CC BY
28
УДК 616.24-002
С.П.ЯРКОВ1, С.И.Третьяков1, Л.А.Башарова1, А.Н.Бровкина1, В.Н.Злобин1,
И.С.Тартаковский2
ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЕЙ С ВИЗУАЛЬНОЙ И ВИДЕОЦИФРОВОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения»,
2ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Разработаны индикаторные иммунохроматографические элементы для выявления возбудителя легионеллеза в водных средах. Индикаторные элементы позволяют выявлять не менее 1-105 - 2,5-105 м.к./мл возбудителей легионеллеза первой серогруппы, что может иметь прикладное значение при идентификации выделенных культур легионелл и мониторинге объектов окружающей среды на наличие Legionella pneumophila.
Ключевые слова: иммунохроматография, индикация, Legionella pneumophila.
Legionella pneumophila - грамотрицательная бактерия, возбудитель острых тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов (5-10 %) и респираторных заболеваний. В природных условиях легионеллы являются естественными обитателями пресноводных водоемов. Присутствие L. pneumophila в воде различных объектов окружающей среды (бассейнов, аквапарков, градирен электростанций, системах кондиционирования воздуха и коммунального водоснабжения в период сезонных профилактических работ) в концентрации 1-104 м.к./л и выше является колонизацией данного объекта легионеллами и представляет эпидемическую опасность, требующую дезинфекционных и профилактических мероприятий. Проведение мониторинга объектов окружающей среды на наличие L. pneumophila позволит определить степень их контаминации возбудителем и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения [2].
L. pneumophila занимает особую нишу среди возбудителей атипичных пневмоний как «агент техногенной инфекции», в настоящее время увеличивается число выявляемых случаев и эпидемических вспышек, что определяет актуальность совершенствования методов диагностики и индикации этого возбудителя [3]. Известно около 50 видов легионелл, из которых собственно болезнь легионеров вызывает вид L. pneumophila, насчитывающий 16 серогрупп. Причем более 80 % случаев заболевания вызывают штаммы 1 серогруппы. Существующие микробиологические методы диагностики обладают высокой стоимостью и длительны в исполнении (7-10 сут). Для быстрой идентификации бактерий используют латекс-агглютинацию, реакцию непрямой гемагглю-тинации (РНГА), метод флуоресцирующих антител (МФА), либо полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В настоящее время все большее внимание уделяется иммунохроматографическим методам, которые отве-
чают критериям экспресс-анализа и получили широкое распространение в мире [1, 4, 6]. В нашей стране иммунохроматографические средства выявления возбудителей болезни легионеров до недавнего времени отсутствовали. Ранее нами были опубликованы предварительные данные по разработке колориметрического иммунохроматографического анализа для выявления возбудителя легионеллеза с помощью индикаторных иммунохроматографических элементов (ИИХЭ) на основе коллоидного золота [5].
Целью настоящей работы явилось исследование возможности использования иммунохроматографи-ческого анализа с визуальной и видеоцифровой детекцией для выявления возбудителя легионеллеза в водных средах.
Материалы и методы
Использовали ИИХЭ для выявления возбудителя болезни легионеров первой серогруппы, разработанные авторами во ФГУП «ГосНИИ БП» Федерального медико-биологического агентства. Общий принцип построения индикаторных иммунохроматографиче-ских элементов описан в [1]. В ИИХЭ для выявления легионелл использовал принцип «сэндвич-анализа». Для формирования аналитической зоны иммунохро-матографической мембраны и получения конъюгатов с коллоидным золотом применяли моноклональные мышиные антитела 2F10, 5F4 к полисахаридным (липополисахаридным антигенам) легионелл первой серогруппы, производства ООО «Импакт» (Москва). В контрольной зоне аналитической мембраны ИИХЭ использовали кроличьи антимышиные иммуноглобулины (Sigma). Полученную аналитическую мембрану компоновали в мультимембранный композит, содержащий подложки для впитывания образца, для нанесения образца, для нанесения конъюгата коллоидного золота с моноклональными антителами. Затем, мультимембранный композит резали на по-
лоски размером 5^60 мм и помещали в пластиковые оправы, снабженные отверстиями для нанесения образца и для наблюдения окрашенных зон на нироцел-люлозной мембране.
В качестве модельных систем в работе использовали легионеллы из коллекции микробных культур национальной референс-лаборатории по легионеллезу ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН: L. pneumophila Sg1-Philadelphia-1, L. pneumophila Sg1-Pyshma-1, L. pneumophila Sg1-Bellingham-1, L. pneumophila Sg1-Flint-1, L. pneumophila Sg1-Pyshma-2, L. pneumophila Sg6-Chicago-2, L. pneumophila Sg8-Concord-3, L. anisa WA-316-C3, L. longbeachae Sg1-Long Beach-4, L. gra-tiana Pyshma-7.
Готовили бактериальную суспензию клеток леги-онелл в концентрации, соответствующей 10 единицам стандартного образца мутности ГИСК им. Л.А.Та-расевича (ОСО 42-28-59-86П), что эквивалентно 1,0-109 м.к./мл рода Legionella. Приготовленную микробную взвесь инактивировали прогреванием на водяной бане при 80 °С в течение 30 мин.
Для определения специфической активности (чувствительности) ИИХЭ готовили разведения соответствующих клеток в буфере анализа (БА) в диапазоне концентраций 2,5-104 - 1-107 м.к./мл. В ИИХЭ пластиковой пипеткой вносили по каплям приготовленные суспензии легионелл, всего четыре капли (около 120 мкл) с интервалами 30-45 с. В качестве отрицательного контроля использовали БА без добавления биологического материала. Результаты регистрировали спустя 25 мин после внесения первой капли.
Для изучения специфичности ИИХЭ использовали образцы, содержащие культуры клеток легио-нелл L. pneumophila других серогрупп L. pneumophila Sg6-Chicago-2, L. pneumophila Sg8-Concord-3, другие виды легионелл L. anisa WA-316-C3, L. longbeachae Sg1-Long Beach-4, L. gratiana Pyshma-7, а также псевдомонады, стафилококки и клебсиеллы, входящие в состав биопленок, в которых живут Legionella. Культуры клеток использовали в концентрации
1-107 м.к./мл. Исследование проводили таким же образом, как и при изучении чувствительности.
Регистрацию аналитического эффекта ИИХЭ проводили как визуально, так и с помощью компьютерной программы «Видеотест» и отечественного видеоцифрового регистратора иммунохроматограмм «Рефлеком», внесенного в государственный реестр средств измерений России [4]. Прибор регистрировал величину окрашивания конъюгатом аналитической и контрольной зон ИИХЭ в относительных единицах и позволял документировать результаты анализа в виде электронных файлов или бумажных распечаток.
Положительным результатом, после нанесения образца, считали появление в аналитической зоне ИИХЭ различимой глазом окрашенной полосы красного цвета, что соответствовало показаниям прибора «Рефлеком» не менее (0,9±0,2 отн.ед. и появление окрашенной полосы в контрольной зоне. При нанесении отрицательного контроля, или гетерологичных микроорганизмов, на поверхности аналитической мембраны ИИХЭ появлялась одна окрашенная полоса в контрольной зоне. При этом интенсивность окрашивания, измеренная прибором, контрольной зоны была 2,0-3,6 отн. ед., а интенсивность окрашивания аналитической зоны не превышала 0,1 ±0,1 отн. ед. Измерения для каждой концентрации микробных клеток и отрицательных контролей проводили пятикратно, вычисляли среднее арифметическое показаний прибора. Среднеквадратическое отклонение при 95 % доверительной вероятности не превышало 0,2 отн. ед.
Результаты и обсуждение
Специфическая активность (чувствительность) и специфичность по отношению к легионеллам других серогрупп, для разработанных ИИХЭ, приведены в табл. 1 и 2. Для удобства нами была предложена шкала оценки интенсивности окраски аналитической и контрольной зон ИИХЭ при визуальном наблюдении оператором:
отрицательный результат анализа (-), в образ-
Таблица 1
Чувствительность ИИХЭ для выявления возбудителя болезни легионеров 1-й серогруппы на легионеллах первой серогруппы
Наименование культуры легионелл Концентрация клеток, м.к./мл
0 2,5-104 5104 1105 2,5-105 5105 1106 1107
L. pneumophila Sg1-Philadelphia-1 + ++ +++ +++ +++
(0/2,5) (0,3/2,1) (0,4/2,4) (1,3/2,4) (1,6/2,2) (2,7/2,4) (4,6/2,1) (7,6/4,1)
L. pneumophila Sg1-Pyshma-1 + ++ ++ +++ +++
(0/2,0) (0,4/2,5) (0,6/2,5) (0,7/2,4) (2,1/2,3) (3,0/2,6) (5,4/2,9) (10,8/2,6)
L. pneumophila Sg1-Bellingham-1 + + ++ +++ +++
(0/2,3) (0,3/2,5) (0,6/2,3) (0,8/2,7) (1,1/2,9) (2,9/3,1) (5,7/1,8) (11,9/2,1)
L. pneumophila Sg1-Flint-1 + ++ +++ +++
(0/2,5) (0,4/2,3) (0,5/2,1) (0,6/3,2) (0,9/3,2) (3,2/2,1) (4,9/8,6) (9,4/8,3)
L. pneumophila Sg1-Pyshma-2 + ++ +++ +++
(0/3,0) (0/1,9) (0/2,3) (0,3/3,4) (1,1/2,3) (2,0/3,2) (3,4/2,2) (9,5/2,9)
Здесь и в табл. 2. В верхней строке ячеек таблицы приведены данные визуальной оценки концентрации оператором, в скобках дана интенсивность окрашивания «аналитической зона/контрольная зона», измеренная прибором «Рефлеком», в отн. ед.; «н.д.» - нет данных.
Таблица 2
Перекрестные реакции ИИХЭ для выявления возбудителя болезни легионеров 1-й серогруппы с разными видами легионелл
Наименование культуры легионелл Концентрация клеток, м.к./мл.
G 2,5^104 5^104 11G5 2,5-Ю5 51G5 11G6 11G7
L. pneumophila, другие серогруппы
L. pneumophila Sgб-Chicago-2 (G/3,G) н.д. н.д (G/2,4) (G/2,5) (G/1,8) (G/3,6) (G/2,4)
L. pneumophila Sg8-Concord-3 (G/2,G) н.д. н.д (G/2,6) (G,1/2,1) (G/2,2) (G/3,5) (G,1/2,1)
Легионеллы других видов, псевдомонады, стафилококки и клебсиеллы
L. anisa WA^^^ (G/2,4) н.д. н.д (G/1,8) (G/2,4) (G/2,2) (g/2,6) (G/2,4)
L. longbeachae Sg1-Long Beach-4 (G/2,7) н.д. н.д (G/2,3) (G/2,2) (G/2,4) (G/3,G) (0/2,6)
L. gratiana Pyshma-7 (G/3,1) н.д. н.д (G/2,5) (G/2,G) (G/2,7) (G/2,G) (0/3,1)
Klebsiella spp. (G/1.9) н.д. н.д. (G/1,9) (G/2,3) (G/2,G) (G/2,5) (0/2,3)
St. aureus (G/2,2) н.д. н.д. (G/2,3) (G/2,2) (G/2,3) (0/3,1) (G/2,5)
Ps. aeruginosa (G/2,G) н.д. н.д. (G/2,5) (G/2,G) (G/2,8) (0/2,1) (0/3,0)
це отсутствуют или находятся в концентрации ниже порога чувствительности клетки L. pneumophila Sg1 - отсутствие окрашенной линии в аналитической зоне;
положительный результат анализа (+), в образце присутствуют клетки L. pneumophila Sg1 - слегка заметная окрашенная линия в аналитической зоне, (++) - хорошо заметная окрашенная линия в аналитической зоне, (+++) - интенсивная окрашенная линия в аналитической зоне. Визуальная оценка результатов иммунохроматографического анализа, в целом, кореллировала с показаниями прибора «Рефлеком», и как видно из табл. 1, градация визуальной шкалы (+) соответствовала 1-105 м.к./мл и 2,5-105 м.к./мл для различных штаммов L. pneumophila первой серо-группы. Применение видеоцифрового метода анализа не увеличило в данном случае чувствительности обнаружения легионелл, по сравнению с визуальным наблюдением результата оператором. Однако, по нашему мнению, видеоцифровой метод позволяет уменьшить такие факторы субъективности при оценке результата человеком, как освещенность рабочего места, усталость оператора или индивидуальные особенности восприятия цветов и насыщенности линий иммунохроматограммы
По чувствительности иммунохроматографи-ческий метод анализа не уступает иммуносуспен-зионным методам и МФА, но значительно выигрывает по времени анализа (в несколько раз быстрее), простоте и технологичности постановки анализа. Индикационный эффект наблюдался для легионелл первой серогруппы при наличии в пробе объемом 120 мкл, наносимой на индикаторный элемент, 1230 тыс. м.к.
Помимо высокой чувствительности, сравнимой с чувствительностью РНГА и МФА, ИИХЭ для вы-
явления возбудителей болезни легионеров первой серогруппы обладали высокой специфичностью по отношению к легионеллам других серогрупп, а также по отношению к гетерологичным микроорганизмам (Klebsiella spp, St. aureus, Ps. aeruginosa), взятым в концентрации 1-107 м.к./мл (табл. 2), т.е. в стократном избытке по сравнению с минимально выявляемой концентрацией легионелл первой се-рогруппы.
При анализе водных проб, взятых из водоемов, необходимо предварительное физическое концентрирование и микробиологическое культивирование [2], т.к. исходная концентрация легионелл находится ниже предела чувствительности иммунохимических методов при проведении анализа без пробоподго-товки. Однако высокая специфичность, простота процедуры и малое время (20-25 мин) собственно иммунохроматографического анализа являются определенным преимуществом при санитарногигиенических анализах воды.
Короткое время анализа, отсутствие дополнительных технологических операций (промывка, инкубация, дозированное внесение реагентов) визуальная и приборная регистрация позволяют рассматривать иммунохроматографический анализ возбудителя легионеллеза как перспективный метод для внелабора-торной индикации и идентификации этого патогена, при мониторинге объектов окружающей среды на наличие патогенных штаммов L. pneumophila.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бызова Н.А., Ярков С.П., Злобин В.Н. и др. Разработка иммунохроматографического экспресс-теста для выявления микроальбуминурии. Физиология и патология иммунной системы. 2005; 8:41-5.
2. Онищенко Г.Г. Методические указания по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. МУК 4.2. 2217-07. М.; 2007
б3
3. Тартаковский И.С. Возбудители атипичных пневмоний: роль в этиологической структуре пневмоний и особенности лабораторной диагностики. Клин. микробиол. и антимикробная химиотерапия. 2003; 5:9-17.
4. Ярков С.П., Третьяков С.И., Башарова Л.А., Злобин В.Н. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа. Вестник РАМН. 2007; 12:22-6.
5. Ярков С.П., Третьяков С.И., Башарова Л.А., Тартаковский И.С., Карпова ТИ., Дронина Ю.Е. Разработка технических средств иммунохроматографического анализа для выявления возбудителя легионеллеза. Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф. Волгоград; 2008. С. 160-1.
6. King D.V., Luna V., Cannons A., Cattani J., Amoso P. Performance assessment of three commercial assays for direct detection of Bacillus anthracis spores. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 3454-5.
Об авторах:
Ярков С.П., Третьяков С.И., БашароваЛ.А., Бровкина А.Н., Злобин В.Н. Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения. 125424, Москва, Волоколамское шоссе, 75, к. 1. Тел./факс: 491-73-72. E-mail: niibp@dol.ru
Тартаковский И.С. Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18. E-mail: info@riem.ru
S.P.Yarkov, S.I.Tret'yakov, L.A.Basharova, A.N.Brovkina, V.N.Zlobin, I.S.Tartakovskiy
Legionellosis Agent Indication Using Immunochromatography with Visual and Digital Video Detection
State Research Institute of Biological Instrumentation, Moscow;
N.F.Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow
Proposed was the immunochromatographic express-test for legionellosis agent detection in water environment. The method is high-sensitive and specific allowing to detect only first serogroup of legionellosis agent. That is of high importance for identification of isolated cultures of legionella and monitoring of Legionella pneumophila presence in environment objects.
Key words: immunochromatography, indication, Legionella pneumophila.
Authors:
Yarkov S.P., Tret'yakov S.I., Basharova L.A., Brovkina A.N., Zlobin V.N. State Research Institute of Biological Instrumentation. 125424, Moscow, Volokolamskoe Shosse, 75, B. 1. E-mail: niibp@dol.ru
Tartakovskiy I.S. N.F.Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology. 123098, Moscow, Gamaleya St., 18. E-mail: info@riem.ru
Поступила 24.04.09.
