CC BY
44
УДК 619:616.98:578:831.31:616-078
Ключевые слова: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, штамм «КПР», реакция нейтрализации, реакция микронейтрализации, сыворотка крови свиней
Key words: porcine reproductive and respiratory syndrome virus, «KPR» strain, neutralization test, micro-neutralization test, porcine blood serum
Пузанкова О. С., Гаврилова В. Л., Шевцов А. А., Баборенко Е. П., Кондакова Ж. С.
ВЫЯВЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ РРСС С ПОМОЩЬЮ РМН
DETECTION OF SPECIFIC ANTIBODIES AGAINST PRRS VIRUS USING MICRONEUTRALIZATION TEST
ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Владимирская область, г. Владимир, мкр. Юрьевец
FGI «Federal Centre for Animal Health» Address: Vladimirskaya region, Vladimir, mikrorayon Yuryevets
Пузанкова Ольга Сергеевна, к.в.н., ст. научный сотрудник
Puzankova Olga S., Ph.D. in Veterinary Science, Senior Research Scientist Гаврилова Вера Львовна, к.б.н., научный сотрудник Gavrilova Vera L., Ph.D. in Biology Science, Research Scientist Шевцов Александр Анатольевич, к.в.н., зав. лабораторией болезней свиней Shevtsov Alexander A., Ph.D. in Veterinary Science, Head of Laboratory for Porcine Diseases Баборенко Елена Павловна, к.б.н., ст. научный сотрудник Baborenko Yelena P., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Scientist Кондакова Жанна Сергеевна, ведущий биолог / Kondakova Zhanna S., Leading Biologist
Аннотация. В статье приведены результаты разработки методических рекомендаций по выявлению антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции микронейтрализации с использованием перевиваемой культуры клеток MARC-145 и вируса РРСС штамма «КПР» с титром 5,0 lg ТЦД50/см3. Summary. The paper presents the results of methodical instruction development for detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus by microneutralization test using MARC-145 continuous cell culture and PRRS virus «KPR» strain with a titer of 5.0 lg TCDJsm3.
Введение
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) характеризуется поздними абортами, преждевременными опоросами, прохолостами у свиноматок, рождением мертвых или нежизнеспособных, а также гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у свиней разных возрастных групп [6]. Заболевание наносит большой экономический ущерб в странах с развитым свиноводством, поэтому важно своевременно поставить диагноз и провести противо-эпизоотические мероприятия.
Для обнаружения антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней используют различные реакции, в том числе иммуноперок-сидазный метод анализа (ИПМА), непрямую реакцию иммунофлюоресценции (НРИФ), иммуноферментный анализ (ИФА) [1, 6]. Эти реакции сложны и требуют использования импортных компонентов. Реакция ней-
трализации (РН) и ее модификация (реакция микронейтрализации, РМН) также используются для серологической диагностики РРСС и ставятся с компонентами, полученными в условиях лаборатории. Однако литературные данные говорят о том, что эта реакция недостаточно чувствительна [5, 7].
Целью настоящей работы являлась модификация реакции нейтрализации с использованием монослоя клеток перевиваемой культуры клеток MARC-145, выращенной в лунках микропланшетов, а также повышение чувствительности РМН за счет добавления к смеси вирус-сыворотка инактивиро-ванной негативной сыворотки крови свиней.
Материалы и методы
Вирус. Для разработки РМН использовали вирус РРСС, штамм «КПР», полученный из сывороток крови, отобранных от абортировавших свиноматок, доставленных из кол-
хоза «Победа» Ленинск-Кузнецского района Кемеровской области в 1996 г., серийными последовательными пассажами на 3-суточ-ной перевиваемой культуре клеток МАКС-145. Титр вируса РРСС, штамм «КПР», 7 пассажа в перевиваемой культуре клеток МАКС-145 составлял 5,0 ^ ТЦД50/см3. Штамм «КПР» вируса РРСС был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов (ФГУ «ВГНКИ»), используемых в ветеринарии и животноводстве, и предложен в качестве производственного.
Сыворотки крови свиней. При разработке РМН в качестве референтных позитивных сывороток использовали сыворотки крови свиней, иммунизированных вакциной против РРСС, с титрами не ниже 5,0 log2. В качестве негативных сывороток использовали сыворотки крови свиней, полученные из благополучных по РРСС хозяйств. Сыворотки крови свиней в нативном виде хранили при температуре не выше -20 °С.
Все референтные и исследуемые сыворотки крови свиней разводили питательной средой Игла в соотношении 1 : 2 и инактивиро-вали в водяной бане при температуре 58 °С в течение 30 минут. Данные сыворотки крови свиней в необходимом объеме использовали для постановки реакции микронейтрализации, а остаточный объем разведений сывороток крови помещали на хранение в течение 10-15 дней (срок наблюдения) в холодильник при температуре +4 °С с целью визуального контроля на стерильность.
Культура клеток и питательная среда. Для культивирования вируса РРСС использовали перевиваемую культуру клеток MARC-145 (клон перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки МА-104), поддерживающую питательную среду Игла, содержащую 30 мМ Нереs буферного раствора с рН 7,6; 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и антибиотики: гентамицин -50 мкг/см3, амфотерицин - 2,5 мкг/см3.
Титрование вируса РРСС и приготовление рабочей дозы вируса. Вирус РРСС титровали на культуре клеток MARC-145, выращенной в лунках планшетов. Для этого предварительно в стерильных пенициллиновых фла-
конах готовили 10-кратные разведения ви-руссодержащего материала (от 10-1 до 10-7). Из каждой лунки планшета с выросшим монослоем удаляли по 0,1 см3 среды и вносили подготовленные разведения вируса, начиная с наивысшего, по 0,1 см3. Планшет закрывали крышкой, помещали в СО2-инкубатор с содержанием 5 % СО2 при температуре 37 °С и вели наблюдения с использованием инвертируемого микроскопа в течение 72-144 часов. Заключительный учет результатов титрования вируса проводили через 144 часа инкубирования при условии сохранения целостности монослоя клеток в контрольных лунках.
На основании результатов предварительного титрования готовили рабочие разведения вируса РРСС с целью определения оптимальной рабочей дозы вируса (100^ 300 ТЦД50).
Титрование сывороток крови свиней. Титрование референтных сывороток крови свиней проводили против доз вируса 100, 200, 300 ТЦД50 на 3 планшетах, то есть с каждой дозой вируса ставили РМН в отдельном планшете. Для этого во все лунки планшета вносили по 0,05 см3 среды, а затем, используя 12-канальную пипетку, вносили в лунки ряда А по 0,05 см3 референтной сыворотки крови свиней. Потом, без смены наконечников, перемешивали содержимое лунки и переносили по 0,05 см3 от ряда А до ряда Н, готовя тем самым серийные 2-кратные разведения сывороток крови свиней. На заключительном этапе приготовления разведений из последнего ряда удаляли по 0,05 см3.
Постановка реакции микронейтрализации. Методические рекомендации были составлены с учетом рекомендаций МЭБ по титрованию вируса РРСС с использованием микропланшетов (OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010) [6]. Общий объем всех компонентов при постановке реакции микронейтрализации составлял 0,15 см3/лунку.
Для постановки РМН отбирали планшеты с равномерно выросшим монослоем культуры клеток MARC-145. Из каждой лунки отбирали по 0,1 см3 культуральной среды и взамен этого вносили по 0,1 см3 смеси сы-
воротка-вирус из других планшетов, взятых после 1-часового контакта. Планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 72-144 часов.
Микроскопию монослоя клеток в лунках планшетов вели ежедневно в течение 67 дней, просматривая их под инвертируемым микроскопом, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или лунки с цельным неповрежденным монослоем клеток.
Результаты исследований и обсуждение
При данных исследованиях РМН ставили с использованием монослоя перевиваемой культуры клеток МАЯС-145, а не суспензии, так как в этом случае получали нечеткие результаты реакции (адгезивные свойства инфицированных клеток нарушались, поэтому не наблюдали формирования сплошного монослоя клеток во всех лунках микропланшетов).
Исследуя влияние различных посевных концентраций перевиваемой культуры клеток MARC-145 на скорость и качество формирования монослоя клеток, начиная с концентрации 0,05-0,10*105 кл/см3 и заканчивая 0,4-0,15*105 кл/см3, определили оптимальную посевную концентрацию, которая составляла 0,1-0,15*105 кл/см3. Клетки выращивали в лунках микропланшетов в СО2-инкубаторе с содержанием 5 % СО2 при температуре 37 °С. Через 48 часов инкубирования в лунках планшетов формировался однородный монослой клеток. Выращенный монослой клеток сохранял свою структуру в течение не менее 7 суток (срок наблюдения).
На этапе эксперимента при определении оптимальной рабочей дозы вируса, необходимой для постановки реакции микронейтрализации, получили следующие результаты (табл. 1).
Из данных таблицы 1 видно, что показатели титров антител мало зависели от взятой дозы вируса. При исследовании негативных сывороток крови свиней в РМН, при использовании рабочих доз вируса 100^300 ТЦД50, во всех случаях получали отрицательные результаты.
Однако наиболее оптимальной являлась рабочая доза вируса в пределах 200^ 300 ТЦД50. Подобные результаты были получены Шемельковым Е. В. в 1997 году [2], поэтому при дальнейших исследованиях РМН ставили против 200 ТЦД50 рабочих доз вируса.
Добавление во флаконы с рабочими дозами вируса в питательную среду серонега-тивной сыворотки крови свиней (20 %) позволяло усилить чувствительность реакции, что подтверждается исследованиями других авторов [6, 7]. Подготовленные разведения вируса вносили во все лунки, намеченные для данной дозы вируса, используя для этого 4-канальную пипетку. Объем вносимого вируса составлял 0,05 см3. Планшет накрывали крышкой, которую фиксировали с помощью скотча, и помещали на контакт на один час в СО2-инкубатор при температуре 37 °С.
На следующем этапе исследования реакцию микронейтрализации разрабатывали в 2-х вариантах: развернутом и точечном.
В результате проведенной работы выяснили, что при исследовании предположительно негативных сывороток крови свиней или при скрининге положительно реагирующих животных использование «4-точечного теста», где сыворотки проверяют только в 2-х разведениях: 1 : 2 и 1 : 4, позволяет за короткий срок исследовать большое количество проб сывороток крови свиней. При этом тесте на одном планшете можно исследовать 24 сыворотки крови свиней. В случае исследования предположительно позитивных сывороток
Таблица 1.
Результаты исследования референтных сывороток крови свиней в реакции микронейтрализации с различными дозами вируса
Сыворотки крови свиней Титры антител (1о£,) при различных дозах вируса
100 ТЦД50 200 ТЦД50 300 ТЦД50
Позитивные 5,25 5,5 5,5
Негативные <2,0 <2,0 <2,0
Таблица 3.
Результаты по исследованию сывороток крови животных, вакцинированных против РРСС, в различных серологических реакциях
Таблица 2.
Результаты исследований на специфичность в РМН сывороток крови различных животных на наличие антител против вируса РРСС
Сыворотки крови животных, вакцинированных против следующих инфекций Количество проб Вид животных Результат исследования в РМН (log2)
ИТР 13 КРС <1,0
ВД 11 КРС <1,0
БА 11 свиньи <1,0
ПВИС 11 свиньи <1,0
ТГЭС 12 кролик <1,0
КЧС 14 свиньи <1,0
Номера животных Результаты исследования в
РМН (log,) ИФА (IDEXX) США
1 4,5 0,57
2 5,0 0,93
3 6,5 1,9
4 6,0 1,0
5 6,5 0,9
6 <1,0 0,07
7 <1,0 0,07
8 <1,0 1,6
9 <1,0 0,02
10 <1,0 0,01
Примечание: РМН: > 1,0 - антитела обнаружены (результат положительный), < 1,0 - антитела не обнаружены (результат отрицательный); ИФА: > 0,4 - антитела обнаружены (результат положительный), < 0,3 - антитела не обнаружены (результат отрицательный).
крови от переболевших животных, а также для количественной оценки иммунитета против РРСС необходимо использовать развернутую постановку РМН, при которой на 1 планшете можно исследовать только 12 сывороток крови в 4-х разведениях или 6 сывороток крови свиней в 8 разведениях.
С целью оценки специфичности разработанной модификации реакции микронейтрализации исследовали сыворотки крови свиней и кроликов, вакцинированных против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ), вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД), болезни Ауески (БА), трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), парвовирусной инфекции свиней (ПВИС), классической чумы свиней (КЧС). Результаты проведенных исследований пред-
ставлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, в пробах сывороток крови, отобранных от животных, вакцинированных против выше обозначенных инфекций, в РМН антител к вирусу РРСС не выявлено.
С целью оценки сопоставимости двух методов результаты исследований, полученных в РМН, сравнивали с результатами, полученными в ИФА (табл. 3). Из данных таблицы 3 видно, что из 10 исследованных проб в РМН 5 проб оценены как положительные и 5 как отрицательные, в ИФА - 6 положительные и 4 отрицательные.
В дальнейшем сравнивали коэффициент корреляции, исходя из условных обозначений: «положительный» и «отрицательный» результат. Коэффициент корреляции оказался равен 0,81, что свидетельствовало о том,
что результаты, полученные в разработанной РМН и стандартном ИФА, сопоставимы между собой. Коэффициент корреляции, полученный при сравнении результатов исследования 300 сывороток крови свиней, отобранных от вакцинированных или больных РРСС животных, был меньше, чем в описанном выше опыте, так как в реакции нейтрализации наличие вируснейтрализу-ющих антител можно определить не ранее, чем через 1,5 месяца после внедрения вируса в организм [3, 7].
Впоследствии в РМН были исследованы 649 проб полевых сывороток крови свиней, в том числе вакцинированных против РРСС (в различные сроки после вакцинации) из 17 хозяйств Белгородской, Кировской, Московской, Смоленской, Тверской, Костромской и Нижегородской областей. Антитела против вируса РРСС были обнаружены в 150 образцах сывороток крови свиней в пределах от 1,0 до 5,0
Проведенное исследование подтвердило мнение большинства авторов, что вирусней-трализующие антитела образуются в крови свиней, вакцинированных против РРСС, не ранее чем через 36-90 дней после прививки [1, 2, 4, 5, 7].
Из литературных данных известно, что положительными на РРСС считаются разведения сывороток крови свиней начиная с разведения 1 : 2 и выше (> 1,0 ^2), а отрицательными - менее 1 : 2 (< 1,0 1о§2) [3]. Следовательно, титры вируснейтрализующих антител против вируса РРСС в значениях >1,0 1о§2 считают диагностически значимыми.
В РМН выявляют вируснейтрализующие антитела к вирусу РРСС у естественно инфицированных животных в невысоких титрах: 1 2-3 и > 4,0 В то же время принято считать, что животные являются защищенными от виремии при наличии в их сыворотках крови вируснейтрализующих антител в титрах не ниже 3,0 log2 [4].
Таким образом, при помощи РМН возможно проведение оценки напряженности иммунитета. Выявление вируснейтрализи-рующих антител в сыворотках крови вакцинированных против РРСС свиней с титрами, превышающими уровень 3,0 свидетель-
ствует о протективных свойствах исследуемых вакцин [3, 6].
Разработанные методические рекомендации позволяют одному исследователю в течение рабочего дня при помощи «точечного» варианта РМН исследовать на наличие антител к вирусу РРСС не менее 100 проб испытуемых сывороток крови свиней.
Заключение
1. В результате проведенных исследований были разработаны «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в реакции микронейтрализации».
2. Подобрана оптимальная посевная концентрация культуры клеток MARC-145, которая равна 0,1^0,15*103 кл/см3.
3. Рекомендована постановка РМН с рабочей дозой вируса с титром 200 ТЦД50.
4. Получены лучшие результаты при постановке РМН с использованием монослоя культуры клеток MARC-145, а не суспензии.
5. Для повышения чувствительности реакции микронейтрализации целесообразно добавление 20 % негативной к вирусу РРСС инактивированной сыворотки крови свиней к рабочей дозе вируса.
Список литературы
1. Гаврилова, В. Л. Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов : дис. ... канд. биол. Наук / Гаврилова В. Л.- Владимир, 2007. - С. 6, 29-35, 101-105.
2. Шемельков, Е. В. Влияние различных типов адъювантов на эффективность вакцин против инфекционных болезней свиней : дис. ... канд. вет. наук / Шемельков Е. В. - М., 2010. - С. 65.
3. Chung, W. B. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in intensive farrow-to-finish pig herds / W. B. Chung, M. W. Lin, W. F. Chang et al. // Can. J. Vet. Res. - 1997. - Vol. 61, № 4. -Р. 292-298.
4. Diaz, I. Different European-type vaccines against porcine reproductive and have different immunological properties and counter different protection to pigs / I. Diaz, L. Darwich, G. Pappaterra et al. // Virology. -2006. - Vol. 351. - Р. 249-250.
5. Lopez, O. J. Protection against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection through passive transfer of PRRSV-neutralizing antibodies is dose dependent / O. J. Lopez, M. F. Oliveira, E. A. Garcia et al. //
Clin. Vaccine Immunol. - 2007. - Vol. 14, № 3. -P. 269-275.
6. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. - Vol. 2. - 7nd ed. - Paris, 2010. - Chap. 2.8.7. - P. 1116-1127.
7. Yoon, I. J. A modified serum neutralization test for the detection of antibody to porcine reproductive syndrome virus in swine sera / I. J. Yoon, H. S. Joo, S. M. Goyai, T. W. Molitor // J. Vet. Diagn. Invest. -1994. - Vol. 6, № 3. - P. 289-292.
' ""ЗЩрЙГ"^
ТРЕТИЙ СЪЕЗД
ВЕТЕРИНАРНЫХ ФАРМАКОЛОГОВ И ТОКСИКОЛОГОВ РОССИИ Дата и место проведения: 8-10 июня 2011 г., Санкт-Петербург, бизнес-центр «Буржуа»
Условия участия
Для участия в работе съезда необходимо до 20 апреля 2011 года прислать в адрес оргкомитета заявку, оформленную по прилагаемой форме, и текст статьи для публикации в материалах съезда, объемом не более 3-х печатных листов. Документы принимаются в электронном виде с использованием компьютерной программы MicrosoftWord. Шрифт TimesNewRoman, кегль -12, через полтора интервала, без отступов, таблиц и рисунков. Поля со всех сторон листа по 2 см. Название файла - фамилия автора и название статьи. Название: полужирным, строчными буквами. Авторы: фамилия, инициалы. Место работы: название учреждения.
Сокращения допускаются по ходу изложения материала с однократной расшифровкой.
Если речь идет о лекарственном средстве, обязательно указывать его состав (для комплексных препаратов), дозы и схемы изложения материала с однократной дозой применения.
1) статья в отдельном файле;
2) заявка участника в отдельном файле.
оформление заявки участника
Фамилия
Имя
Отчество
Должность, ученое звание
Организация
Почтовый адрес (домашний)
Телефон сотовый (обязательно)
Факс
Название доклада/статьи
Форма участия (подчеркнуть) очная/заочная
Необходимо место проживания в 1. общежитии 2. гостинице отметить
Необходимые технические средства
организаторы съезда
Департамент научно-технологической политики и образования Министерства сельского хозяйства Российской Федерации Российская академия сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»
ГНУ «ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии»
ФГУ «ФЦРТБ» - ВНИВИ
«Росветкормсоюз»
ЗАО «АгроВетКонсалтинг»
оргкомитет съезда
E-mail: farm07@mail.ru. Тел. +7 812 387-11-58. Адрес: 196084, Санкт-Петербург,
ул. Черниговская, д. 5, ВГОУ ВПО «СПбГАВМ», кафедра фармакологии и токсикологии
Ответственный секретарь съезда: Попова Ольга Сергеевна
Компания «АгроВетКонсалтинг» рада сообщить, что она получила право быть одним из организаторов съезда! Приглашаем к сотрудничеству в рамках проведения Съезда коммерческие организации. Контактное лицо: Елена Егорова, тел. +7 495 742 95 45 / 742 84 83, elena@agrovetconsult.com
