площадь междолько-вых вен увеличилась в 18,00 раз (р=0,000) по сравнению с точкой т0.
На фоне глубоких морфологических изменений печени (пятнадцать нед эксперимента, точка т7, стадия фиброза Б6, цирроз) уровень экспрессии гена ащ практически не изменился по сравнению с точкой т6, а по сравнению с начальной точкой (т0) снизился в 53,8 раза (формально максимальное снижение за все время наблюдения). В отличие от большинства точек (т1—т6) в точке т7 уровень экспрессии гена vegf снизился относительно точки т0 максимально — 5,27 раза. Отношение уровня мРНК генов-мишеней составило 19,5% для гена vegf и 80,5% для гена ащ или 1:4,12. Мы полагаем, что падение уровня мРНК гена vegf на данном этапе может быть связано с угнетением функции и(или) гибелью клеток, ответственных за его экспрессию на фоне прогрессирования цирроза печени и(или) ингибированием уровня его экспрессии. Площадь междольковых вен увеличилась в 19,40 раз (р=0,000) по сравнению с точкой т0.
К концу эксперимента (17 нед, точка т8, стадия фиброза Б6, цирроз) на фоне полной перестройки гистоархитектоники органа отмечен возврат уровня экспрессии генов-мишеней к показателям точки т4 как в отношении генов по отдельности, так и в процентном отношении, т.е. к показателям точки перехода фиброза в цирроз. Возможно, гены выполнили свою роль в развитии цирроза и были запущены противодействующие механизмы, которые еще предстоит изучить или сработали компенсаторно-приспособительные реакции органа.
Следует отметить, что наряду с активным формированием новых сосудов венозного типа (рис. 4)
происходило дальнейшее увеличение площади имеющихся междольковых вен (в 72 раза (р=0,000) по сравнению с точкой т0).
Большинство из них приобретали гигантский размер и неправильную форму с формированием множества лакун. Часто на гистологических препаратах площадь междольковых вен превышала площадь ложных печеночных долек (рис. 5). Эндотелиальный слой в венозных сосудах зачастую имел вид верти -кальных клеток с неровной апикальной поверхностью.
а- о,- •• -
i Ч ^ ■ - ^ • V'-' 4 '
;.. « Ш - %
i-vi-'-i.-;^ -л," " ' . - Л-'ti -i' г Л, ' " .
- Wm^-nK щ '
■ . \ ; \ ■ „■• ■ Г. о' v- -У-л- t •• v Шш*. * " ■ -Ж к ■ •»
ЩЁШщЩрмЪ;;.
Рис. 4. Гистологический препарат печени крысы с индуцированным циррозом через 17 нед после начала эксперимента. Выраженный ангиогенез выделен рамками овальной формы. Окраска по методу Маллори; х 10 Fig. 4. Induced cirrhosis of rat liver, 14 weeks after the start of the experiment. Pronounced angiogenesis is marked with oval frames. Mallory staining; х 10
Рис. 3. Гистологический препарат печени крысы с индуцированным циррозом через 11 нед после начала эксперимента. Ангиогенез отмечен стрелками. Окраска гематоксилином и эозином; х20 Fig. 3. Induced cirrhosis of rat liver, 11 weeks after the start of the experiment. Angiogenesis is marked with arrows Stained with hematoxylin and eosin; х20
Рис. 5. Гистологический препарат печени крысы с индуцированным циррозом через 17 нед после начала эксперимента. Окраска по методу Маллори; х 10 Fig. 5. Induced cirrhosis of rat liver, 17 weeks after the start of the experiment. Mallory staining; х 10
Важно отметить, что при морфологическом описании гистологических препаратов со стороны артериальной системы выраженных изменений не выявлено. Внутрипеченочное сосудистое русло — это невероятно уникальная, сложная, пластичная система и каждая ее единица состоит из нескольких популяций клеток, имеет различное микроокружение и регулируется разными молекулярными сигналами [1, 5, 8].
7Е5 6Е5 5Е5 g 4Е5 м & 3Е5 св ® 2Е5 1Е5 0 -1Е5 График средних и доверительных (95%) интервалов
0 3 5 7 9 11 13 15 17 Неделя эксперимента S вены ЗН S соединительной ткани
Рис. 6. Динамика изменений площади междольковых вен и площади соединительной ткани. Представлен график параметрического двухфакторного дисперсионного анализа
Fig. 6. Changes in areas of interlobular veins and areas of connective tissue. Plot of the two-way analysis of variance parameter
1400 1200 1000 § 800 н g 600 а ® 400 2000 0 -200 График средних и доверительных (95%) интервалов
0 Ang 3 5 7 9 11 13 15 17 Неделя эксперимента ^ Vegfa
Рис. 7. Динамика изменений уровня мРНК генов vegf и ang. Представлен график параметрического двухфак-торного дисперсионного анализа Fig. 7. Changes in vegf and ang mRNA levels. Plot of the two-way analysis of variance parameter
В результате проведенного параметрического двухфакторного дисперсионного анализа доказана значимое влияния срока (недели) эксперимента (стадии фиброза/цирроза) на площадь междольковых вен и площадь соединительной ткани (рис. 6), а также уровень экспрессии мРНК генов vegf и ащ (рис. 7).
Методом непараметрической ранговой корреляции Спирмена в точках т0—т5 между уровнем экспрессии генов vegf и ащ установлены значимые корреляционные связи сильной и средней силы, а в остальных точках связь не выявлена. В табл. 2 приведены корреляционные связи.
В точках т3 и т5 между уровнем экспрессии генов vegf, а^ и площадью соединительной ткани (стадии фиброза Б3—Б5) выявлены отрицательные корреляционные связи умеренной силы -0,35 и -0,49 соответственно. Это дает основание сделать вывод, что в данные сроки эксперимента падение экспрессии генов vegf и ащ приводит к увеличению площади соединительной ткани. Следует отметить, что в точке т7 между уровнем мРНК гена vegf и соединительной тканью установлена коэффициент корреляции равный 0,54.
В рамках настоящей работы при изучении уровней гена vegf и ащ в отдельности друг от друга установлено падение их экспрессии на фоне выраженное ангиогенеза венозной системы печени. Так как мы изучали суммарные мРНК генов без разделения на альтернативные варианты сплайсинга утверждать факт того, что ген ащ и vegf не является про-ангиогенным факторами для ангиогенеза венозной системы, не представляется возможным. На уровне мРНК вносить определенный вклад и выполнять важную роль может и минорный сплайс-вариант. Нельзя исключать факт образования сосудов путем почкования. Высока вероятность, что в пролиферации эндотелиальных клеток и активации ангио-генеза венозной системы печени в условиях данной модели эксперимента принимают участия другие факторы на фоне угнетения генов-мишеней. Возможно, пул эндотелиальных клеток пополняется за счет циркулирующих эндотелиальных клеток предшественников.
При исследовании уровней генов-мишеней совместно, относительно друг друга до точки т6 экспрессия гена vegf увеличивалась, а гена ащ — снижалась. В точках т7—т8 наоборот ген vegf падал, а ген ащ — возрастал. Считаем совместное изучение генов-мишеней необходимым дополнительным параметром при проведении дальнейших фундаментальных и доклинических исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В печени крыс ^^аг при экспериментальном циррозе индуцированном тиоацетамидом между уровнем экспрессии суммарной мРНК генов-мишеней, ангиогенезом венозной системы и фиброгенезом установлена статистически значимая зависимость.
Таблица 2
Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнем экспрессии генов vegf и ang
Table 2
Spearman's rank correlation coefficients between increased expression of vegf and ang
Коэффициенты корреляции значимые на уровне р<0,05
Признак наименование группы/недели эксперимента
m0/контроль m1/3 нед m2/5 нед m3/7 нед m4/9 нед m5/11 нед
Ang
Vegf 0,73 0,68 0,65 0,72 0,60 0,84
Вероятно, сплайс формы мРНК генов ащ и vegf изученные в рамках данного исследования являются более важными при патологическом ангиогенезе венозной системы. Возможно, при подробном рассмотрении всех известных сплайс-вариантов мРНК генов-мишеней удалось бы сделать более конкретные выводы. Полученные результаты могут быть следствием того, что мы не можем оценить уровень минорных сплайс-вариантов.
Методом непараметрической ранговой корреляции Спирмена между генами vegf и ащ выявлены значимые корреляционные связи сильной и средней силы (т.е. сплайс-варианты, которые были исследованы). Совместное относительно друг друга изучение генов является необходимым дополнительным параметром при проведении фундаментальных и доклинических исследований.
Со стороны артериальной системы печени на протяжении всего эксперимента выраженных морфологических изменений не отмечено, т.е. артериальный ангиогенез не выявлен. Предположительно это связано с перестройкой энергетического обмена клеток и повышении роли гликолиза в энергопроизводстве. На этом фоне увеличивается количество
энергии и метаболитов необходимых для интенсификации синтеза белков внеклеточного матрикса. При этом потребности в кислороде (артериальная система) остаются на практически неизменном уровне. Со стороны венозной системы необходим рост для отведения метаболитов.
* * *
Финансирование работы
Работа выполнена в рамках государственной программы научных исследований «Фундаментальные и прикладные науки — медицине» Министерства здравоохранения Республики Беларусь, задание 2.89«Изучить роль экспрессии генов NOTCH- и TWEAK-сигнальных путей, участвующих в процессах пролиферации и диф-ференцировки клеток печени в норме и при ее токсическом поражении» (регистрационный номер 20190107от 19.02.2019).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Lafoz E., Ruart M., Anton A., Oncins A., Hernanadez-Gea V. The endothelium as a driver of liver fibrosis and regeneration. Cells. 2020; 9 (4): 929. https://doi. org/10.3390/cells9040929.
2. Yang X., Wang Z., Kai J., Wang F., Jia Y., Wang S., Tan S., Shen X., Chen A., Shao J., Zhang F., Zhang Z., Zheng S. Curcumol attenuates liver sinusoidal endothelial cell angiogenesis via regulating Glis-PROXI-HIF-1a in liver fibrosis. Cell Prolif. 2020; 53 (3): 12762. https://doi.org/10.1111/cpr.12762.
3. He Z., Yang D., Fan X., Zhang M., Li Y., Gu X., Yang M. The roles and mechanisms of lncrnas in liver fibrosis. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (4): 1482. https://doi.org/10.3390/ ijms21041482.
4. Roehlen N., Crouchet E., Baumert T.F. Liver fibrosis: Mechanistic concepts and therapeutic perspectives. Cells. 2020; 9 (4): 875. https://doi.org/10.3390/cells9040875.
5. Fernandez M., Semela D., Bruix J., Colle I., Pinzani M., Bosch J. Angiogenesis in liver disease. J. Hepatol. 2009; 50 (3): 604-20.
https://doi.org/10.10Wj.jhep.2008.12.011,
6. Coulon S., Heindryckx F., Geerts A., Van Steenkiste C., Colle I., Van Vlierberghe H. Angiogenesis in chronic liver disease and its complications. Liver Int. 2011; 31 (2): 146-62. https://doi.org/10.111Vj.1478-3231.2010.02369.x.
7. Carmeliet P., Jain R.K. Molecular mechanisms and clinical applications of angio-genesis. Nature. 2011; 473 (7347): 298-307. https://doi.org/10.1038/nature10144.
8. Elpek G.O. Angiogenesis and liver fibrosis. World J. Hepatol. 2015; 7 (3): 377-91. https://doi.org/10.4254/wjh.v7.i3.377.
9. Bocca C., Novo E., Miglietta A., Parola M. Angiogenesis and fibrogenesis in chronic liver diseases. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2015; 1 (5): 477-88. https://doi. org/10.1016/j.jcmgh.2015.06.011.
10. Ding Q., Tian X.G., Li Y., Wang Q.Z., Zhang C.Q. Carvedilol may attenuate liver cirrhosis by inhibiting angiogenesis through the VEGF-Src-ERK signaling pathway. World J. Gastroenterol. 2015; 21 (32): 9566-76.
https://doi.org/10.3748/wjg.v21.i32.9566,
11. Yang L., Kwon J., Popov Y., Gajdos G.B., Ordog T., Brekken R.A., Mukhopadhyay D., Schuppan D., Bi Y., Simonetto D., Shah V.H. Vascular endothelial growth factor promotes fibrosis resolution and repair in mice. Gastroenterology. 2014; 146 (5): 1339-50. e1. https://doi.org/ 10.1053/j. gastro.2014.01.061.
12. Lee J.S., Semela D., Iredale J., Shah V.H. Sinusoidal remodeling and angiogenesis: a new function for the liver-specific pericyte? Hepatology. 2007; 45 (3): 817-25. https:// doi.org/10.1002/hep.21564.
13. Ni Y., Li J.M., Liu M.K., Zhang T.T., Wang D.P., Zhou W.H., Hu L.Z., Lv W.L. Pathological process of liver sinusoidal endothelial cells in liver diseases. World J. Gastroenterol. 2017; 23 (43): 7666-77. https://doi.org/10.3748/ wjg.v23.i43.7666.
14. Garbuzenko D.V., Arefyev N.O., Kazach-kov E.L. Antiangiogenic therapy for portal hypertension in liver cirrhosis: Current progress and perspectives. World J. Gastro-
enterol. 2018; 24 (33): 3738-48. https://doi. org/10.3748/wjg.v24.i33.3738.
15. Guerrier M., Attili F., Alpini G., Glaser S. Prolonged administration of secretin to normal rats increases biliary proliferation and secretin-induced ductal secretory activity. Hepatobiliary Surg. Nutr. 2014; 3 (3): 118-25. https://doi.org/10.3978/jJssn.2304-3881.2014.04.04.
16. Everhart J.E., Wright E.C., Goodman Z.D., Dienstag J.L., Hoefs J.C., Kleiner D.E., Ghany M.G., Mills A.S., Nash S.R., Govin-darajan S., Rogers T.E., Greenson J.K., Brunt E.M., Bonkovsky H. L., Morishima C. Prognostic value of Ishak fibrosis stage: findings from the hepatitis C antiviral long-term treatment against cirrhosis trial.
Hepatology. 2010; 51 (2): 585-94. https:// doi.org/10.1002/hep.23315.
17. Amano H., Mastui Y., Ito Y., Shibata Y., Betto T., Eshima K., Ogawa F., Satoh Y., Shibuya M., Majima M. The role of vascular en-dothelial growth factor receptor 1 tyrosine kinase signaling in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Biomed. Pharmacother. 2019; 117: 109067. https://doi.org/10.10Wj. biopha.2019.109067.
18. Salum G.M., El Din N.G.B., Ibrahim M.K., Anany M.A., Dawood R.M., Khairy A., El Awady M.K. Vascular endothelial growth factor expression in hepatitis C virus-induced liver fibrosis: A potential biomarker. J. Interferon Cytokine Res. 2017; 37 (7): 310-6. https://doi.org/10.1089/jir.2016.0127.
19. Barratt S.L., Flower V.A., Pauling J.D., Millar A.B. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and fibrotic lung disease. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19 (5): 1269. https://doi. org/10.3390/ijms19051269.
20. Щастный А.Т., Лебедева Е.И., Бабенко А.С. Роль уровня мРНК генов сигнального пути Notch при индуцированном фиброгенезе печени крысы. Вестник ВГМУ. 2021; 20 (2): 25-37. https://doi. org/10.22263/2312-4156.2021.2.25 [Shchastniy A.T., Lebedeva E.I., Babenka A.S. The role of mRNA level of the Notch signaling pathway genes in induced rat liver fibrogenesis. Vestnik VSMU. 2021; 20 (2): 25-37. https://doi.org/10.22263/2312-4156.2021.2.25].
Для цитирования: Лебедева Е.И., Щастный А.Т., Бабенко А.С. Взаимное снижение уровня мРНК ANG и VEGF при прогрессирующем ангиогенезе венозной системы печени крыс Wistar в экспериментальном циррозе. Молекулярная медицина. 2022; 20 (2): 53-62. https://doi.org/10.29296/24999490-2022-02-08
Поступила 22 января 2022 г.
For citation: Lebedeva E.I., Shchastny A.T., Babenka A.S. Decrease in ANG and VEGF mRNA levels during progressive angiogenesis of the liver venous system of Wistar rats in experimental cirrhosis. Mole-kulyarnaya meditsina. 2022; 20 (2): 53-62 (in Russian). https://doi. org/10.29296/24999490-2022-02-08
