CC BY
16
УДК 619:616.98:578.822.2-07
Ключевые слова: парвовирус типа I, крупный рогатый скот, ПЦР
Key words: parvovirus type I, cattle, pcR
Ефимова М. А., Гаффаров Х. З., Иванов А. В., Фаизов Т. Х., Хаммадов Н. И.
ВЫЯВЛЕНИЕ ПАРВОВИРУСА ТИПА I КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ПЦР
detection of parvovirus type i of cattle bypcr
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» Адрес: 420075, Россия, г. Казань, Научный городок-2. E-mail: vnivi@mail.ru
Federal center of Toxicological, Radiation and Biological Safety Address: 420075, russia, Kazan, Nauchny gorodok-2. E-mail: vnivi@mail.ru
Ефимова Марина Анатольевна, к. в. н., ст. научн. сотрудник лаборатории вирусологии
Efimova Marina A., Ph.D. in Veterinary Science, Senior Research Assistant of the Laboratory of Virology Гаффаров Харис Зарипович, д. в. н., проф., зав. лабораторией вирусологии Gaffarov Kharis Z., Doctor of veterinary Science, professor, Head of the Laboratory of virology Иванов Аркадий Ваисльевич, д. б. н., проф., чл.-кор. РАСХН, директор Ivanov arkadiy v., doctor of biology Science, professor, corresponding Member of the russian academy of agricultural Sciences Фаизов Тагир Хадеевич, д. в. н., проф., зав. лабораторией биохимии и молекулярно-генетического анализа faizov tagir h., doctor of veterinary Science, professor, head of the Laboratory of biochemistry and Molecular-genetic analysis Хаммадов Наиль Ильдарович, к. б. н., научн. сотрудник лаборатории биохимии и молекулярно-генетического анализа hammadov nail I., phd. in biology Science, research assistant of the Laboratory of biochemistry and Molecular-genetic analysis
Аннотация. Проведена индикация парвовируса типа I в образцах клинического и патологического материалов, полученных от животных из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным и респираторным инфекциям телят, а также по болезням репродуктивных органов маточного поголовья крупного рогатого скота. В результате методом NESTED-PCR из 12 образцов в 8 был обнаружен геном парвовируса типа I.
Summary. The indication of parvovirus type I was carried out in samples of clinical and pathological material from animals from farms affected by gastrointestinal and respiratory infections of calves, as well as by diseases of reproductive organs of breeding stock. As a result the genome of parvovirus type I was discovered in 8 samples out of 12 using the method of nested-pcr.
Введение
Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота характеризуется нарушением воспроизводительной функции у коров и поражением органов дыхания и пищеварения телят [4, 6]. Возбудителем являются представители семейства Parvoviridae, принадлежащие трем родам: парвовирус КРС 1 (ВРУ1) - род Bocavirus, парвовирус КРС 2 (ВРУ2) - род Dependovirus и парвовирус КРС 3 (ВРУ3) - род Erythrovirus (1). Геном парвовирусов представлен единой односпиральной линейной молекулой ДНК с молекулярной массой 1,5-2,2 МД, которая составляет 19-32 % массы вирионы. В структуре вириона обнаружено 4 полипептида с молекулярной массой 80, 72, 62
и 60кД, соответственно обозначенные как УР1, УР2, УР3 и УР4. Основная масса вири-онного белка (73-83 %) приходится на долю УР3 [2, 3]. Гены, кодирующие структурные белки, расположены в 5'-концевой половине, а ген, кодирующий неструктурный белок - в 3'-концевой половине ДНК [5]. Все известные штаммы парвовирусов крупного рогатого скота антигенно идентичны и отличаются от парвовирусов, изолированных от других видов животных.
Лабораторная диагностика парвовируса крупного рогатого скота, как и при других вирусных инфекциях, осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток, обнаружения антигена непосредственно в пробах исследуемого материала (кишечник, фека-
лии, абортированный материал) или обнаружения вирусспецифических антител. Однако применяемые в настоящее время для этой цели лабораторные методы трудоемки, длительны и недостаточно чувствительны.
С развитием молекулярной биологии открылись новые возможности для совершенствования методов диагностики инфекционных болезней. Одним из таких перспективных методов, основанных на изучении генетического материала вирусов, является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет проводить индикацию и идентификацию возбудителей с высокой точностью и чувствительностью.
В предыдущих исследованиях нами в различных регионах Приволжского Федерального округа установлен факт циркуляции парвовируса типа I среди обследованного поголовья животных. Серопозитивность их по различным регионам к парвовирусу варьировала от 16,6 % до 57,1 %. В дальнейшем для молекулярно-генетических исследований использовали клинический и патологический материал, полученный от животных из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным и респираторным инфекциям телят, а также по болезням репродуктивных органов маточного поголовья.
Целью настоящего исследования была индикация генома парвовируса и реовируса с помощью полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы
Для индикации парвовируса типа I исследованию подвергнуто 12 проб клинического и патологического материалов (смывы с носовой полости, сперма, кусочки селезенки, лимфатических узлов, легких, кишечника, органы абортированных плодов). Нуклеиновые кислоты выделяли из биологических образцов с использованием набора реагентов для выделения ДНК в соответствии с инструкцией к набору «Пробоподготовка универсальная».
Индикацию парвовируса типа I КРС проводили по схеме NESTED-PCR согласно методическим рекомендациям Кочеткова С. А. и др., (2009), используя праймеры: BPV1F1: 5/-CAAGCACATCCAATCAACAG-3/,
BPV1R1: 5/-GATCATTGTTGTAGACGGTCC-3/, BPV1F2: 5/-AATTGAACTGGCGACTCGGTCC-3/, BPV1R2: 5/-CCAGGTGTTGCCAGTCATTAGGA-3/.
Синтез олигонуклеотидных праймеров производился в ООО «Биотех-Индустрия» (г. Москва).
Амплификацию проводили на программируемом термоциклере «Терцик». Результаты ПЦР регистрировали методом электрофореза в 2 % агарозном геле с бромистым этидием. Гели анализировали под в ультрафиолетовым облучением (X = 254 нм).
Результаты исследований
В результате постановки nested-PCR пар-вовирус типа I КРС обнаружен в 8 пробах из 5 хозяйств (табл. 1, рис. 1).
В результате амплификации со специфичной ДНК-матрицей парвовируса типа I накапливается ПЦР-продукт молекулярной массой 305 пар нуклеиновых оснований (п. о.). Образец №13 содержал в качестве ДНК-матрицы нуклеиновые кислоты нативного парвовируса (положительный контроль). После амплификации и электрофореза в треке, соответствующем положительному контролю (в результате воздействия ультрафиолета на гель, окрашенный бромистым этидием), видна полоса молекулярной массой 305 п. о. Все треки, имеющие подобную полосу (№№ 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10), являются положительными.
Следует отметить, что в сыворотке крови одного теленка выявлялись антигемагглюти-нины к антигену парвовируса в титре 1 : 320,
М 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14
■
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации парвовируса. Обозначения: М - ДНК Маркер; 1-12 - испытуемые пробы; 13 - парвовирус типа I (положительный контроль); 14 - реовирус типа I (отрицательный контроль).
Таблица 1.
Индикация генома парвовируса и реовируса типа I
№ образца Регион, из которого доставлен материал Материал для исследований Результат ПЦР к геному
парвовируса I рео-вируса
1 Арский р-н РТ органы от абортированного плода № 1 + -
2 Атнинский р-н РТ органы от теленка 10-дневного возраста - -
3 Новоторъяльский р-н Марий Эл органы от теленка 7-дневного возраста, титр антител в сыворотке крови к парвовирусу I - 1 : 320 + -
4 Новоторъяльский р-н Марий Эл 1-й пассаж суспензии органов на первичной ПЭК + -
5 Параньгинский р-н Марий Эл органы от теленка 10-20-дневного возраста + -
6 Тетюшский р-н РТ 3-й пассаж суспензии органов на МДВК + -
7 Рыбнослободский район РТ органы от 3-месячного теленка + -
8 Тетюшский р-н РТ органы от теленка 10-дневного возраста - +
9 Арский р-н РТ жидкость грудной полости от абортированного плода № 2 на 6-7 месяце стельности от нетели + -
10 Кирово-Чепецкий р-н Кировская обл. смыв из носовой полости теленка месячного возраста + -
11 Балтасинский р-н РТ 5-й пассаж образца спермы на к. кл. МДВК - -
12 Балтасинский р-н РТ органы от теленка 20-дневного возраста - -
13 Парвовирус типа I нативный вирус + -
14 Реовирус типа I нативный вирус - +
у которого впоследствии в образцах органов методом ПЦР был обнаружен геном парво-вируса типа I (рис.1, трек №№ 3, 4).
Заключение
Полученные нами на предварительном этапе исследований данные о серопозитив-
ности крупного рогатого скота в отношении парвовируса типа I, а также результаты индикации генома вируса методом ПЦР в материале, полученном от больных и подозрительных по заболеванию животных, дает нам основание утверждать, что парвовирусная инфекция имеет определенное распростра-
нение среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья.
Для дальнейшей идентификации обнаруженных нами изолятов и выяснения их таксономического положения требуется секве-нирование ампликонов, полученных нами в ПЦР на данном этапе исследований. Изыскания в этом направлении будут продолжены.
Список литературы
1. Кочетков, С. А. Методические рекомендации по выявлению генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции / С. А. Кочетков, Л. Б. Чупин, В. А. Прохватилова, В. В. Мищенко. - Владимир, 2009. - С. 10.
2. Орлянкин, Б. Г. Парвовирусные инфекции и их влияние на продуктивность животных / Б. Г. Орлянкин, В. А. Сергеев, С. П. Качанова // ВНИИТЭИСХ, М., 1985. - С. 33-35.
3. Самуйленко, А. Я. Инфекционная патология животных: В 2 т. / А. Я. Самуйленко, Б. В. Соловьева, Е. А. Непоклонова, Е. С. Воронина. - М. : ИКЦ Академкнига, 2006. - 1911 с.
4. Sandals, W. C. D. Prevalence and seroepidemiology of bovine parvovirus / W. C. D. Sandals // MSc Thesis, University of Guelph, 1989. - P. 432-437.
5. Siegle, G. Characteristics and taxonomy of Parvoviridae / G. Siegle, R. C. Bates, K. I. Berns // J. Intervirology. - 1985. - V. 23. - № 2. - Р. 61-73.
6. Storz, J. Parvovirus infection in calves / J. Storz, R. C. Bates // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 1973. -V. 163. - Р. 884-886.
как оформить подписку на журнал?
А. Через подписные каталоги
= Каталог подписное агентство Индекс —
= Пресса России Агентство «Книга-Сервис» 29447 Е
= Газеты. Журналы Агентство «Роспечать» 33184 Е
Б. Через редакцию журнала
Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету
для юридических лиц:
НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии» ИНН 7802196720 КПП 781301001 Р/с 40703810400000000022 в ЗАО АКБ «Горбанк», г. Санкт-Петербург К/с 30101810200000000814 БИК 044030814
В поле «Назначение платежа» указать: «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы ветеринарной биологии» на 2014 г. согласно инф. письму б/н от 20.12.13 г. НДС не облагается. Адрес доставки: ...»
Стоимость редакционной подписки на 2014 год (четыре номера): 1600 рублей.
учредитель и издатель: НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии». Адрес: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru
