CC BY
14
Оригинальная статья
Выживаемость больных увеальной меланомой в отдаленные сроки после энуклеации в зависимости от молекулярно-генетических аберраций
Нероев В.В.1 • Саакян С.В.1 • Амирян А.Г.1 • Цыганков А.Ю.1 • Бурденный А.М.2 • Логинов В.И.2 • Хлгатян М.Р.1
Нероев Владимир Владимирович -
д-р мед. наук, профессор, чл.-корр. РАН, директор1
Саакян Светлана Владимировна - д-р
мед. наук, профессор, начальник отдела офтальмоонкологии и радиологии1 Амирян Ануш Гамлетовна - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. отдела офтальмоонкологии и радиологии1 И 105062, г. Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, Российская Федерация. Тел.: +7 (495) 608 41 44. E-mail: [email protected] Цыганков Александр Юрьевич -канд. мед. наук, мл. науч. сотр. отдела офтальмоонкологии и радиологии1
Бурденный Алексей Михайлович -
канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики2 Логинов Виталий Игоревич - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики2
Хлгатян Мариам Рубеновна -
врач-офтальмолог, аспирант отдела офтальмоонкологии и радиологии1
Актуальность. В последние годы при прогнозировании течения увеальной меланомы (УМ) большое значение приобретают молекуляр-но-генетические прогностические факторы. В клинической практике молекулярно-генети-ческие методы используют для выявления пациентов с высоким риском развития метастазов. Цель - определить выживаемость больных УМ после энуклеации в зависимости от молекуляр-но-генетических аберраций. Материал и методы. Обследованы и пролечены 30 больных УМ в возрасте от 23 до 83 лет. Во всех случаях проведена энуклеация. Удаленные глаза подверглись морфологическому, молекулярно-ге-нетическому и цитогенетическому анализу (потеря гетерозиготности на хромосомах 1, 3 и 8, метилирование гена ЯА55Р1А, мутации в генах вЫАО/11, полиморфизм гена АВСВ1). Медиана наблюдения составила 61 месяц. Результаты. Кумулятивная трехлетняя доля выживших больных УМ была 77,8 ± 8%, а пятилетняя - 63 ± 9%. Средние значения времени выживания составили 52,8 ± 3,9 месяца. Больные с моносомией хромосомы 3 демонстрировали значимо более низкие показатели пятилетней выживаемости, чем больные с частичной моносомией и без потери гетерозиготности в хромосоме 3 (лог-ранк тест, х2 = 14,111, р = 0,001). Потеря гетеро-зиготности на хромосомах 1 и 8, метилирование гена ЯА55Р1А, мутации в генах вЫАО/11 и полиморфизм гена АВСВ1 не были ассоциированы
с худшим витальным прогнозом. Заключение. Молекулярно-генетические аберрации играют важную роль в прогнозировании течения опухолевого процесса и определении риска гематогенного метастазирования у больных УМ. Доказана значимая роль выявления моносомии хромосомы 3. В связи с относительно малой выборкой (30 пациентов), а также наличием временного фактора (анализ пятилетней выживаемости) роль других молекулярно-генетических изменений не подтверждена, что требует оценки не только генетических, но и клинико-эхо-графических и морфологических прогностических факторов.
Ключевые слова: увеальная меланома, генетика, выживаемость, молекулярно-генетические изменения, моносомия хромосомы 3, делеция хромосомы 1, делеция хромосомы 8, метилирование гена ЯА55ПА, мутации генов вЫАО/вЫАП, полиморфизм гена АВСВ1
Для цитирования: Нероев ВВ, Саакян СВ, Амирян АГ, Цыганков АЮ, Бурденный АМ, Логинов ВИ, Хлгатян МР. Выживаемость больных увеальной меланомой в отдаленные сроки после энуклеации в зависимости от молекулярно-гене-тических аберраций. Альманах клинической медицины. 2018;46(4):338-46. ао1: 10.18786/2072-05052018-46-4-338-346.
Поступила 07.05.2018; принята к публикации 18.06.2018
1 ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца» Минздрава России; 105062, г. Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, Российская Федерация
2 ФГБУН «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8, Российская Федерация
В последние годы при прогнозировании течения увеальной меланомы (УМ) большое значение приобретают молекулярно-ге-нетические прогностические факторы. Необходимо учитывать, что УМ - не моногенное, а мультифакторное заболевание со сложным молекулярным строением. В клинической практике молекулярно-генетические методы используют для выявления пациентов с высоким риском развития метастазов [1, 2]. Несмотря на возможность достижения хорошего локального контроля опухоли в краткосрочном и среднесрочном, а в ряде случаев и в долгосрочном периоде наблюдения, частота метастазирования остается около 50% через 5 лет независимо от проведенного лечения [3]. Эффективное лечение метастатической УМ также весьма ограниченно [4].
Выявление микрометастазов на ранних стадиях и определение правильной тактики ведения пациентов - одна из важнейших задач офтальмо-онкологии. Для прогнозирования течения заболевания были определены некоторые клинические, гистологические и генетические факторы, важнейшими из которых принято считать полную потерю одной копии (моносомию) 3-й хромосомы и специфический набор генов опухоли [5, 6]. При этом данные критерии необходимы не только для более точной диагностики и прогнозирования течения заболевания, но и для отбора пациентов для адъювантной терапии и контроля за циркулированием опухолевых клеток. Следует отметить, что специфические опухолевые маркеры, такие как GNAQ/GNA11 или ВАР1, могут служить мишенями для селективной терапии, затрагивающей специфические сигнальные пути развития опухоли [7].
Цель исследования - определить выживаемость больных УМ после энуклеации в зависимости от молекулярно-генетических аберраций.
Материал и методы
В рамках проспективного исследования с марта по декабрь 2012 г. обследованы и пролечены 30 больных УМ в возрасте от 23 до 83 лет (средний возраст 51,3 ± 12 лет), в том числе 18 (60%) женщин и 12 (40%) мужчин. Диагноз УМ устанавливали на основании клинико-инструментальных методов и подтверждали при патоморфологи-ческом исследовании. Всем больным проводили комплексное офтальмологическое обследование, включавшее визометрию, тонометрию, компьютерную периметрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, эхографию с регистрацией показателей кровотока в опухоли, по показаниям оптическую
когерентную томографию, флюоресцентную ангиографию, компьютерную томографию органов брюшной полости и рентгенографию органов грудной клетки для исключения отдаленных метастазов. По данным ультразвукового сканирования проминенция УМ варьировала от 2,6 до 13,8 мм (в среднем - 8,6 ± 2,9 мм), диаметр основания был от 8,2 до 21,9 мм (в среднем - 15 ± 3,4 мм). Во всех случаях проведена энуклеация пораженного глаза с морфологическим и молекулярно-генетиче-ским исследованием, что стало основным критерием соответствия и включения в исследование. Критерием исключения было отсутствие данных динамического наблюдения за больными.
Все клинико-морфологические исследования проведены на базе ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России, молекуляр-но-генетические - на базе лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"» (заведующий лабораторией - д-р биол. наук, профессор В.В. Носиков). От всех больных получено добровольное информированное согласие на медицинские процедуры и включение данных в последующий анализ.
По данным патогистологического исследования веретеноклеточный тип меланомы установлен у 16 (53,3%) больных, смешанноклеточный тип -у 9 (30%) и эпителиоидноклеточный - у 5 (16,7%).
Для выявления мутации в генах GNAQ/ GNA11 и полиморфизма гена ABCB1/MDR1 применяли метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Использованы нуклеотидные последовательности праймеров, описанные нами ранее [8, 9]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМТрис-HCl, рН 8,9, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 25 мМ KCl, 0,1% Тритон Х-100; 0,25 мМ каждого dNTP; 1-10 нг ДНК; 25 пмолей каждого прайме -ра; 2,0 ед. Taq-полимеразы («СибЭнзим», Россия); MgCl2 в концентрации 2,0 мМ. Амплификацию проводили по следующей программе: 95 °С, 1 мин 30 с; 35 циклов 92 °С, 15 с; 60 °С, 20 с; 72 °С, 15 с; 72 °С, 1 мин 30 с, на амплификаторе Терцик (Россия). Далее амплифицированный фрагмент ДНК подвергали обработке соответствующей рестриктазой. Проверка полноты расщепления ДНК рестриктазами осуществлялась путем расщепления 1 мкг фага лямбда за 1 час. Для продукта амплификации использовали трехкратное
количество фермента. При наличии мутантного ТТ генотипа амплифицируемый в ходе ПЦР фрагмент гена АВСВ1 размером 206 п.н. гидролизует-ся рестриктазой PctI на два фрагмента - 143 п.н. и 63 п.н. В гетерозиготном генотипе гена АВСВ1 -СТ присутствуют все 3 фрагмента. Результаты ПДРФ анализировали электрофоретически в 10% полиакриламидном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Для анализа аллельных делеций были использованы микросателлитные маркеры и прайме-ры, описанные ранее [5]. Панель включала ди-, три- и тетрамерные высокополиморфные локусы, выбранные из базы данных CHLC (Cooperative Human Linkage Center) и GDB (Genome Data Base). Перед проведением анализа ДНК была выровнена. Различие в концентрациях образцов внутри пары составляло не более 5%. ПЦР проводили аналогично описанному выше. Продукты ПЦР разделяли электрофоретически в вертикальном блоке 10-12% полиакриламидного геля в 1хТВЕ буфере при напряженности электрического поля 15 V/см. В качестве маркеров использовали ДНК плазмиды pUC19, расщепленную рестриктазой MspI, а также маркер с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Полиакриламидные гели окрашивали в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Картину электрофоретического разделения геномной ДНК наблюдали и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Потерю гетерозиготности выявляли при анализе разделенных в полиакриламидном геле продуктов ПЦР, проведенном на препаратах ДНК, выделенных из опухолевого материала и контрольной (нормальной) ткани. При анализе потери гетерозиготно-сти сравнивали интенсивность аллелей высокого и низкого молекулярного веса в соответствующих парах опухоль / норма. Случаи с уменьшением интенсивности одного из аллелей на 50% и более рассматривали как потерю гетерозиготности.
Анализ статуса метилирования промоторных районов гена RASSF1A проводили методом ме-тилчувствительного рестрикционного анализа, основанного на способности метилчувствитель-ных эндонуклеаз рестрикции оставлять негидро-лизованными участки ДНК, содержащие 5-метил-цитозин вместо цитозина. ДНК последовательно инкубировали с HpaII (CCGG) и HhaI (GCGC), метилчувствительными рестриктазами и MspI (CCGG), метилнечувствительной рестриктазой, и полученные фрагменты использовали в качестве матрицы для ПЦР. Расщепление ДНК при 37 °С рестриктазами HhaI, HpaII и MspI проводили
в буфере Y ("MBI Fermentas"). В качестве контроля сохранности ДНК (К2) использовали продукт ПЦР фрагмента экзона 1 гена RARfi2 (229 п.н.), так как этот фрагмент не содержит участков узнавания указанных рестриктаз. Полноту расщепления образцов ДНК ферментами проверяли с помощью амплификации фрагмента гена в-3А-адаптина (445 п.н.) (К1), который содержит неметилиро-ванные участки узнавания рестриктаз HpaII, HhaI (как в норме, так и в опухоли). Праймеры и условия ПЦР описаны нами ранее [10]. ПЦР проводили аналогично описанному выше. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле.
Динамическое наблюдение пациентов проводили на базе ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России, а также у офтальмолога и онколога по месту жительства пациентов. Продолжительность исследования составила 5 лет - с января 2013 по январь 2018 года. Контрольные осмотры пациентов проводили каждые 6 месяцев: очный осмотр пациентов для исключения рецидива опухоли в орбите после энуклеации (биомикроскопия, эхография и компьютерная томография полости удаленного глаза), а также контроль состояния органов-мишеней для исключения генерализации процесса (эхография или компьютерная томография органов брюшной полости, рентгенография органов грудной клетки). При неявке больного на назначенный осмотр проводили запрос данных о состоянии здоровья и/или причине смерти по месту жительства. Основной исход исследования - ассоциация выживаемости пациентов с изучаемыми молекуляр-но-генетическими изменениями, что оценивали методами анализа медицинской документации по месту жительства пациентов или данных собственного динамического наблюдения.
Настоящее исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (протокол № 8 от 24.02.2012).
Медиана наблюдения составила 61 (95% доверительный интервал (ДИ) 23,5-67) месяц. За данный период наблюдения 10 человек (Уз) погибли от метастатической болезни.
Для обработки все полученные данные были преобразованы в электронные таблицы в форматах Excel и SPSS (Statistical Package for the Social Science). Статистический анализ проводили в пакетах программы Microsoft Windows 7, IBM SPSS Statistics 23.0. Размер выборки предварительно не рассчитывался. Рассчитывались средние значения, стандартные (средние квадратичные) отклонения, медианы, 25 и 75-й процентили, максимальные и минимальные
значения; для определения вероятности развития события в процессе наблюдения применяли метод Каплана - Мейера; с помощью лог-ранк теста (х2, логарифмический ранговый тест) определяли различия развития события в двух и более исследуемых группах больных.
Результаты
Анализ выживаемости показал, что кумулятивная трехлетняя доля выживших больных УМ составила 77,8 ± 8%, а пятилетняя - 63 ± 9%. При этом средние значения времени выживания были 52,8 ± 3,9 (95% ДИ 50,5-65,9) месяца.
Анализ выживаемости больных в зависимости от статуса хромосомы 3 дал следующие результаты: больные с моносомией хромосомы 3 демонстрировали значимо более низкие показатели пятилетней выживаемости, чем больные с частичной моносомией и без потери гетерозиготности в хромосоме 3 (лог-ранк тест, х2 = 14,111, р = 0,001) (рис. 1). Всего полную моносомию хромосомы 3 определяли у 12 пациентов.
Потеря гетерозиготности в хромосоме 1р выявлена у 9 больных УМ, 4 из которых погибли от отдаленных метастазов. У остальных 6 погибших больных изменений статуса хромосомы 1р не выявлено. Кумулятивная доля выживших больных без потери гетерозиготности хромосомы 1р через 5 лет динамического наблюдения составила 66,7 ± 11%, у больных с потерей гетерозиготности в хромосоме 1р - 50 ± 18%. При этом средние значения времени выживания у больных без потери гетерозиготности хромосомы 1р и с таковой были 60,1 ± 3,13 (95% ДИ 54-66,2) и 44,8 ± 8,8 (95% ДИ 27,4-62,1) месяца соответственно. Анализ результатов выживаемости больных УМ с потерей гетерозиготности хромосомы 8р и без таковой показал, что кумулятивная доля выживших при пятилетнем наблюдении у больных без потери гетерозиготности хромосомы 8р составила 63,6 ± 0,1%, а у больных с потерей гетерозиготно-сти - 50,5 ± 0,25%. При анализе средних значений времени выживания оказалось: у больных без потери гетерозиготности хромосомы 8р этот показатель равнялся 56,1 ± 4,2 (95% ДИ 47,9-64,3) месяца, тогда как у больных с потерей гетерозигот-ности - 53,3 ± 8,8 (95% ДИ 36-70,5) месяца. Рис. 2 демонстрирует графики выживаемости больных с учетом наличия или отсутствия потери гетеро-зиготности хромосомы 1р (рис. 2А) и хромосомы 8р (рис. 2Б).
Метилирование промоторных районов гена КАББ^Л в УМ удалось выявить у 8 (26,7%) из 30 больных, при этом частота его зависела от
клинико-патоморфологических особенностей УМ. В частности, выявлена большая ассоциация частоты метилирования гена КАББ^Л у больных с веретеноклеточным типом УМ (р < 0,05). Из 10 погибших от метастазов метилирование гена КАББ^Л имелось только у 3 больных. Накопленная доля выживших при пятилетнем наблюдении у больных с наличием метилирования гена КАББ^Л составила 62,5 ± 17%, а у больных с отсутствием метилирования гена КАББРЫ - 63,2 ± 11% (р > 0,05). Как видно на рис. 3, график выживаемости демонстрирует схожие кривые выживаемости в сравниваемых группах больных.
При проведении ПДРФ-анализа мутации в генах GNAQ и ОЫА11 выявлены в большинстве исследуемых препаратов (27 больных, 90%). Из 12 больных УМ с наличием мутации в гене GNAQ (А^183) от метастатической болезни погибли 4 человека, из 18 больных без мутаций в гене GNAQ (А^183) - 6 человек. Кумулятивная доля выживших при пятилетнем периоде наблюдения у больных без мутации гена GNAQ (А^183) составила 64,7 ± 12%, тогда как у больных с мутацией данного гена этот показатель оказался ниже и был 55,6 ± 17%. Схожие результаты получены и у больных с мутацией в 5-м экзоне ^1н209) гена GNAQ. В группе больных с отсутствием мутации гена GNAQ ^Ы209) 8 человек погибли от метастатической болезни, в группе больных с выявленной мутацией в данном экзоне погибли двое. При этом кумулятивная доля выживших при отсутствии мутации в гене GNAQ ^Ы209) была 63,6 ± 10%, в то время как у больных с мутацией в означенном экзоне этот показатель составил 50 ± 25%. При отсутствии мутации в гене GNAQ
1 >
Статус хромосомы 3:
- норма полная моносомия
- частичная моносомия
+ цензурировано + цензурировано + цензурировано о норма о полная моносомия
0 -'-'-'-'-'-'-' о частичная
0 12 24 36 48 60 72 84 моносомия
Сроки наблюдения, месяцы
Рис. 1. Выживаемость больных увеальной меланомой в зависимости от фактора потери гетерозиготности в хромосоме 3 (метод оценок Каплана - Мейера)
0,2
1 9"
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0,8 0,6 0,4 0,2
0,8
Ъ 0,6
0,4
0,2
А
tu,
12 24 36 48 60 72
Сроки наблюдения, месяцы
Потеря гетерозиготности хромосомы 1р: - нет - есть + цензурировано ■ цензурировано о нет о есть
12
24 36 48 60 72
Сроки наблюдения, месяцы
Потеря гетерозиготности хромосомы 8р: - нет - есть + цензурировано цензурировано о нет о есть
Рис. 2. Выживаемость больных увеальной меланомой в зависимости от фактора потери гетерозиготности в хромосоме 1р (А) (метод оценок Каплана - Мейера, лог-ранк тест, х2 = 1,546, p > 0,05) и в хромосоме 8р (Б) (метод оценок Каплана - Мейера, лог-ранк тест, X2 = 0,174, p > 0,05)
^1п209) получены следующие средние значения для времени выживания: 54,6 ± 4,4 (95% ДИ 46-63,2) месяца, у больных с наличием мутации -62,2 ± 3,3 (95% ДИ 55,5-68,5) месяца. Анализ выживаемости не выявил значимых сторонних различий в кривых выживаемости у больных с мутациями гена gnaq (рис. 4).
Мутации гена gna11 ^ы209) установлены у половины (15 из 30) исследованных больных УМ. В группе больных без мутаций гена gna11 ^ы209) от отдаленных метастазов погибли 7 из 15 человек, в группе больных с мутацией данного гена - 3 из 15. Накопленная доля выживших у больных в группе без мутации гена gna11
ч
Метилирование гена RASSF1A:
- есть
нет
+ цензурировано + цензурировано ° есть о нет
12
24
36
48
60
72
Сроки наблюдения, месяцы
Рис. 3. Выживаемость больных увеальной меланомой в зависимости от наличия и отсутствия метилирования промоторного района гена RASSF1A (метод оценок Каплана -Мейера, лог-ранк тест, х2 = 0,052, p > 0,05)
^Ы209) составила 46,2 ± 13,8%, а в группе больных с мутацией данного гена - 76,9 ± 11,7%. При этом средние значения для времени выживания были 53,2 ± 4,8 (95% ДИ 43,7-62,6) против 58,1 ± 5,7 (95% ДИ 46,8-69,3) месяца.
Накопленные доли выживших при пятилетнем наблюдении у больных с генотипом CC и СТ полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 оказались практически одинаковы: 62,5 ± 12 и 60 ± 15% соответственно. При этом медиана выживаемости больных УМ с генотипом СС составила 56,6 ± 4,2 (95% ДИ 48,4-64,8) месяца, а с генотипом СТ - 53,3 ± 7,1 (95% ДИ 39,7-67,5) месяца. Таким образом, не выявлено статистически значимых различий в пятилетней выживаемости больных в зависимости от генотипа СС и СТ.
Обсуждение
В клетках УМ определяют хромосомные изменения, обладающие значимой прогностической ценностью у данной группы пациентов [1]. Показано, что полная потеря хромосомы 3 (моно-сомия хромосомы 3) ассоциирована со снижением пятилетней выживаемости от примерно 100% до менее 50% из-за метастазов в печень [11, 12].
Кроме того, удвоение длинного плеча хромосомы 8 (полисомия 8q) и потеря короткого плеча хромосомы 1 (моносомия 1р) достоверно коррелируют со снижением выживаемости. В одном из исследований моносомия 3 и полисомия 8q приводили к сопоставимому уменьшению выживаемости пациентов [2]. При их сочетании отмечено
Б
0
0
0
0
0
0
снижение пятилетней выживаемости до 30%. Вместе с тем и моносомия 3, и полисомия 8q связаны с другими прогностическими признаками, в частности, с большими размерами опухоли, вовлечением цилиарного тела, наличием эпи-телиоидных клеток, большим числом митозов и PAS-позитивными замкнутыми контурами [12, 13].
Аналогичные результаты описаны другими авторами. По данным M. Dogrusöz и соавт. [14], при опухолях I стадии, согласно классификации AJCC (American Joint Committee on Cancer), смертность от метастатической болезни зарегистрирована только у пациентов с моносомией хромосомы 3 и удвоением хромосомы 8q (p < 0,001). Среди пациентов с УМ II и III стадий худший витальный прогноз был при сочетании моносо-мии хромосомы 3 и удвоения хромосомы 8q, в то время как клинические результаты лечения при наличии хотя бы одной из указанных аберраций были более благоприятными (p < 0,001). Для пациентов без моносомии хромосомы 3 и удвоения хромосомы 8q отмечен лучший витальный прогноз вне зависимости от стадии заболевания. В случае моносомии хромосомы 3, удвоения хромосомы 8q или их сочетания анализ витального прогноза с учетом стадии опухоли по классификации AJCC имеет большую предиктивную значимость. Согласно данным мультивариабельного регрессионного анализа, определение стадии заболевания по AJCC и статуса хромосомы 3 и 8q имеет независимую прогностическую ценность в отношении витального статуса у больных УМ [14]. В исследовании C.L. Shields и соавт. [15] риск метастазирования при УМ ассоциирован с индивидуальным цитогенетическим профилем, при этом пятилетняя выживаемость варьирует от 96% при наличии дисомии хромосом 3, 6 и 8 до 61% среди пациентов с полной моносомией хромосомы 3, дисомией хромосомы 6 и удвоением хромосомы 8q.
В настоящей работе мы изучали статус хромосом 1, 3 и 8 в группе пациентов с УМ. Нам не удалось подтвердить роль делеций хромосом 1 и 8 в витальном статусе больных УМ. Статистически значимые различия получены только для моно-сомии хромосомы 3.
Помимо хромосомных аберраций в ряде работ определена роль метилирования промотор-ного района гена-супрессора опухолевого роста RASSF1A, локализованного на 3-й хромосоме, при УМ [10, 16]. Так, С.В. Саакян и соавт. на 30 образцах УМ показали значение данной аберрации как благоприятного прогностического фактора,
1 9-
0,8
0,6
0,4
0,2
1 <?■
0,8
0,6
0,4
0,2
1 9-
ш 0,8
§ 0,6
0,4
0,2
О-4+-
А
12 24 36 48 60 Сроки наблюдения, месяцы
Б
0 12 24 36 48 60 Сроки наблюдения, месяцы
12
24
36
48
60
Сроки наблюдения, месяцы
72
72
72
Мутация гена GNAQ (Arg183):
- нет
есть
+ цензурировано + цензурировано о нет о есть
Мутация гена GNAQ (Gln209):
- нет
есть
+ цензурировано + цензурировано о нет о есть
Мутация гена GNA11 (Gln209):
- нет
есть
+ цензурировано + цензурировано ° нет с есть
Рис. 4. Выживаемость больных увеальной меланомой в зависимости от наличия мутаций в генах GNAQ (А, Б) и вЫЛП (В) (метод оценок Каплана - Мейера, лог-ранк тест, р > 0,05)
0
0
В
0
0
ф
1 9-
0,8
0,6
0,4
0,2
Ген АВСВ1: - генотип СС генотип СТ + цензурировано + цензурировано о генотип СС о генотип СТ
12
24
36
48
60
72
Сроки наблюдения, месяцы
Рис. 5. Выживаемость больных увеальной меланомой в зависимости от генотипа СТ и СС полиморфного маркера С3435Т гена АВСВ1 (метод оценок Каплана - Мейера, лог-ранк тест, X2 = 0,043, р > 0,05)
ассоциированного с лучшим клиническим течением заболевания [10]. Однако анализ долгосрочной (5 лет и более) выживаемости не выявил статистически значимых различий между пациентами с метилированием гена RASSF1A и без такового.
Мутации в генах GNAQ или GNA11, кодирующих альфа-субъединицу О-белков, обнаружены в 86-89% первичных увеальных меланом [17, 18]. Частота мутаций в генах GNAQ/GNA11 в УМ, локализованных в хориоидее, цилиарном теле или имеющих иридоцилиохориоидальную локализацию, составляет 90% [8]. Изменения в генах GNAQ/ GNA11 описаны как миссенс-мутации (единичные аминокислотные замены) в кодо-не 183 (экзон 4) и 209 (экзон 5) соответственно. Выявление мутаций в генах GNAQ / GNA11 в доброкачественных невусах хориоидеи, включая меланоцитомы [19], и большинстве УМ независимо от витального прогноза свидетельствует о возможной триггерной роли данной аберрации в развитии УМ [20].
Определение данных мутаций, характерных именно для первичных УМ, позволяет дифференцировать метастазы УМ от других первичных опухолей. Вместе с тем в большинстве работ не установлено взаимосвязи выявленных мутаций
Конфликт интересов
Авторы статьи заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Финансирование
Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц.
с витальным прогнозом [19, 20]. В нашем исследовании мы также не выявили ассоциации мутаций в генах GNAQ / GNA11 с витальным прогнозом.
За последние годы описан целый ряд дополнительных генетических изменений, связанных с развитием и прогрессированием УМ. В частности, определено место генотипов СС и СТ полиморфного маркера С3435Т гена ABCB1/MDR1, кодирующего транспортный белок, гликопро-теин Р, играющий ключевую роль в выведении целого ряда лекарственных веществ (в том числе препараты, применяемые при лечении УМ). В работе in vivo выявлена высокая частота встречаемости предрасполагающих аллелей и генотипов полиморфного маркера ABCB1/MDR1 у больных УМ и показана ассоциация генотипа СС с высотой опухоли, беспигментными формами УМ, состоянием сосудов и неблагоприятными гистологическими типами опухоли [9]. В настоящей работе нам не удалось подтвердить взаимосвязь генотипа СС указанного гена с худшим витальным прогнозом. Полагаем: отсутствие ассоциации обусловлено как небольшой выборкой пациентов (30 человек), что представляется недостаточным для оценки роли полиморфизма гена ABCB1/MDR1, так и ролью временного фактора. В нашем исследовании мы оценивали пятилетнюю выживаемость у 30 пациентов, и, возможно, с увеличением выборки и сроков наблюдения данные о роли полиморфизма гена ABCB1/MDR1 будут иными.
Заключение
Молекулярно-генетические аберрации имеют большое значение при прогнозировании течения опухолевого процесса и определении риска гематогенного метастазирования у больных УМ. Доказана значимость выявления моносомии хромосомы 3. В связи с относительно малой выборкой (30 пациентов), а также наличием временного фактора (анализ пятилетней выживаемости) роль других молекулярно-генетических изменений не подтверждена, что требует оценки не только генетических, но и клинико-эхографических и морфологических прогностических факторов. Ф
0
0
Литература
1. Coupland SE, Lake SL, Zeschnigk M, Dama-to BE. Molecular pathology of uveal melanoma. Eye (Lond). 2013;27(2):230-42. doi: 10.1038/eye.2012.255.
2. Caines R, Eleuteri A, Kalirai H, Fisher AC, Heimann H, Damato BE, Coupland SE, Taktak AF. Cluster analysis of multiplex ligation-depen-
dent probe amplification data in choroidal melanoma. Mol Vis. 2015;21:1-11.
3. Damato BE, Heimann H, Kalirai H, Coupland SE. Age, survival predictors, and metastatic death in patients with choroidal melanoma: tentative evidence of a therapeutic effect on survival. JAMA Ophthalmol.
2014;132(5):605-13. doi: 10.1001/jamaoph-thalmol.2014.77. 4. Woodman SE. Metastatic uveal melanoma: biology and emerging treatments. Cancer J. 2012;18(2):148-52. doi: 10.1097/ PP0.0b013e31824bd256.
5. Саакян СВ, Цыганков АЮ, Амирян АГ, Логинов ВИ, Бурденный АМ. Потеря гетерозиготности на хромосомах 1, 3, 8 при увеаль-ной меланоме. Молекулярная медицина. 2018;16(2):37-40. doi: 10.29296/249994902018-02-05.
6. Isager P, Ehlers N, Overgaard J. Prognostic factors for survival after enucleation for choroidal and ciliary body melanomas. Acta Ophthalmol Scand. 2004;82(5):517-25. doi: 10.1111/j.1600-0420.2004.00330.x.
7. Triozzi PL, Eng C, Singh AD. Targeted therapy for uveal melanoma. Cancer Treat Rev. 2008;34(3):247-58. doi: 10.1016/j. ctrv.2007.12.002.
8. Саакян СВ, Амирян АГ, Цыганков АЮ, Логинов ВИ, Бурденный АМ. Мутации в онкогенах GNAQ и GNA11 у больных увеаль-ной меланомой. Молекулярная медицина. 2014;(2):34-7.
9. Саакян СВ, Амирян АГ, Цыганков АЮ, Логинов ВИ, Бурденный АМ. Ассоциация гена ABCB1 с риском развития увеальной мела-номы. Архив патологии. 2014;76(2):3-7.
10. Саакян СВ, Цыганков АЮ, Амирян АГ, Логинов ВИ, Бурденный АМ. Анализ статуса метилирования CPG-островков генов-су-прессоров опухолевого роста RASSF1A и SEMA3B при увеальной меланоме. Молекулярная медицина. 2018;16(1):51-4. doi: 10.29296/24999490-2018-01-09.
11. Coupland SE, Kalirai H, Ho V, Thornton S, Damato BE, Heimann H. Concordant chro-
References
1.Coupland SE, Lake SL, Zeschnigk M, Damato BE. Molecular pathology of uveal melanoma. Eye (Lond). 2013;27(2):230-42. doi: 10.1038/eye.2012.255.
2. Caines R, Eleuteri A, Kalirai H, Fisher AC, Heimann H, Damato BE, Coupland SE, Taktak AF. Cluster analysis of multiplex ligation-depen-dent probe amplification data in choroidal melanoma. Mol Vis. 2015;21:1-11.
3. Damato BE, Heimann H, Kalirai H, Coupland SE. Age, survival predictors, and metastatic death in patients with choroidal melanoma: tentative evidence of a therapeutic effect on survival. JAMA Ophthalmol. 2014;132(5):605-13. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2014.77.
4. Woodman SE. Metastatic uveal melanoma: biology and emerging treatments. Cancer J. 2012;18(2):148-52. doi: 10.1097/ PP0.0b013e31824bd256.
5. Saakyan SV, Tsygankov Alu, Amiryan AG, Logi-nov VI, Burdennyy AM. Loss of heterozygosity on chromosomes 1, 3 and 8 in uveal melanoma patients. Molecular Medicine. 2018;16(2): 37-40. Russian. doi: 10.29296/249994902018-02-05.
6. Isager P, Ehlers N, Overgaard J. Prognostic factors for survival after enucleation for
mosome 3 results in paired choroidal melanoma biopsies and subsequent tumour resection specimens. Br J Ophthalmol. 2015;99(10):1444-50. doi: 10.1136/bjophthal-mol-2015-307057.
12. Damato B, Eleuteri A, Taktak AF, Coupland SE. Estimating prognosis for survival after treatment of choroidal melanoma. Prog Retin Eye Res. 2011;30(5):285-95. doi: 10.1016/j.pretey-eres.2011.05.003.
13. Bronkhorst IH, Maat W, Jordanova ES, Kro-es WG, Schalij-Delfos NE, Luyten GP, Jager MJ. Effect of heterogeneous distribution of monosomy 3 on prognosis in uveal melanoma. Arch Pathol Lab Med. 2011 ;135(8):1042-7. doi: 10.5858/2010-0477-0AR1.
14. Dogrusöz M, Bagger M, van Duinen SG, Kro-es WG, Ruivenkamp CA, Böhringer S, Andersen KK, Luyten GP, Kiilgaard JF, Jager MJ. The prognostic value of AJCC staging in uveal melanoma is enhanced by adding chromosome 3 and 8q status. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(2):833-42. doi: 10.1167/iovs.16-20212.
15. Shields CL, Say EAT, Hasanreisoglu M, Saktana-sate J, Lawson BM, Landy JE, Badami AU, Sival-ingam MD, Hauschild AJ, House RJ, Daitch ZE, Mashayekhi A, Shields JA, Ganguly A. Personalized prognosis of uveal melanoma based on cytogenetic profile in 1059 patients over an 8-year period: The 2017 Harry S. Gradle lecture. Ophthalmology. 2017;124(10):1523-31. doi: 10.1016/j.ophtha.2017.04.003.
choroidal and ciliary body melanomas. Acta Ophthalmol Scand. 2004;82(5):517-25. doi: 10.1111/j.1600-0420.2004.00330.x.
7. Triozzi PL, Eng C, Singh AD. Targeted therapy for uveal melanoma. Cancer Treat Rev. 2008;34(3):247-58. doi: 10.1016/j. ctrv.2007.12.002.
8. Saakyan SV, Amiryan AG, Tsygankov AYu, Log-inov VI, Burdennyy AM. Mutations in oncogenes GNAQ and GNA11 in uveal melanoma patients. Molecular Medicine. 2014;(2):34-7. Russian.
9. Saakian SV, Amirian AG, Tsygankov Alu, Log-inov VI, BurdennyT AM. Association of the ABCB1 gene with risk for uveal melanoma. Arhiv patologii. 2014;76(2):3-7. Russian.
10. Saakyan SV, Tsygankov Alu, Amiryan AG, Logi-nov VI, Burdennyy AM. The analysis of RASSF1A and SEMA3B tumor supressor genes CPG-is-lands methylation status in uveal melanoma patients. Molecular Medicine. 2018;16(1): 51-4. Russian. doi: 10.29296/24999490-201801-09.
11. Coupland SE, Kalirai H, Ho V, Thornton S, Damato BE, Heimann H. Concordant chromosome 3 results in paired choroidal melanoma biopsies and subsequent tumour resection
16. Maat W, van der Velden PA, Out-Luiting C, Plug M, Dirks-Mulder A, Jager MJ, Gruis NA. Epigenetic inactivation of RASSF1A in uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48(2):486-90. doi: 10.1167/iovs.06-0781.
17. Van Raamsdonk CD, Griewank KG, Crosby MB, Garrido MC, Vemula S, Wiesner T, Obenauf AC, Wackernagel W, Green G, Bouvier N, Sozen MM, Baimukanova G, Roy R, Heguy A, Dolgalev I, Khanin R, Busam K, Speicher MR, O'Brien J, Bastian BC. Mutations in GNA11 in uveal melanoma. N Engl J Med. 2010;363(23): 2191-9. doi: 10.1056/NEJMoa1000584.
18. Decatur CL, Ong E, Garg N, Anbunathan H, Bowcock AM, Field MG, Harbour JW. Driver mutations in uveal melanoma: associations with gene expression profile and patient outcomes. JAMA Ophthalmol. 2016;134(7):728-33. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2016.0903.
19. Mudhar HS, Doherty R, Salawu A, Sisley K, Rennie IG. Immunohistochemical and molecular pathology of ocular uveal melanocytoma: evidence for somatic GNAQ mutations. Br J Ophthalmol. 2013;97(7):924-8. doi: 10.1136/ bjophthalmol-2013-303291.
20. Vader MJC, Madigan MC, Versluis M, Suleiman HM, Gezgin G, Gruis NA, Out-Luiting JJ, Bergman W, Verdijk RM, Jager MJ, van der Velden PA. GNAQ and GNA11 mutations and downstream YAP activation in choroidal nevi. Br J Cancer. 2017;117(6):884-7. doi: 10.1038/ bjc.2017.259.
specimens. Br J Ophthalmol. 2015;99(10):1444-50. doi: 10.1136/bjophthalmol-2015-307057.
12. Damato B, Eleuteri A, Taktak AF, Coupland SE. Estimating prognosis for survival after treatment of choroidal melanoma. Prog Retin Eye Res. 2011;30(5):285-95. doi: 10.1016/j.pretey-eres.2011.05.003.
13. Bronkhorst IH, Maat W, Jordanova ES, Kro-es WG, Schalij-Delfos NE, Luyten GP, Jager MJ. Effect of heterogeneous distribution of monosomy 3 on prognosis in uveal melanoma. Arch Pathol Lab Med. 2011;135(8):1042-7. doi: 10.5858/2010-0477-0AR1.
14. Dogrusöz M, Bagger M, van Duinen SG, Kro-es WG, Ruivenkamp CA, Böhringer S, Andersen KK, Luyten GP, Kiilgaard JF, Jager MJ. The prognostic value of AJCC staging in uveal melanoma is enhanced by adding chromosome 3 and 8q status. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(2):833-42. doi: 10.1167/iovs.16-20212.
15. Shields CL, Say EAT, Hasanreisoglu M, Saktana-sate J, Lawson BM, Landy JE, Badami AU, Sival-ingam MD, Hauschild AJ, House RJ, Daitch ZE, Mashayekhi A, Shields JA, Ganguly A. Personalized prognosis of uveal melanoma based on cytogenetic profile in 1059 patients over an
8-year period: The 2017 Harry S. Gradle lecture. Ophthalmology. 2017;124(10):1523-31. doi: 10.1016/j.ophtha.2017.04.003.
16. Maat W, van der Velden PA, Out-Luiting C, Plug M, Dirks-Mulder A, Jager MJ, Gruis NA. Epigenetic inactivation of RASSF1A in uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48(2):486-90. doi: 10.1167/iovs.06-0781.
17. Van Raamsdonk CD, Griewank KG, Crosby MB, Garrido MC, Vemula S, Wiesner T, Obenauf AC, Wackernagel W, Green G, Bouvier N, Sozen MM, Baimukanova G, Roy R, Heguy A,
Dolgalev I, Khanin R, Busam K, Speicher MR, O'Brien J, Bastian BC. Mutations in GNA11 in uveal melanoma. N Engl J Med. 2010;363(23): 2191-9. doi: 10.1056/NEJMoa1000584.
18. Decatur CL, Ong E, Garg N, Anbunathan H, Bowcock AM, Field MG, Harbour JW. Driver mutations in uveal melanoma: associations with gene expression profile and patient outcomes. JAMA Ophthalmol. 2016; 134(7):728-33. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2016.0903.
19. Mudhar HS, Doherty R, Salawu A, Sisley K, Rennie IG. Immunohistochemical and molec-
ular pathology of ocular uveal melanocytoma: evidence for somatic GNAQ mutations. Br J Ophthalmol. 2013;97(7):924-8. doi: 10.1136/ bjophthalmol-2013-303291.
20. Vader MJC, Madigan MC, Versluis M, Suleiman HM, Gezgin G, Gruis NA, Out-Luiting JJ, Bergman W, Verdijk RM, Jager MJ, van der Velden PA. GNAQ and GNA11 mutations and downstream YAP activation in choroidal nevi. Br J Cancer. 2017;117(6):884-7. doi: 10.1038/ bjc.2017.259.
Long-term survival of uveal melanoma patients after enucleation, depending on molecular genetic aberrations
V.V. Neroev1 • S.V. Saakyan1 • A.G. Amiryan1 • A.Yu. Tsygankov1 • A.M. Burdennyy2 • V.I. Loginov2 • M.R. Khlgatyan1
Rationale: In the recent years molecular genetic prognostic factors are becoming very important for predicting the course of uveal melanoma (UM). In clinical practice, molecular genetic methods are used to identify patients with a high risk of metastases. Aim: To determine the survival of UM patients after enucleation, depending on molecular genetic aberrations. Materials and methods: Thirty (30) patients with UM aged from 23 to 83 years were examined and treated. In all cases, enucleation was performed. The removed eyes underwent morphological and molecular genetic and cyto-genetic analysis (loss of heterozygocity on chromosomes 1, 3 and 8, methylation of the RASSF1A gene, mutations in GNAQ/11 genes, polymorphism of the ABCB1 gene). The median follow-up was 61 months. Results: The cumulative 3-year survival of the UM patients was 77.8 ± 8.0%, and the 5-year survival 63.0 ± 9.0%. The mean survival time was 52.8 ± 3.9 months. The patients with chromosome 3 monosomy showed significantly lower 5-year survival rates than the patients with partial monosomy and without loss of heterozygocity in chromosome 3 (log-rank test, x2 = 14.111, p = 0.001). The loss of heterozygocity on chromosomes 1 and 8, the methylation of the RASSF1A gene, the mutations in GNAQ/11 genes, and the polymorphism of the ABCB1 gene were not associated with poorer
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
vital prognosis. Conclusion: Molecular genetic aberrations play an important role in predicting the course of the tumor process and determining the risk of hematogenous metastasizing in UM patients. The significant role of chromosome 3 monosomy has been proved. Due to the relatively small cohort (30 patients) and the time factor (analysis of 5-year survival), the role of other molecular genetic changes has not been confirmed, which requires an assessment of not only genetic, but also clinical, echographic and morphological prognostic factors.
Key words: uveal melanoma, genetics, survival, molecular genetic changes, monosomy of chromosome 3, deletion of chromosome 1, deletion of chromosome 8, RASSF1A gene methylation, GNAQ/GNA11 gene mutations, ABCB1 gene polymorphism
For citation: Neroev VV, Saakyan SV, Amiryan AG, Tsygankov AYu, Burdennyy AM, Loginov VI, Khlgatyan MR. Long-term survival of uveal melanoma patients after enucleation, depending on molecular genetic aberrations. Almanac of Clinical Medicine. 2018;46(4):338-46. doi: 10.18786/2072-0505-2018-464-338-346.
Received 7 May 2018; accepted 18 June 2018
Vladimir V. Neroev - MD, PhD, Professor, Member-Correspondent of Russian Academy of Sciences, Director1
Svetlana V. Saakyan - MD, PhD, Professor, Head of Department of Ophthalmic Oncology and Radiology1
Anush G. Amiryan - MD, PhD, Leading Research Fellow, Department of Ophthalmic Oncology and Radiology1
* 14/19 Sadovaya-Chernogryazskaya ul., Moscow, 105062, Russian Federation. Tel.: +7 (495) 608 41 44. E-mail: [email protected]
Alexander Yu. Tsygankov - MD, PhD, Junior
Research Fellow, Department of Ophthalmic
Oncology and Radiology1
Alexey M. Burdennyy - PhD (in Biology), Senior
Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and
Transcriptomics2
Vitaly I. Loginov - PhD (in Biology), Leading Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics2
Mariam R. Khlgatyan - MD, Opthalmologist, Postgraduate Student, Department of Ophthalmic Oncology and Radiology1
1 Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases; 14/19 Sadovaya-Chernogryazskaya ul., Moscow, 105062, Russian Federation
2 Institute of General Pathology and Pathophysiology; 8 Baltiyskaya ul., Moscow, 125315, Russian Federation
