Выявление трофических потребностей Fusarium sambucinum для синтеза белковых веществ в условиях жидкофазного глубинного культивирования Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Серия 4. Химическое машиностроение и инженерная экология человеческого фактора, упростить сравнение результатов экспериментов.

Литература

1. Парамонов Е.А., Зубов Д.В. Применение компьютерной обработки изображения для повышения точности анализа методом тонкослойной хроматографии // Инженерная физика. - 2008 №4 - с.53-58.

Выявление трофических потребностей Fusarium sambuoinum для синтеза белковых веществ в условиях жидкофазного глубинного культивирования

Неманова Е.О., к.т.н. Русинова Т.В., к.б.н. доц. Горшина Е.С., д.т.н. проф. Бирюков В.В.

Университет машиностроения 8(499)267-12-06

Аннотация. В статье определены источники углерода (глюкоза, мальтоза) и азота (NH4NO3, (NH4)2SÜ4), наиболее эффективно обеспечивающие синтез белковых веществ штаммом-продуцентом в условиях жидкофазного глубинного культивирования. Выбрано основное сырье для разработки технологии получения высокобелковой биомассы на основе Fusarium sambucinum шт. D-104.

Ключевые слова: микопротеин, жидкофазное глубинное культивирование, сырой протеин, Fusarium sambucinum.

Одними из наиболее востребованных объектов современной пищевой биотехнологии являются грибные штаммы продуценты. Сочетание технологических преимуществ, широкого спектра синтезируемых метаболитов, а также отсутствия токсичности делает возможным получение целого ряда различных биотехнологических продуктов на их основе. Одним из таких продуктов является микопротеин (пищевая биомасса мицелиальных грибов, полученная методом жидкофазного глубинного культивирования) на основе Fusarium sambucinum шт. D-104. Высокая пищевая ценность микопротеина и ряд фармакологических свойств позволяют отнести этот продукт к разряду продуктов здорового питания.

Основным сдерживающим фактором в разработе промышленной технологии получения микопротеина на основе Fusarium sambucinum шт. D-104 является отсутствие научных основ направленного биосинтеза высокобелковой биомассы сложным эукариотическим организмом.

Принципиальное значение для синтеза белковых веществ и накопления биомассы штаммом-продуцентом имеет характер источников углеродного и азотного питания. В связи с этим целью данной работы являлось изучение влияния различных источников углерода и азота на синтез белковых веществ и накопление биомассы F. sambucinum шт. D-104 в условиях жидкофазного глубинного культивирования.

Материалы и методы В работе использовали штамм Fusarium sambucinum Fuck.var. ossicolum (Berk. et Curt.) Bilai шт. D-104, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161 (заявка на патент РФ № 2012138568) [1].

При расчете состава сред в экспериментах по изучению утилизации различных источников углерода и азота использовали эквивалентные по углероду количества сахаров и эквивалентные по азоту количества азотистых соединений в соотношении C : N = 8 : 1 [2].

Влияние источника углерода на рост и накопление биомассы и белковых веществ в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл следующего состава (г/л): NH4NO3 - 3,0; KH2PO4 - 1,2; MgSÜ4-7H2Ü - 0,2; ZnSÜ4-7H2Ü - 0,01; тиамин - 100у; рН = 5,6 - 5,8. В качестве источников углерода в экспериментах сравнивали глюкозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, ксилозу, галактозу, раффинозу, лактозу. Влияние источников

Серия 4. Химическое машиностроение и инженерная экология углерода на рост штамма-продуцента оценивали на 40ч эксперимента, что соответствовало началу стационарной фазы роста культуры.

Влияние источника азота на рост и накопление биомассы и белковых веществ в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; KH2PO4 - 1,2; MgSO4^O - 0,2; ZnSO4^O - 0,01; тиамин - 100у; рН = 5,6 - 5,8. В качестве источников азота в эксперименте сравнивали KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, (NHi)2HPO4, NH4Q, кукурузный экстракт. При расчете количества источников азота учитывали как нитратную, так и аммонийную формы.

Количество посевного материала составляло 10 % по объему. Культивирование прово-

о

дили при температуре 28 С на круговой качалке (170 об/мин).

Влияние основного углеродного субстрата на рост штамма-продуцента в глубинных условиях изучали в конических колбах V=250 мл с объемом среды 100 мл. Для крахмалсодержащих субстратов состав среды (г/л): углеродный субстрат - 20,0; KH2PO4 - 1,2; NH4NO3 - 3,0; кукурузный экстракт - 10; рН = 5,6 - 5,8. Для среды с мелассой (г/л): меласса свекловичная - 50

(2% по РВ); KH2PO4 - 1,2; NH4NO3 - 3,0; рН = 5,6 - 5,8. Количество посевного материала со-

о

ставляло 10 % по объему. Культивирование проводили при температуре 28 С на круговой качалке (170 об/мин).

Накопление биомассы определяли весовым способом в пересчете на абсолютно сухую массу (АСМ). Последнюю определяли после высушивания образцов в стеклянных бюксах до постоянного веса при 105 оС.

Массовую долю сырого протеина в биомассе определяли по методу Къельдаля по ГОСТ 28178-89.

о <

55

У ^

«Г 4° _I_

50

О <

40

■ 35

о а. с >s о а.

и

30

25

■ Накопление биомассы штамма-продуцента ■ Выход сырого протеина □ Содержание сырого протеина

Рисунок 1. Влияние источника углерода на рост и накопление белковых веществ

Fusarium sambueinum шт. D-104

Влияние источника углерода

Мицелиальные грибные штаммы-продуценты способны утилизировать различные источники углеродного питания [2], в том числе и олиго- и полисахариды. Опыт по изучению зависимости накопления биомассы и белковых веществ штаммом был проведен с использованием широкого спектра источников углерода, моделирующих основные виды сырья.

Согласно полученным данным (см. рисунок 1), наиболее интенсивно рост штамма-

продуцента происходит на среде с глюкозой, фруктозой, ксилозой, сахарозой. Менее перспективными в этом отношении являются раффиноза, мальтоза, галактоза, лактоза.

Характер синтеза белковых веществ штаммом несколько отличался от накопления биомассы. Наибольшее содержание сырого протеина было отмечено на среде с глюкозой (52,1% на АСМ), сахарозой (49,9% на АСМ), ксилозой (48,9% на АСМ) и мальтозой (51,9% на АСМ). Содержание сырого протеина на среде с фруктозой, обеспечившей высокое накопление биомассы, напротив, составило 48,3% на АСМ.

Таблица 1.

Влияние источника углерода на рост и накопление белковых веществ Fusarium sambucinum шт. D-104

Углеродный субстрат Накопление биомассы, г-л-1 АСМ Содержание сырого протеина, % на АСМ

Глюкоза 9,7 ± 0,24 52,1 ± 1,3

Фруктоза 9,7 ± 0,24 46,2 ± 1,1

Мальтоза 9,1 ± 0,23 51,9 ± 1,3

Сахароза 9,5 ± 0,24 49,9 ± 1,2

Ксилоза 9,6 ± 0,24 48,9 ± 1,2

Лактоза 1,8 ± 0,05 29,9 ± 0,7

Галактоза 8,4 ± 0,21 44,9 ± 1,1

Раффиноза 9,2 ± 0,23 46,9 ± 1,1

Контроль 0,6 ± 0,01 28,0 ± 0,7

Таким образом, для обеспечения накопления высокобелковой биомассы штаммом-продуцентом предпочтительно использовать среды, содержащие в качестве основного углевода глюкозу и/или мальтозу. Использование сырья с сахарозой в качестве основного источника углерода возможно, но не позволяет в максимальной степени реализовать возможности штамма. Очевидно, что меласса, содержащая сахарозу, долна быть замена. Из промышленного сырья, содержащего глюкозу и мальтозу, можно рекомендовать как наиболее доступное и дешевое крахмалосодержащее сырье, в том числе различные виды крахмалов и муки.

Выбор основного сырья

С целью замены неперспективного для производства пищевого продукта сырья - мелассы, рекомендованной по старой технологии, провели изучение влияния различных крах-малсодержащих субстратов на рост штамма-продуцента. Эффективность субстратов оценивали по накоплению биомассы на 24 ч эксперимента.

Согласно полученным данным, штамм-продуцент активно утилизирует все изученные виды крахмалсодержащего сырья, при этом наиболее перспективными для данного продуцента являются мука кукурузная, мука тритикале и крахмал пшеничный. Экспериментально установлено, что продуктивность штамма на крахмалсодержащем сырье (9,5 - 10 г-л-1-сут-1) превышает данный показатель на среде с мелассой (8г-л-1-сут-1).

Рисунок 2. Влияние различных углеродных субстратов на рост Fusarium sambucinum шт. D-104 в глубинной культуре

Влияние источника азота

Считается, что значительная часть грибных штаммов-продуцентов не способна утилизировать нитратный азот [3]. Предварительным этапом нашего исследования являлось установление возможности штамма-продуцента использовать нитратный азот в качестве единственного источника азота. С целью исключения влияния других форм азота на рост штамма-продуцента в глубинной культуре посевной материал для проведения эксперимента получали путем трехкратного пересева культуры на синтетическую агаризованную питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота KNO3, с дальнейшим пересевом на жидкую питательную среду, содержащую также в качестве единственного источника азота KNO3.

Источники азота

Рисунок 3. Влияние источника азота на рост Fusarium sambucinum шт. D-104

В результате проведения эксперимента было установлено, что культура активно усваивает как аммонийную, так и нитратную формы азота (см. рисунок 3).

Для ряда штаммов мицелиальных грибов для накопления биомассы наиболее предпочтительными являются органические источники азота [4, 5, 6]. В случае Fusarium sambucinum шт. D-104 нами показано, что для накопления биомассы органические формы азота не являются более предпочтительными. Наиболее эффективно рост культуры происходит на средах с NH4NO3, KNO3 и кукурузным экстрактом.

Отмечено также, что использование в качестве единственного источника азота всех аммонийных солей, за исключением NH4NO3, приводит к закислению питательной среды (до значения рН 2,2-3,0) в процессе их утилизации и препятствует росту штамма.

Поскольку синтетическая среда не обладает собственной буферной емкостью, применение данных минеральных солей в качестве источников азота возможно только в условиях рН-статирования.

Следующая серия экспериментов была проведена в режиме рН-статирования 4,0. Результаты представлены на рисунке 4.

Источники азота

■ Накопление биомассы ■ Выход сырого протеина еэ Сьрой протеин

Рисунок 4. Влияние источника азота на рост Fusarium sambucinum шт. D-104

в режиме рН-статирования 4,0

Согласно полученным данным (см. рисунок 4), наличие режима рН-статирования, исключающее возможность закисления ферментационной среды, во всех изученных вариантах способствует активному росту культуры. Наиболее активно рост культуры происходит на средах с NH4NO3 (12,9 гл-1 АСМ) и (NHO2SO4 (13,0 гл-1 АСМ).

Таким образом, в результате экспериментальных исследований установлено, что для синтеза белковых веществ Fusarium sambucinum шт. D-104 в условиях жидкофазного глубинного культивирования наиболее предпочтительными в качестве источников углерода являются глюкоза и мальтоза, в качестве источников азота - NH4NO3 (NH02SO4.

Литература

1. Патент Российская Федерация, С12 N1/14, C12 P21/00, C12 R1:645. Штамм Fusaruim sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы/ Горшина Е.С., Неманова Е.О., Русинова Т.В., Бирюков В.В.; заявитель и патентообладатель Университет машиностроения. - Заявка 2012138568, заявл. 10.09.2012.

2. Морозова Г.Р., Высоцкий В.Г., Сафонова Н.В., Мамаева Е.М. Промышленное получение мицелия высших грибов.- М.: ОНТИТЭИ Микробиопром, 1978.- 56 с.

3. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре - Киев: Наукова думка, 1988. - 144с.

4. Petre M. Biotechnology of mushroom pellets producing by controlled submerged fermentation/ M. Petre, A. Teodoescu, E. Tultca, C. Bejan, A. Andronescu//Romanian Biotechnolog-ical Letters. - 2010. - V. 15. -№ 2. - P. 50 - 56

5. Joo JH. Optimization of submerged culture conditions for exopolysaccharide production in Sarcodon aspratus (Berk) S.lto TG-3/ J.H. Joo, J.M. Lim, H.O. Kim, S.W. Kim, H.J. Hwang, J.W. Choi and J.W. Yun // World Journal of Microbiology and Biotechnology. -2004. -Volume 20. -pp.767-773.

6. Malinowska E. Improved simultaneous production of mycelial biomass and polysaccarides by submerged culture of Hericium erinaceum: optimization using a central composite rotat-able design (CCRD) / E. Malinowska, W. Krzyczkowski, G. Lapienis, F. Herold // J Ind Microbiol Biotechnol. -2009. -Volume 36. - pp. 1513-1527.

Анализ надежности оборудования для переработки отходов производства и потребления композиционных слоистых упаковочных материалов

к.т.н. Гонопольский А.А.

Университет машиностроения gonopol85@mail.ru

Аннотация. В статье проанализированы вероятностные характеристики отказов оборудования для переработки отходов многослойной упаковки, созданного по государственному контракту №14.527.12.0023 «Разработка комплексной опытно-промышленной технологии рециклинга отходов производства и потребления композиционных слоистых упаковочных материалов». На основании результатов подконтрольной эксплуатации опытно-промышленной технологической линии и расчетов распределений плотности вероятности отказов, определено наименее надежное оборудование и показаны возможные меры организационного характера (корректировке графика ППР) по снижению количества отказов.

Ключевые слова: надёжность технологического оборудования, технология рециклинга отходов, многослойная упаковка.

Надежность оборудования является основой экологической безопасности производства, поскольку в случае аварии возникает вероятность загрязнения окружающей среды вредными компонентами. Для предприятий по переработке отходов это актуально еще и потому, что в случае длительной остановки линии (цеха, завода) практически всегда встает вопрос о том, где тогда перерабатывать и утилизировать отходы, поскольку прекратить их образование невозможно. Поэтому отсутствие жизнеспособной системы сбора, переработки и утилизации отходов может привести к серьезному ухудшению экологической обстановки в городе. А для того, чтобы такая система работала необходимо учитывать надежностные характеристики используемого оборудования, поскольку именно они определяют работоспособность каждого предприятия и системы в целом.

Помимо возможного негативного воздействия на окружающую среду при возникновении отказов нельзя не учитывать и экономические потери: затраты на ремонт и замену деталей, недополученная прибыль и т. д.

Технологическая схемы комплексного технологического процесса рециклинга отходов производства и потребления композиционных слоистых алюминированных упаковочных материалов представлена на рисунке 1.